基于BDNF/TrkB/CREB通路研究六味地黃丸對丙戊酸鈉誘導的孤獨癥譜系障礙模型仔鼠的作用機制

〔摘要〕 目的 基于腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）/酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B， TrkB）/cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein， CREB）通路，探討六味地黃丸對丙戊酸鈉（sodium valproate， VPA）誘導的孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）仔鼠的作用機制。方法 將13只SD孕鼠隨機分為兩組，其中10只孕鼠在第12.5天時腹腔注射VPA溶液（600 mg·kg-1）為VPA組，另外3只孕鼠注射等體積生理鹽水為對照組。第21天對兩組雄性仔鼠開展行為學檢測，篩選出符合ASD疾病模型的仔鼠30只，隨機分為模型組（等體積生理鹽水），維生素D組（1 480 IU·kg-1），六味地黃丸高（3 g·kg-1）、中（1.5 g·kg-1）、低（0.75 g·kg-1）劑量組，每組6只。正常雄性仔鼠6只，設為空白組（等體積生理鹽水）。各組仔鼠連續灌胃14 d，1次/d，給藥后再次開展行為學檢測。尼氏染色觀察各組仔鼠海馬組織神經元形態學變化，比色法檢測各組仔鼠海馬組織中谷氨酸（glutamic acid， GLU）、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid， GABA）含量；qRT-PCR檢測各組仔鼠海馬組織中BDNF、TrkB、CREB mRNA相對表達。結果 與對照組比較，VPA組仔鼠體質量、身長、尾長更小（P＜0.05）。與空白組比較，模型組社交障礙癥狀明顯（Plt;0.01），焦慮障礙癥狀明顯（Plt;0.01），重復刻板行為增多（Plt;0.05 或Plt;0.01），海馬神經元結構損傷，GLU升高（Plt;0.01）、GABA下降（Plt;0.01），BDNF、TrkB、CREB mRNA表達降低（Plt;0.05或Plt;0.01）；與模型組比較，維生素D組及六味地黃丸中、低劑量組仔鼠社交能力增強（Plt;0.05或Plt;0.01），焦慮障礙減輕（Plt;0.05或Plt;0.01），重復刻板行為減少（Plt;0.01或Plt;0.05），海馬神經元結構明顯復原，GLU下降（Plt;0.01），BDNF、TrkB、CREB mRNA表達增加（Plt;0.05或Plt;0.01），六味地黃丸中、低劑量組GABA上升（Plt;0.05或Plt;0.01）。結論 六味地黃丸能顯著改善VPA誘導的ASD仔鼠行為表現，增強海馬組織神經元的再生與修復，其機制可能與平衡GLU、GABA水平，上調仔鼠海馬組織中BDNF/TrkB/CREB的表達有關。

〔關鍵詞〕 六味地黃丸；孤獨癥譜系障礙；腦源性神經營養因子；酪氨酸激酶受體B；cAMP反應元件結合蛋白；谷氨酸；γ-氨基丁酸

〔中圖分類號〕R272.6 " " " " 〔文獻標志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.002

Mechanism of action of Liuwei Dihuang Pill on sodium valproate-induced neonatal rat model of autism spectrum disorder based on BDNF/TrkB/CREB pathway

WU Ji1， HAO Xingyu1， YE Yong1， WANG Ziyu1， ZHU Qinquan2， ZHANG Di2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Hospital of Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of action of Liuwei Dihuang Pill （LWDHP） on the neonatal rats with autism spectrum disorder （ASD） induced by sodium valproate （VPA） based on the brain-derived neurotrophic factor （BDNF）/tyrosine kinase receptor B （TrkB）/cAMP response element binding protein （CREB） pathway. Methods Thirteen SD pregnant rats were randomly divided into two groups， with 10 pregnant rats receiving intraperitoneal injection of VPA solution （600 mg·kg-1） on the day 12.5th as the VPA group， and the other 3 pregnant rats receiving injection of equal volume of normal saline as the control group. Behavioral tests were carried out on the male neonatal rats of two groups on the 21th day， then 30 male neonatal rats conforming to the ASD disease model were selected and randomized into model group （equal volume of normal saline）， vitamin D group （1 480 IU·kg-1）， as well as high- （3 g·kg-1）， medium- （1.5 g·kg-1）， and low-dose （0.75 g·kg-1） LWDHP groups， with six rats in each group. And six normal male neonatal rats were set as blank group （equal volume of normal saline）. The neonatal rats in each group were given the corresponding medicine by gavage once a day， for continual 14 days， and behavioral tests were carried out again after administration. The morphological changes of hippocampal neurons in neonatal rats of each group were observed using Nissl staining; the content of glutamic acid （GLU） and gamma-aminobutyric acid （GABA） in the hippocampal tissue was measured by colorimetry; the mRNA relative expressions of BDNF， TrkB， and CREB in the hippocampal tissue were determined by qRT-PCR. Results Compared with the control group， the VPA group had smaller body weight， body length， and tail length （Plt;0.05）. Compared with the blank group， the model group showed significant symptoms of social disorders （Plt;0.01）， anxiety disorders （Plt;0.01）， and increased repetitive stereotyped behaviors （Plt;0.05 or Plt;0.01）， structural damage of hippocampal neurons， increased GLU content （Plt;0.01）， decreased GABA content （Plt;0.01）， as well as reduced mRNA expressions of BDNF， TrkB， and CREB （Plt;0.05 or Plt;0.01）. Compared with model group， the social ability of neonatal rats in vitamin D group and medium- and low-dose LWDHP groups was enhanced （Plt;0.05 or Plt;0.01）， anxiety disorder was alleviated （Plt;0.05 or Plt;0.01）， repetitive and stereotyped behaviors were reduced （Plt;0.01 or Plt;0.05）， the structures of hippocampal neurons were significantly restored， GLU content was decreased （Plt;0.01）， and the mRNA expressions of BDNF， TrkB， and CREB were higher （Plt;0.05 or Plt;0.01）. Additionally， GABA content was elevated in medium- and low-dose LWDHP groups （Plt;0.05 or Plt;0.01）. Conclusion LWDHP can significantly improve the behavioral outcome of VPA-induced ASD neonatal rats， and enhance the regeneration and repair of hippocampal neurons. The mechanism may be related to the balance of GLU and GABA levels as well as up-regulation of BDNF/TrkB/CREB expression in the hippocampal tissue.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Liuwei Dihuang Pill; autism spectrum disorder; brain-derived neurotrophic factor; tyrosine kinase receptor B; cAMP response element binding protein; glutamic acid; gamma-aminobutyric acid

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）是兒童最常見的早期神經發育障礙性疾病之一，主要表現為社交障礙、行為重復刻板及興趣狹隘[1]。本病全球發病率為1%～2%，男女比例為4∶1[2]。ASD可伴隨多種神經行為紊亂，如語言與運動障礙、應激性和攻擊性[3]。ASD的特征性表現使患兒在學校、生活和未來工作等多個方面面臨挑戰[4]。ASD發病率不斷上升，目前已成為一個世界性的難題。

腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）是細胞內信號通路轉導分子，需要結合酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B， TrkB），通過激活cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）進一步促進各種細胞內信號通路激活[5]。

維生素D能調節神經遞質和神經營養因子[6]，也在神經元增殖和突觸可塑性中發揮作用[7]。據報道，ASD患者的維生素D水平較低[8]。缺乏維生素D會使大腦暴露于神經炎癥，外源性補充維生素D具有改善神經毒性、炎癥和DNA損傷的作用[9]。維生素D能調節谷氨酸（glutamic acid， GLU）、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid， GABA），并改變與ASD發病機制相關的免疫功能[10]。

六味地黃丸主治腎怯失音、囟開不合、神不足[11]。后世醫家多用原方化裁，治療先天不足、肝腎虧虛所致的多種兒科疾病[12]。現代研究表明，BDNF/TrkB/CREB信號通路參與ASD的生理病理過程[13]。因此，本研究提出六味地黃丸可能通過影響BDNF/TrkB/CREB信號通路，從而改善ASD臨床癥狀的假說，從行為學、神經病理學、分子免疫學等多方面驗證假說，為防治ASD提供科學依據。

1 材料

1.1 "實驗動物

健康成年SPF級SD孕鼠13只，（365±35） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2019-0004；飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心。本實驗通過湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會批準，實驗動物倫理號：ZYFY 20210813-24。

1.2 "藥物及主要試劑

丙戊酸鈉（sodium valproate， VPA）粉劑（美國Sigma公司，批號：P4543）；六味地黃丸（九芝堂股份有限公司，國藥準字：Z43020145，規格：200丸/瓶，批號：202112110）；維生素D滴劑（青島雙鯨藥業股份有限公司，國藥準字：H20113033，規格：400 IU×36粒，批號：2110271）。甲苯胺藍染液、RIPA裂解液均購自武漢皮諾飛生物科技有限公司，批號分別為SH-2348、P0005；二甲苯、無水乙醇、戊巴比妥鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為10023418、100092683、BCP07810；4%多聚甲醛（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：BL539A）；BSA標準蛋白、磷酸化蛋白酶抑制劑均購自塞維爾生物科技有限公司，批號分別為G2026、G2007；GABA比色法測試盒、GLU比色法測試盒均購自伊萊瑞特生物科技有限公司，批號分別為E-BC-K852-N、E-BC-K118-N；總RNA提取試劑（Trizol法）、qRT-PCR專用預混液均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，批號分別為Q712-02、R223-01。

1.3 "主要儀器

三箱社交行為箱、曠場實驗箱、Labmaze V3.0動物行為軌跡分析系統（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，型號：ZS-SXJ-II、ZS-KC、1056000-2）；脫水機、包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JJ-12J、JB-P5）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；高速冷凍離心機（北京大龍興創實驗儀器有限公司，型號：D3024R）；電熱恒溫水槽（精宏科技有限公司，型號：DK-8B）；高速組織研磨儀、渦旋混合器（塞維爾生物科技有限公司，型號：KZ-II、MX-F）；酶標檢測儀（美國Biotek公司，型號：Epoch）；PCR梯度基因擴增儀（美國Scilogex公司，型號：SCI1000-G）。

2 方法

2.1 "動物分組、造模及給藥

將13只孕鼠分為VPA組（10只）和對照組（3只），VPA組按600 mg/kg劑量單次腹腔注射250 mg/mL VPA溶液（配制方法：1 g VPA粉劑+4 mL生理鹽水）[14]，對照組注射等體積生理鹽水。兩組孕鼠所生仔鼠仍分別記為VPA組和對照組。分別在仔鼠第7、14、21天測體質量、身長、尾長評估生長發育。在雄性仔鼠第21天時，通過行為學進行模型評價。以仔鼠表現出社交能力障礙或社交新穎性障礙為造模成功標準[15]。篩選符合ASD疾病模型的雄性仔鼠30只，隨機分為模型組，六味地黃丸高、中、低劑量組，維生素D組，每組6只。對照組篩選出6只雄性仔鼠，為空白組。上述分組方法均采用隨機數字表法。根據人與大鼠體表面積換算，A=K×W2/3×10-4，其中A為體表面積，以m2計算；W為體質量，以g計算；K為常數，隨動物種類而不同，大鼠系數為9.1。計算出實驗給藥劑量：六味地黃丸低、中、高劑量分別為0.75、1.5、3 g·kg-1；將丸劑溶于1 mL生理鹽水中配制成混懸液灌胃；維生素D組為1 480 IU·kg-1；模型組和空白組每日給予同體積生理鹽水。每組連續灌胃2周。給藥結束后，再次開展行為學檢測。

2.2 "三箱社交實驗

用于評估仔鼠的社交行為。實驗階段如下[16]：（1）適應階段。將待測仔鼠放入行為箱中央室，開放兩側小門，充分適應環境10 min。（2）社交能力檢測。仔鼠重新放至中央室，關閉兩側小門，并在一個束縛器中隨機放入一只同種、同性別、同年齡段的陌生鼠1，另一個束縛器則保持空置，隨后打開小門，記錄其自由活動10 min時間內的社交行為。（3）社交新穎性檢測。社交能力測試結束后，將仔鼠重新放至中央室，關閉小門，陌生鼠1在束縛器中不變，空置的束縛器中放入一只陌生的同種、同性別、同年齡段的陌生鼠2，再次打開小門，記錄其自由活動10 min時間內的社交行為。

2.3 "曠場實驗

用于評估仔鼠自發活動、探索行為和焦慮狀態。將仔鼠放入曠場箱的正中心，充分自由探索10 min；隨后用攝像頭記錄其15 min內在曠場箱中自由活動的數據。

2.4 "彈珠埋藏實驗

挖掘和埋藏是鼠的一種典型行為，由THOMAS等[17]提出，將其作為衡量重復性或強迫性行為的測試，并可對ASD大鼠模型中的重復性刻板行為進行量化。實驗時，將干燥清潔的玉米芯墊料倒入干凈飼養籠中，深度約為5 cm，將直徑約為2 cm的彩色玻璃彈珠輕放在墊料上，等距離分成5排，每排4顆。記錄仔鼠在30 min內掩埋彈珠的情況。

2.5 "尼氏染色觀察仔鼠海馬病理形態變化

用3%戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射深度麻醉。打開胸腹腔，在心尖處扎入留置針，刺破右心耳，阻斷腹主動脈，持續快速灌注生理鹽水，直至右心耳流出液體清亮透明、肝臟泛白。然后，改為4%多聚甲醛灌注，速度由快到慢，持續數小時后分離腦組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h，獲取海馬，制成蠟塊并切片。石蠟切片依次經二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，自來水洗，甲苯胺藍染色2～5 min，鏡檢，自來水清洗，烤干再入染液染色2～5 min，水洗，0.1%冰醋酸分化，自來水洗終止反應，鏡檢，水洗，烤干，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片后，觀察海馬形態學變化。

2.6 "比色法觀察仔鼠海馬GLU、GABA、GLU/GABA變化

2.6.1 "GLU測定 "組織塊用冷PBS洗滌3次，剪成小塊置于勻漿管中。加入RIPA裂解液徹底勻漿。冰浴30 min，每隔5分鐘震蕩1次。12 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），收集上清液，即為總蛋白溶液。按說明書配制工作液，反應結束后在酶標儀340 nm波長下測OD值。

2.6.2 "GABA測定 "按照組織質量∶試劑一=1∶9的比例混勻，勻漿后移至EP管中，95 ℃水浴2 h。8 000×g離心10 min，取上清液。按說明書配制工作液，反應結束后，酶標儀于640 nm波長處測OD值。

2.7 "qRT-PCR檢測大鼠海馬組織中BDNF、TrkB、CREB mRNA表達

取海馬組織50 mg液氮研磨后，提取總RNA，加樣，目的基因及內參分別平行對照上樣3個孔。500 r/min離心30 s（離心半徑10 cm），后將其置于96孔PCR反應板中，啟動PCR擴增儀進行擴增循環。PCR反應條件為50 ℃反轉錄15 min；95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，40個循環。以β-actin為內參，最終各目的基因相對表達量以2-ΔΔCt值為準。PCR引物由武漢市皮諾飛生物科技有限公司合成。詳見表1。

2.8 nbsp;統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。若數據符合正態分布，計量資料采用“ｘ±s”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，不服從正態分布的數據使用M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 "VPA對SD仔鼠生長發育的影響

第7、14、21天分別測量兩組體質量、身長及尾長情況，與對照組相比，VPA組仔鼠體質量、身長、尾長更小（P＜0.05）。詳見圖1。

3.2 "六味地黃丸對ASD仔鼠社交行為的影響

在社交能力測試階段，與空白組比較，模型組仔鼠接觸陌生鼠1的時間更短（P＜0.01）。詳見圖2A。給藥后，與模型組比較，維生素D組，六味地黃丸中、低劑量組仔鼠與陌生鼠1接觸時間更長（P＜0.05或P＜0.01），且六味地黃丸低劑量組在陌生鼠1室時間增加（P＜0.01），六味地黃丸高劑量組社交時間差異無統計學意義（P＞0.05）。在社交新穎性測試階段，與空白組比較，模型組仔鼠接觸陌生鼠2的時間更短（P＜0.01）。詳見圖2B。給藥后，與模型組比較，六味地黃丸中、低劑量組與陌生鼠2接觸時間增加（P＜0.01）。其他各室累計時間，各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2—3。

3.3 "六味地黃丸對ASD仔鼠曠場箱中焦慮狀態的影響

與空白組比較，模型組仔鼠在曠場箱中總路程更短（P＜0.01），運動速度更慢（P＜0.01），在中央區域運動距離、探索次數、停留時間均更少（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，維生素D組，六味地黃丸中、低劑量組在曠場箱中總路程增加，運動速度更快，在中央區域探索次數更多（P＜0.05或P＜0.01）。六味地黃丸中、低劑量組在中央區域運動距離、停留時間更長（P＜0.01）。詳見表4。

3.4 "六味地黃丸對ASD仔鼠重復刻板動作的影響

與空白組比較，模型組埋珠數目較多（P＜0.01）。與模型組比較，六味地黃丸中、低劑量組埋珠數目較少（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表5。

3.5 "六味地黃丸對ASD仔鼠海馬組織神經元形態的影響

與空白組比較，模型組腦組織結構中度異常，可見神經元細胞數量減少，部分神經元變性，部分神經元細胞核固縮，胞質內的尼氏小體明顯減少，部分神經元可見纖維纏結。與模型組比較，維生素D組及六味地黃丸中劑量組腦組織結構輕度異常；六味地黃丸低劑量組腦組織結構基本正常，神經元數量增加，神經元少量變性，尼氏小體數量增多。詳見圖3。

3.6 "六味地黃丸對ASD仔鼠海馬組織GLU、GABA、GLU/GABA表達的影響

與空白組比較，模型組仔鼠海馬組織中GLU升高、GABA下降、GLU/GABA比值升高（P＜0.01）。與模型組比較，維生素D組，六味地黃丸中、低劑量組GLU降低（P＜0.01），GLU/GABA比值下降（P＜0.05或P＜0.01），六味地黃丸中、低劑量組GABA升高（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表6。

3.7 "六味地黃丸對ASD仔鼠BDNF、TrkB、CREB mRNA相對表達的影響

與空白組比較，模型組仔鼠海馬中BDNF、TrkB、CREB mRNA表達降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，維生素D組，六味地黃丸中、低劑量組BDNF、TrkB、CREB mRNA表達升高（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表7。

4 討論

ASD是基因與環境相互作用的結果，其影響神經發育相關基因的表達，影響突觸的形成、修剪以及神經環路的連接等神經可塑性過程，最終可能導致ASD樣行為[7]。妊娠期和圍產期是神經系統發育易受影響的關鍵時期[18]。一方面，這與大腦早期發育的高度復雜、特異性有關[19]；另一方面，與屏障缺乏或功能不完全有關。母體脂溶性維生素（A、D、E）、色氨酸、與單碳代謝相關的營養素（膽堿、葉酸）[20]，有助于后代中亞穩態表觀性等位基因的甲基化，這種甲基化在分化組織中也持續存在[21]。

VPA誘導的ASD模型鼠具有與人類ASD行為、神經病理學、細胞和免疫相似的表型，是目前比較成熟的ASD動物模型[22]。孕鼠腹腔注射VPA后，其子代在三箱社交檢測等行為學實驗中，表現出社交行為減少和社交行為潛伏期增加，埋珠、理毛等重復刻板動作增加。同時，還表現出與ASD相關的某些感覺、情緒和認知障礙[23]。

維生素D是人體必需營養素之一，是類固醇樣物質集合的總稱。研究發現，維生素D在大腦發育中起著至關重要的作用，包括促進神經元分化、增殖和細胞凋亡，調節突觸可塑性和多巴胺能系統，減少氧化應激等[24]。流行病學調查發現，ASD在空氣污染較嚴重的城市和高海拔地區患病率更高。空氣污染、多云天氣、季節性因素、出生順序、妊娠糖尿病、先兆子癇、剖宮產等導致ASD的因素，均與維生素D缺乏有關[25]。維生素D狀態與ASD核心癥狀密切相關[26]。同時，也有研究證實，補充外源性維生素D能發揮預防和治療ASD的作用[27-28]。

中醫學無ASD病名，但根據患兒的表現，可歸于“童昏”“清狂”“無慧”等范疇。中醫學認為，ASD的主要病因為先天不足，病機為肝腎虧虛、腦髓不充。腎藏精，主生長發育，若小兒先天稟賦不足，肝腎虧虛，精血無以充養形體，則導致生長發育遲緩，可表現為智力低下、言語不清或身材矮小、動作發育落后等；陰虛無以制陽，相火上擾心神，可見情緒急躁難自控、任性偏執等；腎主骨生髓，腎精充盛則腦髓充盈，若小兒腎精虧虛，無以化髓充腦，神明失用，元神不得滋養，則表現出精神活動異常。張滌教授認為，兒童ASD病機多為先天不足、肝腎虧虛，臨床應用六味地黃丸加減治療，能夠有效改善患兒核心癥狀和/或飲食障礙、排便障礙、睡眠障礙等伴隨癥狀。

六味地黃丸出自《小兒藥證直訣》。方中重用熟地黃，填精益髓。臣以山茱萸補肝腎，并能澀精；山藥脾腎雙補。君臣相佐，“三陰并補”。但熟地黃用量獨重，以滋補腎精為主。凡補腎精之法，必當瀉其“濁”，方可存其清，而使陰精得補。且腎為水火之宅，腎虛則水泛，陰虛而火動。故佐澤瀉利濕泄濁，并防熟地黃滋膩；牡丹皮清泄相火，并制山茱萸溫澀；茯苓健脾滲濕，補脾而助運。此三藥即為“三瀉”。全方補瀉兼施，滋補腎精而降相火。兒科臨床上多用于治療小兒腎腦疾病。六味地黃丸可通過影響中樞神經遞質，改善大鼠運動、學習功能[29]。代謝組學技術證實，其入血成分中的丹皮酚原苷、莫諾苷等代謝產物，能調節氨基酸代謝、核苷酸代謝和甾體激素類生物合成[29]。單胺類神經遞質是中樞神經系統的重要遞質，主要功能為參與學習與記憶、情緒、精神活動以及內分泌活動等[30]。六味地黃丸可能通過調節大鼠腦中單胺類神經遞質含量而改善大鼠運動功能、感覺障礙[31]，或者通過提高腦內膽堿乙酰轉移酶活性，增加乙酰膽堿含量，影響中樞神經膽堿能系統，從而改善小鼠學習記憶能力[32]。本研究顯示，六味地黃丸早期干預可不同程度改善仔鼠ASD樣行為。六味地黃丸高劑量組療效不顯著，推測可能與藥物濃度過高，產生藥物毒性有關。

ASD患者不同大腦區域的神經解剖學變化，特別是額葉皮質、海馬和小腦，與其行為異常有關[33]。ELNAHAS等[34]證實，VPA產前暴露引起的ASD樣行為，與神經生物學異常相關。在神經管關閉時，暴露于VPA的雄鼠表現出與ASD患者大腦異常相似的病理改變，包括小腦神經元的丟失和錐體細胞樹突分枝的改變，提示修剪受損[35]。本研究發現，VPA導致仔鼠神經元損傷，從而表現出ASD樣行為學表型。初步證實六味地黃丸可促進ASD仔鼠海馬組織損傷神經元的修復，增加尼氏小體數量，恢復神經細胞合成蛋白質的功能。

ASD的病因涉及許多腦系統，尤其與GABA、血清素能、GLU系統有關，且興奮性（excitability， E）GLU和抑制性（inhibitory， I）GABA傳遞的平衡被打破，在ASD發病中起關鍵作用。研究發現E/I升高會引起信息處理和社會行為功能障礙的深度損害[36]。基于此，臨床中運用GABA激動劑，通過抑制突觸前GABA能神經元來治療ASD[37]。本研究發現，ASD仔鼠海馬中GLU升高，GABA下降，E/I比值升高。六味地黃丸能降低GLU，升高GABA，降低E/I比值。說明VPA誘導的ASD樣行為表型，可能與E/I失衡有關，而六味地黃丸能使E/I平衡恢復而改善ASD樣行為表型。

BDNF及其受體TrkB在哺乳動物的大腦，尤其是海馬和皮質中廣泛表達，能刺激細胞內信號轉導，對神經元的存活、形態發生和可塑性至關重要[38]。作為主要的轉錄因子，CREB調控與突觸、神經元存活相關的基因，在神經保護和神經可塑性中發揮重要的作用。CREB轉錄級聯失調可促進氧化應激和細胞凋亡[39]。本研究發現，ASD仔鼠BDNF、TrkB、CREB

mRNA表達下降，六味地黃丸能上調其表達，說明VPA誘導的ASD樣行為表型，可能與BDNF/TrkB/CREB通路下調有關，而六味地黃丸能上調該通路表達而改善ASD樣行為表型。

綜上所述，ASD發病機制可能與E/I失衡、BDNF/TrkB/CREB信號通路下調有關。六味地黃丸能顯著改善經VPA誘導仔鼠的ASD樣行為表型，增強海馬神經元的再生與修復，其機制可能與平衡GLU與GABA水平、上調BDNF/TrkB/CREB信號通路有關。六味地黃丸高劑量組改善作用不顯著，可能與藥物濃度過高有關。

參考文獻

[1] ASSOCIATION A P. Diagnostic and statistical manual of mental disorders[M]. New York： American Psychiatric Association， 2013.

[2] BAXTER A J， BRUGHA T S， ERSKINE H E， et al. The epidemiology and global burden of autism spectrum disorders[J]. Psychological Medicine， 2015， 45（3）： 601-613.

[3] MASI A， DEMAYO M M， GLOZIER N， et al. An overview of autism spectrum disorder， heterogeneity and treatment options[J]. Neuroscience Bulletin， 2017， 33（2）： 183-193.

[4] 鄒 "卓， 劉 "蕓， 黃浩宇， 等. 兒童孤獨癥譜系障礙流行現狀和家庭干預的研究及策略[J]. 中國全科醫學， 2020， 23（8）： 900-907.

[5] IBRAHIM A M， CHAUHAN L， BHARDWAJ A， et al. Brain-derived neurotropic factor in neurodegenerative disorders[J]. Biom？鄄

edicines， 2022， 10（5）： 1143.

[6] SIRACUSANO M， RICCIONI A， ABATE R， et al. Vitamin D deficiency and autism spectrum disorder[J]. Current Pharmaceutical Design， 2020， 26（21）： 2460-2474.

[7] PRINCIPI N， ESPOSITO S. Vitamin D deficiency during pregnancy and autism spectrum disorders development[J]. Frontiers in Psychiatry， 2020， 10： 987.

[8] CANNELL J J， GRANT W B. What is the role of vitamin D in autism？[J]. Dermato-endocrinology， 2013， 5（1）： 199-204.

[9] ALFAWAZ H A， BHAT R S， AL-AYADHI L， et al. Protective and restorative potency of Vitamin D on persistent biochemical autistic features induced in propionic acid-intoxicated rat pups[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine， 2014， 14： 416.

[10] "D， et al. Vitamin D， neurosteroids and autism[J]. Physiological Research， 2017， 66（Suppl 3）： S333-S340.

[11] 錢 "乙. 小兒藥證直訣[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2018： 39.

[12] 盧紅蓉. 錢乙“腎主虛， 無實也”觀與六味地黃丸[J]. 中華中醫藥雜志， 2012， 27（10）： 2512-2513.

[13] LEE Y J， HAN P L. Early-life stress in D2 heterozygous mice promotes autistic-like behaviors through the downregulation of the BDNF-TrkB pathway in the dorsal Striatum[J]. Experimental Neurobiology， 2019， 28（3）： 337-351.

[14] SCHNEIDER T， TURCZAK J， PRZEW？覵OCKI R. Environmental enrichment reverses behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid： Issues for a therapeutic approach in autism[J]. Neuropsychopharmacology， 2006， 31（1）： 36-46.

[15] 李 "燊， 吳海濤. 孤獨癥譜系障礙實驗動物模型研究進展[J]. 中國藥理學與毒理學雜志， 2020， 34（2）： 133-141.

[16] 王劍飛， 韓俊海， 張子超. 孤獨癥譜系障礙小鼠模型行為學檢測方法[J]. 遺傳， 2021， 43（5）： 501-519.

[17] THOMAS A， BURANT A， BUI N， et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety[J]. Psychopharmacology， 2009， 204（2）： 361-373.

[18] PELCH K E， BOLDEN A L， KWIATKOWSKI C F. Environmental chemicals and autism： A scoping review of the human and a？鄄nimal research[J]. Environmental Health Perspectives， 2019， 127（4）： 46001.

[19] EMBERTI GIALLORETI L， MAZZONE L， BENVENUTO A， et al. Risk and protective environmental factors associated with autism spectrum disorder： Evidence-based principles and re？鄄commendations[J]. Journal of Clinical Medicine， 2019， 8（2）： 217.

[20] HOMBERG J R， KYZAR E J， SCATTONI M L， et al. Genetic and environmental modulation of neurodevelopmental disorders： Translational insights from labs to beds[J]. Brain Research Bu？鄄lletin， 2016， 125： 79-91.

[21] DOMINGUEZ-SALAS P， MOORE S E， BAKER M S， et al. Maternal nutrition at conception modulates DNA methylation of human metastable epialleles[J]. Nature Communications， 2014， 5： 3746.

[22] CHRISTENSEN J， GR？覫NBORG T K， S？覫RENSEN M J， et al. Prenatal valproate exposure and risk of autism spectrum disorders and childhood autism[J]. JAMA， 2013， 309（16）： 1696-1703.

[23] FONTES-DUTRA M， DELLA-FLORA NUNES G， SANTOS-TERRA J， et al. Abnormal empathy-like pro-social behaviour in the valproic acid model of autism spectrum disorder[J]. Behavioural Brain Research， 2019， 364： 11-18.

[24] KARRAS S N， WAGNER C L， CASTRACANE V D. Understanding vitamin D metabolism in pregnancy： From physiology to pathophysiology and clinical outcomes[J]. Metabolism： Clinical and Experimental， 2018， 86： 112-123.

[25] ALZGHOUL L. Role of vitamin D in autism spectrum disorder[J]. Current Pharmaceutical Design， 2019， 25（41）： 4357-4367.

[26] QI X J， YANG T， CHEN J， et al. Vitamin D status is prima？鄄rily associated with core symptoms in children with autism spectrum disorder： A multicenter study in China[J]. Psychiatry Research， 2022， 317： 114807.

[27] FENG J Y， SHAN L， DU L， et al. Clinical improvement fo？鄄llowing vitamin D3 supplementation in Autism Spectrum Disorder[J]. Nutritional Neuroscience， 2017， 20（5）： 284-290.

[28] SAAD K， ABDEL-RAHMAN A A， ELSEROGY Y M， et al. Vitamin D status in autism spectrum disorders and the efficacy of vitamin D supplementation in autistic children[J]. Nutritional Neuroscience， 2016， 19（8）： 346-351.

[29] 李秋菊， 王 "萍， 王美佳， 等. 基于中醫方證代謝組學技術的六味地黃丸干預腦癱大鼠模型研究[J]. 世界科學技術： 中醫藥現代化， 2016， 18（10）： 1684-1696.

[30] LOULA R， MONTEIRO L H A. Monoamine neurotransmitters and mood swings： A dynamical systems approach[J]. Mathematical Biosciences and Engineering， 2022， 19（4）： 4075-4083.

[31] 高長玉， 姜志梅， 李博文， 等. 六味地黃丸對腦癱模型大鼠腦組織單胺類神經遞質影響的實驗研究[J]. 中醫藥信息， 2017， 34（3）： 55-57.

[32] 崔 "勇， 王艷杰， 趙丹玉， 等. 六味地黃丸對APP/PS1小鼠學習記憶能力及膽堿能系統的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2016， 22（3）： 148-151.

[33] MORIMOTO M， HASHIMOTO T， TSUDA Y， et al. Assessment of oxidative stress in autism spectrum disorder using reactive oxygen metabolites and biological antioxidant potential[J]. PLoS One， 2020， 15（5）： e0233550.

[34] ELNAHAS E M， ABUELEZZ S A， MOHAMAD M I， et al. Validation of prenatal versus postnatal valproic acid rat models of autism： A behavioral and neurobiological study[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology amp; Biological Psychiatry， 2021， 108： 110185.

[35] MARKRAM K， RINALDI T， LA MENDOLA D， et al. Abnormal fear conditioning and amygdala processing in an animal model of autism[J]. Neuropsychopharmacology， 2008， 33（4）： 901-912.

[36] MAROTTA R， RISOLEO M C， MESSINA G， et al. The neurochemistry of autism[J]. Brain Sciences， 2020， 10（3）： 163.

[37] DAI Y， ZHANG L L， YU J H， et al. Improved symptoms fo？鄄llowing bumetanide treatment in children aged 3-6 years with autism spectrum disorder： A randomized， double-blind， placebo-controlled trial[J]. Science Bulletin， 2021， 66（15）： 1591-1598.

[38] 楊恩璐， 孫秉貴. BDNF及其下游通路與GABA能神經元發育相關性的研究進展[J]. 生命科學， 2020， 32（6）： 544-550.

[39] AMIDFAR M， DE OLIVEIRA J， KUCHARSKA E， et al. The role of CREB and BDNF in neurobiology and treatment of Alzheimer's disease[J]. Life Sciences， 2020， 257： 118020.