基于網絡藥理學結合動物實驗探究六味地黃丸治療孤獨癥譜系障礙的作用機制

〔摘要〕 目的 采用網絡藥理學、分子對接技術結合動物實驗探究六味地黃丸治療孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）的潛在作用機制。方法 通過TCMSP數據庫獲取六味地黃丸的有效活性成分及對應的靶基因信息，通過GeneCards、OMIM、DrugBank數據庫獲取ASD疾病靶基因；將上述靶基因用韋恩圖取交集后再用STRING數據庫構建關鍵靶點PPI網絡；用Metascape數據庫對關鍵靶點進行GO功能和KEGG信號通路富集分析；用Autodock軟件對核心靶點及六味地黃丸有效成分進行分子對接。動物實驗驗證：選用8只SPF級SD孕鼠，隨機分為空白孕鼠組（1只）及模型孕鼠組（7只），采用腹腔注射丙戊酸鈉（valproate，VPA）造模。篩選符合ASD疾病模型的30只雄性仔鼠，隨機分為模型對照組，維生素D組和中藥高、中、低劑量組；同樣篩選出空白仔鼠，為空白組，每組6只。中藥低、中、高劑量組分別予六味地黃丸懸浮液0.75、1.5、3 g/kg灌胃；維生素D組予維生素D滴劑1 480 IU/kg灌胃；模型組、空白組予等量生理鹽水灌胃。均干預1次/d，連續干預2周。采用三箱社交實驗、曠場實驗評估大鼠社交情況；ELISA檢測各組仔鼠海馬體糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、β-連環蛋白（β-Catenin）水平；Western blot檢測各組仔鼠海馬體中β-Catenin、髓細胞增生原癌基因（cellular myelocytomatosis oncogene，c-Myc）、細胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1， Cyclin D1）蛋白表達水平。結果 從六味地黃丸中篩選共得到74個活性成分及205個藥物靶基因，3 903個ASD疾病靶基因，127個關鍵靶點及蛋白激酶B α（protein kinase B α，Akt1）、白細胞介素-6（interleukin- 6，IL-6）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、腫瘤壞死因（tumor necrosis factor，TNF）等核心靶點。GO功能富集顯示主要作用于有機氮原化合物的細胞反應、突觸后膜、突觸后神經遞質受體活動等，KEGG通路富集顯示調控TNF、核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）、Wnt等信號通路。分子對接結果顯示，六味地黃丸中的有效成分可與核心蛋白Akt1結構穩定。動物實驗結果顯示，在社交能力測試階段，模型組、維生素D組及中藥低、中、高劑量組仔鼠接觸陌生鼠1的時間均短于空白組（Plt;0.05）；給藥2周后，維生素D組及中藥低、中、高劑量組接觸陌生鼠1的時間延長（Plt;0.05）。在社交新穎性測試階段，模型組、維生素D組和中藥低、中、高劑量組仔鼠接觸陌生鼠2的時間短于較空白組（Plt;0.05）；給藥2周后，維生素D組及中藥低、中、高劑量組接觸陌生鼠2的時間延長（Plt;0.05）。礦場實驗結果提示，治療后，中藥低、中劑量組活動總路程及中央區域活動路程均增加（Plt;0.05），維生素D組、中藥高劑量組活動總路程增加（Plt;0.05）。與模型組比較，維生素D組及中藥低、中、高劑量組GSK-3β水平升高（Plt;0.05），β-Catenin水平降低（Plt;0.05），β-Catenin、c-Myc蛋白表達減少（Plt;0.05）；中藥低劑量組Cyclin D1蛋白表達減少（Plt;0.05）。結論 六味地黃丸可有效調控Wnt信號通路，改善VPA誘導的ASD仔鼠社交行為、焦慮狀態。

〔關鍵詞〕 網絡藥理學；分子對接；六味地黃丸；孤獨癥譜系障礙；Wnt信號通路

〔中圖分類號〕R272 " " " " 〔文獻標志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.003

Mechanism of action of Liuwei Dihuang Pill in treating autism spectrum disorder based on network pharmacology and animal experiments

YE Yong1， WU Ji2， ZHAO Fan2， ZHU Qinquan2， ZHANG Di2*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the potential mechanism of action of Liuwei Dihuang Pill （LWDHP） in treating autism spectrum disorder （ASD） using network pharmacology， molecular docking technology， and animal experiments. Methods The active ingredients and corresponding target gene information of LWDHP were obtained through the TCMSP database， and ASD disease target genes were obtained through the databases of GeneCards， OMIM， and DrugBank; the above target genes were intersected with Venn diagram， and then the STRING database was used to construct the PPI network of the key targets; GO and KEGG enrichment analyses of the key targets was performed using the Metascape database. The Autodock software was used for molecular docking of the core targets and active ingredients of LWDHP. Animal experimental verification： Eight SPF SD pregnant rats were randomized into blank pregnant rat group （n=1） and model pregnant rat group （n=7） which was modeled by intraperitoneal injection of sodium valproate （VPA）. Thirty neonatal male rats conforming to the ASD disease model were selected and randomly subdivided into model group， vitamin D group， high-， medium-， and low-dose LWDHP groups， meanwhile， the neonatal rats from blank pregnant rat group were selected as blank group， with six rats in each group. Low-， medium-， and high-dose LWDHP groups were given 0.75， 1.5， and 3 g/kg LWDHP suspension， respectively， vitamin D group 1 480 IU/kg vitamin D drops， and model and blank groups an equal amount of normal saline， once a day by gavage， continuously intervened for two weeks. Then， three-box social test and open field test were conducted to evaluate the social behaviors of rats. ELISA was used to determine the levels of glycogen synthase kinase 3β （GSK3β） and β-catenin in the hippocampus of the neonatal rats in each group; Western blot was used to examine the protein expression levels of β-catenin， cellular myelocytomatosis oncogene （c-Myc）， and cell cycle protein D1 （Cyclin D1） in the hippocampus. Results A total of 74 active ingredients and 208 drug target genes of LWDHP were obtained， as well as 3，903 ASD disease target genes and 127 key targets including core targets of protein kinase B α （Akt1）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1 （IL-1）， and tumor necrosis factor （TNF）， etc.; GO function enrichment showed that LWDHP mainly acted on cellular responses of organic nitrogen-containing compounds， postsynaptic membranes， and postsynaptic neurotransmitter receptor activity， and others; KEGG pathway enrichment showed that it regulated signaling pathways of TNF， nuclear transcription factor-κB （NF-κB）， Wnt， and others; the molecular docking showed that the active ingredients in LWDHP could be structurally stable with the core protein Akt1. Animal experiments showed that in the test of social ability， compared with blank group， the neonatal rats in model group， vitamin D group， and low-， medium-， and high-dose LWDHP groups had shorter contact time with unfamiliar rat Ⅰ （Plt;0.05）; after 2 weeks of administration， the contact time with unfamiliar rat Ⅰ of the neonatal rats in vitamin D group and low-， medium-， and high-dose LWDHP groups was prolonged （Plt;0.05）. In the test of social novelty， the neonatal rats in model group， vitamin D group， and low-， medium-， and high-dose LWDHP groups had shorter contact time with unfamiliar rat Ⅱ compared with those in blank group （Plt;0.05）; after 2 weeks of administration， the contact time with unfamiliar rat Ⅱ of the neonatal rats in vitamin D group and low-， medium-， and high-dose LWDHP groups was prolonged （Plt;0.05）. The open field test showed that after treatment， both the total activity distance and activity distance in the central area of the neonatal rats in low- and medium-dose LWDHP groups increased （Plt;0.05）， and the total activity distance of the neonatal rats in vitamin D and high-dose LWDHP groups increased （Plt;0.05）. Compared with model group， vitamin D group and low-， medium-， and high-dose LWDHP groups showed higher GSK-3β level （Plt;0.05）， lower β-Catenin level （Plt;0.05）， and reduced protein expressions of β-Catenin and c-Myc （Plt;0.05）; the protein expression of Cyclin D1 in low-dose LWDHP group decreased （Plt;0.05）. Conclusion LWDHP can effectively regulate the Wnt signaling pathway， and improve the social behaviors and reduce anxiety of rats with VPA-induced ASD.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 network pharmacology; molecular docking; Liuwei Dihuang Pill; autism spectrum disorder; Wnt signaling pathway

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是兒童最常見的發生于發育早期的腦發育障礙性疾病之一，主要表現為社交障礙、行為重復刻板及興趣狹隘等[1]。兒童ASD發病率為1.5%～2%，其中男性約是女性的4倍；近年來，兒童ASD的患病率呈逐年上升趨勢，確診年齡越來越小[2-3]。ASD大多患兒成年后不具備獨立生活、學習和工作能力，給家庭和社會帶來沉重負擔[4]。ASD病因非常復雜，近幾十年來，盡管研究者致力于ASD病因學研究，對ASD的認識也越來越多，但其病因學機制尚未完全明確[5-7]。目前，尚無針對ASD核心癥狀的特效藥物，ASD臨床表現及其常見并發癥有高度異質性[8]，故ASD的藥物治療極具挑戰性。而中醫藥在治療ASD上具有獨特的優勢。張滌教授認為ASD多因先天不足、肝腎陰虛所致，且在臨床中肝腎陰虛證為最常見的證型，多選用六味地黃丸加減治療。因此，本研究采用網絡藥理學和分子對接技術探究六味地黃丸治療ASD的機制并加以實驗驗證，為ASD的靶向治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 "六味地黃丸有效化學成分及作用靶點篩選

采用TCMSP數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），篩選六味地黃丸中熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓的活性成分，并檢索活性成分的對應靶蛋白。限定檢索條件為口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%、類藥性（drug likeness， DL）≥0.18。再運用UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org/）將六味地黃丸各藥物活性成分的靶蛋白逐一輸入UniProt KB進行檢索，限定物種為“Human”，限定檢索結果為“已驗證”，選擇“Reviewed”，最終得到對應的靶基因信息。

1.2 "ASD相關靶點篩選

在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數據庫（http：//www.omim.org）、DrugBank數據庫（https：//www.drugbank.ca/），以“autism spectrum disorder”為關鍵詞，分別搜索并篩選與ASD相關的所有靶點，刪去重復靶點，得到ASD的相關靶基因。

1.3 "關鍵靶點網絡構建

利用韋恩圖取六味地黃丸和ASD的靶基因交集，即六味地黃丸治療ASD的關鍵靶點。利用STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/）建立關鍵靶點PPI網絡，得到六味地黃丸干預ASD的核心靶點。

1.4 "富集分析

將關鍵靶點運用Metascape數據庫（https：//metascape.org/）進行GO功能和KEGG信號通路富集分析，限定物種為“Homo sapiens”，分別選擇生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）及KEGG進行富集分析，設置條件P＜0.05。

1.5 "六味地黃丸活性成分與核心靶點分子對接

通過對六味地黃丸各藥物Degree值排名靠前的活性成分與核心靶點進行分子對接。運用ChewDraw Ultra下載六味地黃丸藥物活性成分的結構圖，以“cdx”格式保存后再用Chew3D Ultra軟件最小能量化“Minimize Energy”，以“pdb”格式保存；運用PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）下載六味地黃丸干預ASD的核心靶點的3D結構圖，以“pdb”格式保存；將二者導入Autodock軟件去水、加氫、加電荷、定義原子類型等，進行分子對接。最后，運用PyMol軟件將對接結果進行可視化分析。

1.6 "實驗驗證

1.6.1 "實驗動物 "選取健康成年SPF級SD孕鼠8只（體質量330～400 g），購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCKX（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心。飼養系統內環境溫度恒定在22～24 ℃，相對濕度恒定在50%～60%，保證每日周期性光照12 h。

1.6.2 "主要藥物及試劑 "六味地黃丸懸浮液，藥物制備過程如下：取100 g六味地黃丸（九芝堂股份有限公司，批號：202211111）藥丸研磨成粉，溶解于100 mL生理鹽水制備成1 g/mL的懸浮液。丙戊酸鈉（valproate， VPA）粉劑[默克化工技術（上海）有限公司，批號：P4543]；維生素D滴劑（青島雙鯨藥業股份有限公司，批號：2110271）；戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：BCP07810）；β-連環蛋白（β-Catenin）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）ELISA檢測試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號分別為：YD-34641、CK-EN30804）；BCA蛋白試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、磷酸化蛋白酶抑制劑、甘氨酸、髓細胞增生原癌基因（c-Myc）抗體、細胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1， Cyclin D1）抗體（皮諾飛生物科技有限公司，批號分別為：P0009、PN0033、P0005、P0007、P0098、67447-1-IG、60186-1-IG）；磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測試劑盒、山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗鼠IgG（H+L）（塞維爾生物科技有限公司，批號分別為：G2007、G2026、G1213、G1214）；蛋白酶抑制劑（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P1030）；吐溫20（北京索萊寶科技有限公司，批號：#T8220）；ECL化學發光底物（伯樂生命醫學產品有限公司，批號：170-5060）；蛋白Marker（寶日醫生物技術有限公司，批號：3585A）。

1.6.3 "主要儀器 "三箱社交行為箱、曠場實驗箱、Labmaze3.0動物行為軌跡分析系統（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，型號分別為：ZS-SXJ-II、ZS-KC、1056000-2）；臥式冷凍箱（長虹美菱股份有限公司，型號：BCD-318AT）；電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：ME203E/02]；臺式高速冷凍離心機（北京大龍興創實驗儀器有限公司，型號：D3024R）；全自動洗板機（雷杜生命科技有限公司，型號：RT-3100C）；渦旋混合器、磁力攪拌器（塞維爾生物科技有限公司，型號分別為：MX-F、MS-150）；精密pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：PHS-3C）；暗匣（廣東粵華醫療器械廠有限公司，型號：AX-Ⅱ）。

1.6.4 "動物造模 "在8只SPF級SD孕鼠（孕13 d）中隨機抽取1只為空白孕鼠組，余7只為模型孕鼠組，模型孕鼠組參照Schneider[9]方法，按600 mg/kg劑量單次腹腔注射250 mg/mL VPA溶液（1 g VPA+4 mL生理鹽水溶液），空白孕鼠組注射等體積生理鹽水。模型孕鼠組和空白孕鼠組所生仔鼠分別記為模型仔鼠和空白仔鼠。孕鼠以普通飼料喂養，孕鼠按1只/籠待產直至哺乳期，仔鼠按14～16只/籠的喂養密度進行哺乳。在三箱社交實驗的社交能力測試階段，接觸陌生鼠1的時間短于接觸物體的時間判定為社交能力缺陷；在社交新穎性測試階段，接觸陌生鼠2的時間短于陌生鼠1的時間判定為社交新穎性障礙。以仔鼠表現社交能力缺陷或者社交新穎性障礙判定為造模成功[10]。

1.6.5 "模型評價 "（1）三箱社交實驗[11]用于評估仔鼠社交行為。用配備攝像頭的自動跟蹤系統記錄被測試仔鼠在三箱內停留的時間及運動軌跡；用LabMaze分析軟件統計仔鼠的社交信息。適應階段：將實驗仔鼠放入行為箱的中央室，打開左右擋板的小門使其自由活動10 min，充分熟悉環境。社交能力檢測：將仔鼠重新放至中央室，關閉左右擋板的小門，并在左右兩室的束縛器中隨機放入一只同種相似年齡段的仔鼠（陌生鼠1），另一個保持空置，打開左右擋板的小門使其自由活動10 min并記錄。社交新穎性檢測：將仔鼠重新放至中央室，關閉左右擋板的小門，取出陌生鼠1再次隨機放入到任一束縛器中，然后在另一束縛器中放入另一只同種相似年齡段的仔鼠（陌生鼠2），打開左右擋板的小門使其自由活動10 min并記錄。（2）曠場實驗[11]用于評估仔鼠自發活動、探索行為和焦慮狀態。使用配備攝像頭的自動跟蹤系統記錄15 min內仔鼠移動距離和移動持續時間，利用LabMaze系統統計和分析不同的觀察指標；行為箱整體為50 cm×50 cm×50 cm敞口的正方體。適應階段：實驗時將仔鼠背朝實驗人員放入行為箱的正中心，讓其自由探索10 min；優先統計在行為箱中仔鼠15 min內活動的總路程。在計算機的LabMaze軟件上根據人為劃分的中央區（中央直徑約12 cm的正方形）和周邊區（正方形以外的其他區域），統計仔鼠在中央區運動的距離以及在中央區所待的時間及穿越中央格子的次數。

以上2個實驗中的每個階段前均用75%乙醇清洗行為箱；實驗結束將仔鼠放回飼養籠，清洗行為箱并統計實驗數據。

1.6.6 "動物分組 "模型仔鼠21 d斷乳，剔除雌性仔鼠，將雄性仔鼠通過行為學（三箱社交實驗、曠場實驗）進行模型評價。篩選符合ASD疾病模型的雄性仔鼠30只，記為ASD組，并隨機分為模型組，維生素D組，中藥高、中、低劑量組，每組6只。空白仔鼠同樣經過行為學檢測篩選出6只雄性仔鼠，記為空白組。

1.6.7 "動物給藥與干預 "首先根據兒童與成人之間體表面積換算公式計算給藥，然后按照成人與動物之間的藥物換算公式計算給藥[12]；中藥低、中、高劑量組分別予六味地黃丸懸浮液0.75、1.5、3 g/kg灌胃；維生素D組予維生素D滴劑1 480 IU/kg灌胃；模型組、空白組予等量生理鹽水灌胃。各組仔鼠干預1次/d，連續干預2周。干預結束后再次開展行為學實驗（三箱社交實驗、曠場實驗）。

1.6.8 "實驗取材 "行為學檢測結束后，用3%戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射深度麻醉。用75%乙醇消毒頭部后從頸部斷離頭部，剪開頭皮、顱骨，取出大腦，置于盛有冰的無菌小器皿上，取出海馬組織，-80 ℃保存，備用。

1.6.9 "GSK3β、β-Catenin水平檢測 "取海馬組織勻漿，按照GSK3β、β-Catenin的ELISA試劑盒說明書進行檢測。處理完成后在450 nm波長下，酶標儀測定吸光度，根據標準品的濃度標準曲線，然后根據標準曲線計算各樣本濃度。

1.6.10 "β-Catenin、c-Myc、Cyclin D1蛋白表達水平 "檢測 "取海馬組織加入蛋白提取試劑，冰浴徹底勻漿后轉移至離心管中，移液器反復吹打，確保勻漿液完全裂解。4 ℃ 12 000 r/min（離心半徑8 cm）離心15 min，收集上清液，即為總蛋白溶液。每個樣品加入蛋白上樣緩沖液，渦旋混勻，98 ℃加熱10 min，至樣本呈水樣后離心，渦旋混勻，離心后點樣；將各組蛋白樣品在凝膠中電泳，PVDF轉膜；取出膜于5%脫脂奶粉，脫色搖床上振蕩封閉1 h；加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，用TBST清洗5次，每次5 min；加入二抗（1∶300），孵育1 h。用TBST清洗5次，每次5 min；滴加新鮮配制的ECL混合溶液，發光檢測，根據不同的光強度調整曝光條件，顯影、定影。

1.7 "統計學方法

采用GraphPad Prism 9.5進行數據分析。計量資料均使用“ｘ±s”表示，數據符合正態分布且符合方差齊性檢驗采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。以Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 "六味地黃丸藥物活性成分及靶點篩選

共得到山茱萸、山藥、茯苓、熟地黃、澤瀉、牡丹皮活性成分74個，其中山茱萸20個、山藥16個、茯苓15個、熟地黃2個、澤瀉10個、牡丹皮11個。檢索山茱萸、山藥、茯苓、熟地黃、澤瀉、牡丹皮活性成分對應的靶蛋白。運用UniProt數據庫，將檢索到的靶蛋白逐一轉化為對應的靶基因，合并后刪去重復值，最終得到靶基因205個。詳見表1。

2.2 "ASD疾病相關靶點篩選

分別獲得ASD疾病相關靶點3 729個、655個、55個，合并以上檢索結果并刪去重復值，共得到ASD疾病相關靶點3 903個。

2.3 "六味地黃丸干預ASD的核心靶點篩選

構建六味地黃丸活性成分與ASD關鍵靶點的PPI網絡圖，其含有節點127個，邊1 716條，平均節點度值為27。六味地黃丸干預ASD可能通過蛋白激酶B α（protein kinase B α，Akt1）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、IL-1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等核心靶點起作用。詳見圖1。

2.4 "關鍵靶點的富集分析結果

對127個關鍵靶點進行生物學功能注釋分析，得到與ASD關聯度較高的富集分析結果。BP主要富集在有機氮原化合物的細胞反應、對異種生物刺激的反應、對有機環化合物的細胞反應、對氧氣水平下降的反應、膜電位的調節等。CC主要富集在突觸后膜、膜筏、樹狀體膜、神經元細胞體、血漿膜蛋白復合物等。MF涉及突觸后神經遞質受體活動、G蛋白聯胺受體活性、DNA轉錄因子結合、蛋白質同聚反應、乙酰膽堿受體活性。詳見圖2。KEGG富集到30條相關通路，通過氣泡圖顯示相關性較高的信號通路，除去不相關通路，主要涉及TNF、核因子κB（nuclear transcription factor-κB， NF-κB）、Wnt等信號通路。詳見圖3。

2.5 "六味地黃丸活性成分與靶點分子對接驗證

分子對接結果顯示，MOL005 531（遠華蟾蜍精）及MOL000359（豆甾醇）與核心蛋白Akt1結合構象穩定，分別在LYS-17、GLU-85、ARG-86、THR-87及THR-21處形成氫鍵，2者結合能分別為-7.74、-6.55 kcal/mol。運用 PyMol軟件對上述分子對接結果進行可視化分析，并以文字形式在對接空間圖中對相應對接的氨基酸殘基進行標識。詳見圖4。

2.6 "各組仔鼠三箱社交實驗結果

2.6.1 "社交能力測試 " 與治療前比較，維生素D組和中藥低、中、高劑量組治療后與陌生鼠1（左）的社交時間均增加（Plt;0.05）。與空白組比較，模型組，維生素D組和中藥低、中、高劑量組治療前、治療后與陌生鼠1（左）的社交時間均降低（Plt;0.05）。治療后，與模型組比較，維生素D組和中藥低、中、高劑量組與陌生鼠1（左）的社交時間均增加（Plt;0.05）；與維生素D組比較，中藥低、中劑量組與陌生鼠1（左）的社交時間均增加（Plt;0.05）；與中藥低、中劑量組比較，中藥高劑量組與陌生鼠1（左）的社交時間降低（Plt;0.05）。詳見圖5、表2。

2.6.2 "社交新穎性測試 "與治療前比較，維生素D組和中藥低、中、高劑量組治療后與陌生鼠2（右）的社交時間均升高（Plt;0.05）。與空白組比較，模型組，維生素D組和中藥低、中、高劑量組治療前、治療后與陌生鼠2（右）的社交時間均降低（Plt;0.05）。治療后，與模型組比較，維生素D組和中藥低、中、高劑量組與陌生鼠2（右）的社交時間均升高（Plt;0.05）；與維生素D組比較，中藥低、中劑量組與陌生鼠2（右）的社交時間均升高（Plt;0.05）；與中藥低、中劑量組比較，中藥高劑量組與陌生鼠2（右）的社交時間降低（Plt;0.05）。詳見圖6、表3。

2.7 "曠場實驗結果

2.7.1 "各組仔鼠活動總路程比較 "與治療前比較，維生素D組和中藥低、中、高劑量組治療后總路程升高（Plt;0.05）。與空白組比較，模型組，維生素D組和中藥低、中、高劑量組治療前、治療后總路程均降低（Plt;0.05）。治療后，與模型組比較，維生素D組和中藥低、中、高劑量組總路程均升高（Plt;0.05）；與維生素D組比較，中藥低、中劑量組總路程均升高（Plt;0.05）；與中藥低、中劑量組比較，中藥高劑量組總路程降低（Plt;0.05）。詳見圖7、表4。

2.7.2 "各組仔鼠在中央區域活動路程比較 "與治療前比較，治療后中藥低、中劑量組治療后中央區域活動路程升高（Plt;0.05）。與空白組比較，模型組、維生素D組和中藥低、中、高劑量組治療前、治療后中央區域活動路程均降低（Plt;0.05）。治療后，與模型組、維生素D組比較，中藥低、中劑量組中央區域活動路程均升高（Plt;0.05）；與中藥低、中劑量組比較，中藥高劑量組中央區域活動路程降低（Plt;0.05）。詳見表5。

2.8 "各組仔鼠GSK3β、β-Catenin水平比較

與空白組比較，模型組GSK3β水平降低（Plt;0.05）、β-Catenin水平升高（Plt;0.05）；與模型組比較，維生素D組和中藥低、中、高劑量組GSK3β水平升高（Plt;0.05）、β-Catenin水平降低（Plt;0.05）；與維生素D組比較，中藥低劑量組GSK3β水平升高（Plt;0.05），中藥低、中劑量組β-Catenin水平降低（Plt;0.05）；與中藥低、中劑量組比較，中藥高劑量組GSK3β水平降低（Plt;0.05）、β-Catenin水平升高（Plt;0.05）。詳見表6。

2.9 "各組仔鼠β-Catenin、c-Myc、Cyclin D1蛋白表達水平比較

與空白組比較，模型組、維生素D組和中藥高劑量組β-Catenin蛋白表達水平升高（Plt;0.05）；模型組c-Myc蛋白表達水平升高（Plt;0.05），維生素D組c-Myc蛋白表達水平降低（Plt;0.05）；模型組，維生素D組和中藥中、高劑量組Cyclin D1蛋白表達水平升高（Plt;0.05）。與模型組比較，維生素D組和中藥低、中、高劑量組β-Catenin、c-Myc蛋白表達水平降低（Plt;0.05），中藥低劑量組Cyclin D1蛋白表達水平降低（Plt;0.05）。與維生素D組比較，中藥低、中劑量組β-Catenin蛋白表達水平降低（Plt;0.05），中藥低、中、高劑量組c-Myc蛋白表達水平升高（Plt;0.05）。與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組β-Catenin蛋白表達水平升高（Plt;0.05）。詳見圖8。

3 討論

ASD已成為一個世界性的難題，深入研究其病因及可能的發病機制，為其提供精確有效的個體化治療，對改善患兒的生長發育、提高生活質量、減輕家庭和社會的精神壓力和經濟負擔以及提高人口素質具有重要意義。張滌教授認為ASD多因先天不足、肝腎陰虛所致，且發現肝腎陰虛證是臨床中為最常見的證型。目前，國內研究多采用VPA誘導ASD發病，VPA模型在所有模型中最為成熟、整體吻合度最高，不但具有ASD典型臨床表現，而且符合中醫先天不足、腎精虧損的特點[13]。故本研究采用VPA誘導ASD模型，予六味地黃丸干預治療。

六味地黃丸出自宋代錢乙的《小兒藥證直訣》[14]。六味地黃丸中以熟地黃為君藥；山茱萸、山藥為臣藥；三藥相配，滋養肝、脾、腎，以滋腎陰為主，為“三補”。澤瀉利濕泄濁，防熟地黃之滋膩戀邪；牡丹皮清泄相火，制山茱萸之溫澀；茯苓淡滲脾濕，助山藥之健運；三藥相配為“三瀉”。“三補”“三瀉”共奏補益肝腎之效。方中重用熟地黃，研究表明，熟地黃對中樞神經系統具有抑制作用，其分離所得到的梓醇可通過抗氧化作用保護海馬CA1區神經元而減少認知障礙[15]。此外，熟地黃提取物可以上調p-GSK3β蛋白表達，與本研究中六味地黃丸可以上調GSK3β蛋白表達相符[16]。

研究表明，ASD主要與遺傳因素、突觸功能、突觸結構和穩態、突觸信號通路、神經遞質系統及神經元發育等相關[17]。神經病理學研究表明，ASD患者的樹突棘密度增加且形態異常[18-19]，其中突觸后密度蛋白-95與樹突棘形成和突觸傳遞密切相關[20]。Ca2+通道功能缺陷可導致ASD，與ASD相關的突觸突變通常會使電壓依賴性Ca2+通道門控變得敏感。越來越多的研究表明，ASD與神經遞質谷氨酸、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyrate，GABA）、血清素、多巴胺等紊亂相關[17]。ASD兒童的血漿GABA和谷氨酸水平發生變化，其GABA水平顯著升高，而谷氨酸/GABA比例降低[17]。諸上說明ASD與突觸后膜、膜電位的調節及神經遞質相關，與本研究中六味地黃丸干預ASD的GO功能分析相符。

本研究KEGG通路富集分析結果顯示，六味地黃丸可能通過調節TNF、NF-κB、Wnt等信號通路干預ASD。其中Wnt信號通路對大腦發育、神經功能發育及突觸功能至關重要[21]。在幾種Wnt信號相關基因敲除小鼠模型中，分子、電生理和行為異常與ASD表型一致，Wnt信號通路中的許多關鍵蛋白都位于突觸，并在突觸生長和成熟中發揮關鍵作用[17]。另外，Wnt信號通路中的DISC1基因可能與漢族ASD兒童相關，如rs4658939等[22]。染色體結構域解旋酶DNA結合蛋白8（chromodomain-helicase-DNA binding protein 8，CHD8）通過直接與β-Catenin結合或被招募到β-Catenin蛋白響應基因的啟動子區域來參與經典Wnt信號通路[17]。GSK3β是一種在大腦中大量存在的激酶，可促進神經元凋亡，該激酶的失調會對神經發育產生破壞性影響；GSK3β的調節在Wnt信號通路的激活中發揮核心作用，β-Catenin作為Wnt信號通路的關鍵分子，可以激活Wnt信號通路下游的重要蛋白分子c-Myc及Cyclin D1，從而導致ASD的發生發展[23]。

本研究發現，ASD模型仔鼠在社交能力測試階段較空白組接觸陌生鼠1的時間短，說明ASD模型仔鼠具有明顯社交能力的缺陷。在社交新穎性測試階段，接觸陌生鼠2的時間較空白組短，說明ASD仔鼠存在社交新穎性偏好障礙。在曠場實驗中，ASD模型仔鼠活動總路程及在中央區域活動路程少于空白組，說明ASD模型仔鼠具有明顯的焦慮狀態。經過治療后ASD模型仔鼠接觸陌生鼠1及接觸陌生鼠2的時間延長，活動總路程及中央區域活動路程均增加，提示六味地黃丸可以改善VPA誘導的ASD仔鼠的社交行為及焦慮狀態。另外，ELISA結果表明，六味地黃丸可以提高GSK3β水平，降低β-Catenin水平，中藥低、中劑量組較維生素D組及中藥高劑量組療效更好。Western blot結果顯示，六味地黃丸可以減少β-Catenin、c-Myc、Cyclin D1蛋白的表達水平。綜上所述，說明VPA誘導ASD仔鼠，Wnt信號通路被激活，而六味地黃丸可以通過調控Wnt信號傳導進而改善VPA誘導大鼠的ASD樣行為表型。

本研究通過網絡藥理學及分子對接探究六味地黃丸治療ASD的潛在作用機制，并加以實驗驗證，體現了中醫藥治療ASD具有多通路、多靶點的優勢[24]，為傳統經驗醫學向著現代證據醫學的轉變提供了一個新的方法。本研究團隊后續將進一步研究其他信號通路及體外實驗，為ASD的靶向治療提供理論依據。

參考文獻

[1] THOMAS S D， JHA N K， OJHA S， et al. mTOR signaling disruption and its association with the development of autism spectrum disorder[J]. Molecules， 2023， 28（4）： 1889.

[2] ROMAN-URRESTARAZU A， VAN KESSEL R， ALLISON C， et al. Association of race/ethnicity and social disadvantage with autism prevalence in 7 million school children in England[J]. JAMA Pediatrics， 2021， 175（6）： e210054.

[3] MORALES HIDALGO P， VOLTAS MORESO N， CANALS SANS J. Autism spectrum disorder prevalence and associated sociodemographic factors in the school population： EPINED study[J]. Autism： the International Journal of Research and Practice， 2021， 25（7）： 1999-2011.

[4] 吳燕紅， 董超群， 岑伊貝妮， 等. 孤獨癥兒童家庭復原力現狀及其影響因素的研究[J]. 軍事護理， 2022， 39（8）： 34-37.

[5] GENOVESE A， BUTLER M G. Clinical assessment， genetics， and treatment approaches in autism spectrum disorder （ASD）[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2020， 21（13）： 4726.

[6] HUGHES H K， ASHWOOD P. Innate immune dysfunction and neuroinflammation in autism spectrum disorder （ASD）[J]. Brain， Behavior， and Immunity， 2023， 108： 245-254.

[7] WANG L， WANG B Q， WU C Y， et al. Autism spectrum disorder： Neurodevelopmental risk factors， biological mechanism， and precision therapy[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2023， 24（3）： 1819.

[8] SALLOUM-ASFAR S， ZAWIA N， ABDULLA S A. Retracing our steps： A review on autism research in children， its limitation and impending pharmacological interventions[J]. Pharmacology amp; Therapeutics， 2024， 253： 108564.

[9] 廉 "彬. 5-羥色胺受體在孤獨癥樣大鼠中的作用及其機制[D]. 重慶： 西南大學， 2020.

[10] 李 "燊， 吳海濤. 孤獨癥譜系障礙實驗動物模型研究進展[J]. 中國藥理學與毒理學雜志， 2020， 34（2）： 133-141.

[11] 王劍飛， 韓俊海， 張子超. 孤獨癥譜系障礙小鼠模型行為學檢測方法[J]. 遺傳， 2021， 43（5）： 501-519.

[12] 魏 "偉， 吳希美， 李元建. 藥理實驗方法學[M]. 4版. 北京： 人民衛生出版社， 2010： 1439-1442.

[13] 張亞同， 趙書藝， 楊莉斌， 等. 基于中西醫臨床病證特點的孤獨癥譜系障礙動物模型評價[J/OL]. 中國實驗方劑學雜志， 1-8[2024-01-15]https：//doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.20240362.

[14] 姜曉晨， 劉福棟， 王桂彬， 等. 六味地黃丸制方考辨及抗腫瘤臨證應用淺析[J]. 遼寧中醫雜志， 2023， 50（2）： 80-83.

[15] 陳思琦， 李佳欣， 吳鑫宇， 等. 熟地黃的藥理學研究進展[J]. 化學工程師， 2019， 33（11）： 46-50.

[16] 胡汝明， 謝岳婷， 陳劍川. 基于AKT/GSK-3β信號通路探討熟地黃提取物對糖尿病腎病大鼠腎小球臟層上皮細胞表型轉化的影響[J]. 中國老年學雜志， 2023， 43（10）： 2497-2500.

[17] JIANG C C， LIN L S， LONG S， et al. Signalling pathways in autism spectrum disorder： Mechanisms and therapeutic implications[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2022， 7（1）： 229.

[18] WANG Z， QIAO D， CHEN H， et al. Effects of Fmr1 gene mutations on sex differences in autism-like behavior and dendritic spine development in mice and transcriptomic studies[J]. Neuroscience， 2023， 534： 16-28.

[19] LO L H Y， LAI K O. Dysregulation of protein synthesis and dendritic spine morphogenesis in ASD： Studies in human pluripotent stem cells[J]. Molecular Autism， 2020， 11（1）： 40.

[20] HERNANDEZ A， DELGADO-GONZ？魣LEZ E， DURAIRAJ R V， et al. Striatal synaptic changes and behavior in adult mouse upon prenatal exposure to valproic acid[J]. Brain Research， 2023， 1815： 148461.

[21] CARACCI M O， AVILA M E， ESPINOZA-CAVIERES F A， et al. Wnt/β-catenin-dependent transcription in autism spectrum disorders[J]. Frontiers in Molecular Neuroscience， 2021， 14： 764756.

[22] 李 "莉， 談華龍， 周三華. Wnt信號通路相關基因多態性與漢族兒童孤獨癥的關系分析[J]. 臨床和實驗醫學雜志， 2019， 18（21）： 2304-2307.

[23] WANG L L， CHEN J H， HU Y L， et al. Progranulin improves neural development via the PI3K/Akt/GSK-3β pathway in the cerebellum of a VPA-induced rat model of ASD[J]. Translational Psychiatry， 2022， 12（1）： 114.

[24] 吳 "吉， 裴方妤， 張 "滌， 等. BDNF信號通路在兒童孤獨癥譜系障礙中的作用機制及中醫藥干預研究進展[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2023， 43（4）： 759-766.