基于miR-139/Wnt/β-catenin信號通路探討參附注射液對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的保護作用

〔摘要〕 目的 探討參附注射液對鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）誘導的慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）大鼠心肌纖維化的作用與機制。方法 采用隨機數字表法將45只SD大鼠隨機分為正常組9只，造模組36只，采用ISO背部皮下多點注射14天制備CHF大鼠模型，再正常飼養14 d通過模型驗證和評價，期間死亡大鼠5只，未成模大鼠4只。將造模成功的27只大鼠按隨機數字表法分為3組：模型組（腹腔注射6 mL·kg-1氯化鈉注射液+灌胃10 mL·kg-1蒸餾水）、參附注射液組（腹腔注射6 mL·kg-1參附注射液+灌胃10 mL·kg-1蒸餾水）、卡托普利組（腹腔注射6 mL·kg-1生理鹽水+灌胃10 mL·kg-1蒸餾水，蒸餾水含8.8 mg·kg-1卡托普利，相當于臨床等效量）。藥物干預15 d后，檢測各組大鼠心功能及心肌纖維化的相關指標：超聲心動圖、體質量、心臟質量指數及左心室質量指數；ELISA法檢測氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）；HE染色、Masson 染色檢測心肌組織病理形態及纖維化狀態；RT-qPCR檢測心肌組織中miR-139、Wnt家族成員3a（Wnt family member 3a，Wnt3a）、β-連環蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、Ⅰ型膠原蛋白（typeⅠ collagen，Col-Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（typeⅢ collagen，Col-Ⅲ）及α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）mRNA的表達；Western blot檢測心肌組織中Wnt3a、β-catenin、GSK3β、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9蛋白表達。結果 與正常組比較，模型組左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）、體質量降低（Plt;0.01），左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、NT-proBNP、心臟質量指數、左心室質量指數升高（Plt;0.01），miR-139表達量下降（Plt;0.01），Wnt3a、β-catenin、GSK3β、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達升高（Plt;0.01）；細胞排列紊亂，心肌纖維化明顯，伴有明顯的炎癥浸潤。與模型組比較，參附注射液組LVEF、LVFS、體質量升高（Plt;0.01或Plt;0.05），LVEDD、LVESD、NT-proBNP、心臟質量指數、左心室質量指數降低（Plt;0.01），miR-139表達量升高（Plt;0.01），Wnt3a、β-catenin、GSK3β、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達降低（Plt;0.01）；細胞排列趨于整齊，纖維結締組織增生及炎癥細胞浸潤現象減少，膠原纖維沉積減少，纖維化程度減輕。結論 參附注射液能改善CHF大鼠心功能及心肌纖維化狀態，其機制可能與調控miR-139/Wnt/β-catenin信號通路有關。

〔關鍵詞〕 慢性心力衰竭；參附注射液；miR-139；Wnt/β-catenin；心肌纖維化

〔中圖分類號〕R285.5 " " " " 〔文獻標志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.004

Protective effects of Shenfu Injection on myocardial fibrosis in rats with chronic heart failure based on miR-139/Wnt/β-catenin signaling pathway

GUO Jin， WANG Ziyi， ZHANG Qian， MENG Lichong， HU Zhixi*

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the mechanism of action of Shenfu Injection （SFI） on myocardial fibrosis in rats with chronic heart failure （CHF） induced by isoprenaline （ISO）. Methods Forty-five SD rats were divided into normal group （n=9） and modeling group （n=36） by random number table method. CHF rat model was prepared by 14-day subcutaneous multi-point injection of ISO on the back， followed by 14-day normal feeding to validate and evaluate the model. During this period， five rats died and four rats were not modeled. Then the 27 successfully modeled rats were subdivided into three groups by the random number table method： model group （intraperitoneal injection of 6 mL·kg-1 sodium chloride injection+gavage of 10 mL·kg-1 distilled water）， SFI group （intraperitoneal injection of 6 mL·kg-1 SFI+gavage of 10 mL·kg-1 distilled water）， and captopril group （intraperitoneal injection of 6.0 mL·kg-1 normal saline+gavage of 10 mL·kg-1 distilled water containing 8.8 mg·kg-1 captopril which was clinically equivalent）. After 15 d of drug intervention， the related indicators of cardiac function and myocardial fibrosis in each group were examined， including echocardiogram， body mass， heart mass index， and left ventricular mass index. ELISA was used to determine N-terminal pro brain natriuretic peptide （NT-proBNP） content; HE staining and Masson staining were performed to observe the histopathological morphology and fibrosis of the myocardial tissue; RT-qPCR was conducted to examine the mRNA expressions of miR-139， Wnt family member 3a （Wnt3a）， β-catenin， glycogen synthase kinase 3β （GSK3β）， type I collagen （Col-I）， type Ⅲ collagen （Col-Ⅲ）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， matrix metalloproteinase-2 （MMP-2）， and matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） in the myocardial tissue; Western blot was used to examine the protein expressions of Wnt3a， β-catenin， GSK3β， Col-I， Col-Ⅲ， α-SMA， MMP-2， and MMP-9 in it. Results Compared with normal group， the left ventricular ejection fraction （LVEF）， left ventricular fraction shortening （LVFS） and body mass of rats in model group decreased （Plt;0.01）， while the left ventricular end diastolic diameter （LVEDD）， left ventricular end systolic diameter （LVESD）， NT-proBNP content， heart mass index， and left ventricular mass index increased （Plt;0.01）; the miR-139 expression decreased （Plt;0.01）， and the protein and mRNA expressions of Wnt3a， β-catenin， GSK3β， Col-I， Col-III， α-SMA， MMP-2， and MMP-9 increased （Plt;0.01）; the myocardial tissue showed disordered cell arrangement and significant fibrosis， accompanied by obvious inflammatory infiltration. Compared with model group， the LVEF， LVFS， and body mass of rats in SFI group were higher （Plt;0.01 or Plt;0.05）， while the LVEDD， LVESD， NT-proBNP content， heart mass index， and left ventricular mass index were lower （Plt;0.01）; the miR-139 expression increased （Plt;0.01）， and the protein and mRNA expressions of Wnt3a， β-catenin， GSK3β， Col-I， Col-Ⅲ， α-SMA， MMP-2， and MMP-9 decreased （Plt;0.01）; cell arrangement tended to be neat in the myocardial tissue， with reduced fibrous connective tissue hyperplasia， inflammatory cell infiltration， collagen fiber deposition， and fibrosis degree. Conclusion SFI can improve cardiac function and alleviate myocardial fibrosis in rats with CHF， and its mechanism may be related to the regulation of miR-139/Wnt/β-catenin signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 chronic heart failure; Shenfu Injection; miR-139; Wnt/β-catenin; myocardial fibrosis

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于心臟結構或功能異常導致心室充盈或射血能力受損而引起的一組復雜的臨床綜合征[1]。CHF是心臟疾病的終末期，病機復雜，主要臨床表現為呼吸困難、體力活動受限、體液潴留。根據中國心力衰竭患者注冊登記研究我國有近890萬CHF患者，其中心力衰竭住院患者病死率為4.1%[2]。心力衰竭發生后，左心室可發生結構、電生理和信號轉導重構，稱為病理性重構，是心力衰竭的關鍵發病機制[3]。心肌纖維化是心臟重構最重要的形態學改變，是重構發生發展的驅動因素，也是心力衰竭的獨立、預測性危險因素。因此，治療和改善心肌纖維化是預治心力衰竭的重要手段[4-5]。

微小RNA分子（microRNA，miRNA）是一種短鏈非編碼RNA，長度為18～22個核苷酸，常以細胞內介質參與轉錄后基因調控[6]。miRNA在心血管系統中異常表達，是調節心臟重構和纖維化的關鍵成分[7-9]。研究表明，miR-139具有抗心肌損傷作用，可調節細胞凋亡和自噬，防止心肌缺血和再灌注損傷，miR-139過表達可抑制氧化應激誘導的心肌細胞損傷[10-12]。Wnt信號通路是調控組織器官發育，參與細胞增殖、分化和轉移的重要信號轉導通路。Wnt/β-catenin是其中最典型的通路之一，是該通路的核心蛋白，在調控心肌纖維化過程中起重要作用[13-14]。鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline hydrochloride，ISO）是一種β受體激動劑，作用于心臟β1受體，可使心肌產生持續劇烈收縮，引起心肌纖維化和心室重構，最終導致CHF[15]。參附注射液源自傳統名方參附湯，其藥物僅由人參和附子組成，廣泛應用于臨床治療心力衰竭等心血管疾病[16-17]。現代藥理學研究表明，參附注射液作用機制主要包括抗纖維化、抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等[18-20]。本課題組前期研究證實，參附注射液可改善CHF大鼠心功能，降低心肌纖維化程度[19，21]，然而對CHF的發病機制和藥物作用靶點尚未完全闡明。因此，本研究擬建立ISO致CHF大鼠模型，并用參附注射液進行干預，通過動物實驗研究，初步探討miR-139調控Wnt/β-catenin信號通路在CHF心肌纖維化過程中的作用，以及參附注射液改善心功能的具體作用機制和有效靶點，為今后CHF的精準辨證和靶點治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 "動物

45只5周齡SPF級雄性SD大鼠，大鼠體質量為（180±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0004，動物合格證號430727221101891171、430727221101836883，在湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室內飼養。研究方案經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準號：LL2022072705。

1.2 "藥物

鹽酸異丙腎上腺素（MedChemExpress公司，批號：HY-B0468/CS-2582）；參附注射液（華潤三九雅安藥業有限公司，批號：Z51020664，國藥準字號Z51020664，規格10 mL/支）；卡托普利（重慶科瑞制藥有限公司，批號：641003，國藥準字號H50020362，規格25 mg/片）；烏拉坦（上海源葉生物科技有限公司，批號：MFCD？鄄00007966）。

1.3 "主要試劑

NT-proBNP試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：W210349115）；蘇木精、伊紅（Wellbio公司，批號分別為02A230427、02B230519）；Ⅰ型膠原蛋白（typeⅠ collagen，Col-Ⅰ）（三鷹公司，批號：00102069）、GSK3β、MMP-9、Wnt3a、β-catenin抗體（英國Abcam公司，批號分別為GR3258308-20、GR3384704-13、GR？鄄

3358334-9、GR3368970-1）；Ⅲ型膠原蛋白（type Ⅲ coll？鄄

agen，Col-Ⅲ）抗體（博奧森公司，批號：BJ11098955）；MMP-2、α-SMA、GAPDH抗體（美國Proteintech公司，批號分別為00045454、00082753、00110344）；山羊抗兔IgG （H+L）二抗HRP（中國艾碧維公司，批號：01C230530）；mRNA逆轉錄試劑盒、miRNA逆轉錄試劑盒、UltraSYBR Mixture（中國北京康為世紀公司，批號分別為09623、25722、29122）。

1.4 "主要儀器

VINNO 6 LAB型便攜式數字化彩色超聲診斷儀（飛依諾科技蘇州有限公司）；H1650 R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；PW-812型全自動酶標洗板機、MB-530多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司）；DHP-500型電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司）；YD-315型切片機（浙江金華益迪試驗器材）；BMJ-A型包埋機（常州中威電子儀器）；DYY-6 C型電泳儀、DYCZ-24 DN型電泳槽、DYCZ-40 D型轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）；BioPrep-24型生物樣品均質儀（杭州奧盛儀器有限公司）；PIKOREAL96型熒光定量RCP儀、SPL0960型熒光PCR板（美國Thermo公司）；QuantStudio1型熒光定量RCP儀（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 "造模和模型評價標準

依據本課題組前期研究、預實驗及相關文獻，復制ISO誘導的CHF大鼠模型[19，22-23]。模型組大鼠背部皮下多點注射ISO，劑量為5 mg·kg-1，注射濃度為1.67 mg·mL-1，正常組大鼠在背部皮下多點注射等量生理鹽水，連續注射14 d，再正常飼養14 d。造模期間觀察大鼠的一般情況和宏觀指標，用專用照相機記錄各項宏觀指標變化。通過超聲心動圖檢測大鼠心室結構，包括左室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）及左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS），ELISA檢測大鼠血清指標氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP），與正常組大鼠比較有統計學意義則判斷CHF疾病模型是否制備成功。

2.2 "分組與給藥

采用隨機數字表法從45只大鼠隨機選9只作為正常組，其余36只為造模組。造模結束時，死亡大鼠5只，造模未成功大鼠4只。將造模成功的27只大鼠采用隨機數字表法分為：模型組（腹腔注射6 mL·kg-1氯化鈉注射液+灌胃10 mL·kg-1蒸餾水）、參附注射組（腹腔注射6 mL·kg-1參附注射液+灌胃10 mL·kg-1蒸餾水）、卡托普利組（腹腔注射6 mL·kg-1生理鹽水+灌胃10 mL·kg-1蒸餾水（蒸餾水含8.8 mg·kg-1卡托普利，相當于臨床等效量）。各組大鼠給藥劑量通過人與動物等效劑量換算確定，參照本課題組前期研究及預實驗，確定大鼠給藥時間為15 d[19，23]。考慮操作難度及給藥劑量，故選擇藥物吸收與靜脈給藥相似、生物利用度稍差于靜脈給藥，但操作更簡便的腹腔注射。

2.3 "標本采集

于末次給藥第2日早上取材，烏拉坦麻醉（0.2 g·mL-1，

6.5 mL·kg-1腹腔注射），暴露腹主動脈，采血5 mL以上。采集的血樣于室溫靜置2 h后離心以3 000 r·min-1運行15 min（離心半徑為17.8 cm），取上清液，-80 ℃冰箱中保存備用。腹主動脈采血后，剪開肋骨，暴露胸腔，生理鹽水反復灌洗心臟后迅速剝離心臟，剪去周圍結締組織和血管，濾紙吸干后，用電子天平稱量心臟質量，沿冠狀溝走行分離心尖與左心室，再次稱重后用4%多聚甲醛溶液固定心尖組織，左心室放入凍存管，-80 ℃冰箱中保存備用。

2.4 "指標檢測與方法

2.4.1 "心功能檢測 "將大鼠麻醉固定于鼠板后脫毛，應用小動物超聲系統，將M型超聲探頭放置在大鼠左胸部與胸骨中線成10°～30°處，在左室長軸切面連續測量3個心動周期的LVEDD和LVESD，連續測量3次取平均值，計算LVEF及LVFS。

2.4.2 "大鼠心臟質量指數及左心室質量指數測定 "稱量全心重量，剪去心房和右心室游離壁，分離左心室并稱重，分別計算心臟質量指數（心臟質量/體質量）和左心室質量指數（左心室質量/體質量）。

2.4.3 "ELISA法測定血清NT-proBNP水平 "大鼠麻醉后腹主動脈采血5 mL，室溫下靜置2 h后3 000 r·min-1離心15 min，保留上清液，嚴格按ELISA試劑盒說明書，采用ELISA法測定血清NT-proBNP含量。

2.4.4 "病理組織學觀察 "大鼠心尖組織放置于4%多聚甲醛中固定，按包埋切片、脫蠟至水、染色、脫水、封片、采像步驟，行常規HE、Masson染色。

2.4.5 "RT-qPCR檢測大鼠心肌組織miR-139、Wnt/β-catenin及心肌纖維化相關因子mRNA的表達 "Trizol提取組織總RNA后以組織總mRNA為模板，逆轉錄cDNA。在NCBI上搜索目的基因的序列，應用primer 5軟件設計引物，引物由北京擎科合成，引物序列見表1。通過各目的因子基因片段的擴增曲線，確定Ct，逐漸增加溫度，同時監測每一步的熒光信號產生溶解曲線，驗證反應無非特異性產物，提示定量準確。

2.4.6 "Western blot檢測大鼠心肌組織Wnt/β-catenin信號通路及心肌纖維化相關蛋白表達 "提取心肌組織中蛋白，參照BCA試劑盒說明書測得蛋白濃度。經過制膠、電泳、轉膜、封閉后，用1×PBST將一抗按照一定比例稀釋[Wnt3a（1∶1 000）、β-catenin（1 μg/mL）、GSK3β（1∶5 000）、Col-I（1∶1 000）、Col-Ⅲ（1∶1 000）、α-SMA（1∶2 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶

2 000）、GAPDH（1∶5 000）]，將膜與一抗一起孵育，室溫放置90 min，孵育結束，1×PBST洗3次，每次15 min。用1×PBST稀釋HRP標記的二抗[山羊抗兔IgG（H+L）二抗HRP（1∶5 000）]，將稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育90 min。孵育結束，1×PBST洗3次，每次10 min。使用ECL化學發光液與膜孵育1 min，濾紙吸干液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，凝膠成像系統成像。

2.5 "統計分析

運用SPSS 24.0軟件進行分析，計量數據以“ｘ±s”表示。兩組間比較符合正態分布采用兩獨立樣本t檢驗，不符合正態分布采用秩和檢驗。多組間比較進行單因素方差分析（One-way ANOVA），滿足方差齊性采用最小顯著差異法（LSD），不滿足方差齊性時采用Tamhane′s T2法；若不符合正態分布，則采用多個獨立樣本均數比較的非參數Kruskal-Wallis秩和檢驗（H檢驗）。以Plt;0.05或Plt;0.01表示差異具有統計學意義。使用GraphPad Prism 8.0軟件進行繪圖操作。

3 結果

3.1 "各組大鼠一般情況

ISO造模期間共死亡5只大鼠，觀察各組大鼠情況，正常組大鼠無死亡，毛發光澤，精神狀態、行為活動、飲食飲水均正常。造模組大鼠精神萎靡，毛發稀疏，蜷縮抱團，不欲飲食，體質量減輕，部分大鼠出現腹水。與模型組對比，參附注射液組及卡托普利組大鼠精神狀態、行為活動、飲食飲水均明顯改善，毛發光澤明顯恢復，體質量明顯增加，說明參附注射液可改善CHF大鼠癥狀。

3.2 "各組大鼠超聲心動圖情況

藥物干預結束后，與正常組比較，模型組LVEDD、LVESD顯著上升（Plt;0.01），LVEF、LVFS顯著下降（Plt;0.01）；與模型組比較，參附注射液組及卡托普利組LVEDD、LVESD顯著下降（Plt;0.01），LVEF、LVFS顯著上升（Plt;0.01）。詳見表2。

3.3 "各組大鼠血清NT-proBNP水平、體質量、心臟質量指數及左心室質量指數比較

藥物干預結束后，與正常組比較，模型組血清NT-proBNP水平顯著上升（Plt;0.01），體質量顯著下降（Plt;0.01），心臟質量指數及左心室質量指數顯著升高（Plt;0.01）；與模型組比較，參附注射液組及卡托普利組血清NT-proBNP水平顯著下降（Plt;0.01），體質量顯著升高（Plt;0.01或Plt;0.05），心臟質量指數以及左心室質量指數顯著降低（Plt;0.01）。詳見表3。

3.4 "各組大鼠心肌組織病理學觀察

藥物干預結束后，大鼠心肌組織HE染色結果提示正常組心肌細胞排列整齊、形態正常、橫截面清晰，未見明顯纖維組織增生；與正常組相比，模型組大鼠細胞排列明顯紊亂不齊，心肌細胞出現肥大、壞死現象，纖維結締組織增生嚴重，伴有明顯炎癥浸潤；與模型組相比，參附注射液組及卡托普利組細胞結構完整，細胞排列趨于整齊，纖維結締組織增生及炎癥細胞浸潤現象明顯減少。詳見圖1。

Masson染色結果提示，正常組心肌細胞排列整齊，血管周圍僅有少量結締組織，間質僅有少量血管及結締組織，未見明顯膠原纖維沉積；與正常組相比，模型組心肌細胞及血管周圍可見大量藍色膠原纖維沉積，大面積纖維化組織取代正常心肌組織，心肌纖維化程度明顯升高（Plt;0.01）；與模型組相比，參附注射液組及卡托普利組膠原纖維沉積和纖維化程度明顯降低（Plt;0.01）。詳見圖2—3。

3.5 "各組大鼠心肌組織miR-139、Wnt/β-catenin信號通路、心肌纖維化相關因子mRNA比較

藥物干預結束后，與正常組相比，模型組心肌組織中miR-139相對表達量顯著降低（Plt;0.01），Wnt/β-catenin信號通路中Wnt3a、β-catenin、GSK3β mRNA相對表達量顯著升高（Plt;0.01），心肌纖維化相關因子Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量顯著升高（Plt;0.01）；與模型組相比，參附注射液組和卡托普利組心肌組織中miR-139相對表達量顯著升高（Plt;0.01），Wnt/β-catenin信號通路中Wnt3a、β-catenin、GSK3β mRNA相對表達量顯著降低（Plt;0.01），心肌纖維化相關因子Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量顯著降低（Plt;0.01）。詳見表4—5。

3.6 "各組大鼠心肌組織Wnt/β-catenin信號通路及心肌纖維化相關蛋白表達比較

藥物干預結束后，與正常組相比，模型組心肌組織Wnt3a、β-catenin、GSK3β、Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯升高（Plt;0.01）；與模型組比較，參附注射液組、卡托普利組心肌組織Wnt3a、β-catenin、GSK3β、Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯降低（Plt;0.01或Plt;0.05）。詳見表6、圖4。

4 討論

CHF的患病率呈持續上升趨勢，心力衰竭發生后，心肌細胞受損，心臟應對損傷的響應機制主要表現為心肌纖維化。心肌纖維化是心血管疾病中最重要的形態學改變，其病理過程主要表現為心臟成纖維細胞異常增加，心肌細胞外基質過度沉積，Ⅰ型和Ⅲ型膠原比例失衡，導致瘢痕形成，限制損傷，從而繼續維持心臟結構的病態完整性[24]。這本是一種對病理刺激的生理反應，然而這一過程的長期激活會導致不良的心肌組織重構，最終影響心臟的結構和功能，導致心力衰竭[25]。因此，探索CHF過程中心肌纖維化的分子靶點具有重要意義。

ISO是一種非選擇性β腎上腺素受體激動劑，可加快心率，增強心肌收縮力，誘發心肌細胞壞死，引起心肌纖維化，最終導致CHF[26]。基于此，本研究采用皮下多點注射ISO誘導大鼠CHF心肌纖維化的發生。本研究結果提示：從一般行為體征分析，與正常組相比，模型組大鼠精神萎靡，不欲飲食，毛發稀疏，腹水嚴重，體質量顯著下降，心臟質量指數以及左心室質量指數顯著升高；從超聲心動圖結果分析，模型組大鼠的LVEDD、LVESD顯著上升，LVEF、LVFS顯著下降；從生物標志物分析，模型組血清NT-proBNP水平顯著上升；從病理結果分析，模型組心肌細胞排列紊亂，藍色膠原纖維大量沉積，心肌纖維化明顯，伴有明顯炎癥浸潤；從蛋白、基因角度分析，模型組大鼠心肌組織中心肌纖維化相關因子Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的相對表達量均顯著升高，miR-139表達量下降，Wnt/β-catenin信號通路相關因子Wnt3a、β-catenin、GSK3β蛋白和mRNA的相對表達量均顯著升高。可見，ISO誘導的CHF大鼠存在明顯的心肌纖維化損傷，同時心肌組織中miR-139表達量顯著下降，Wnt/β-catenin信號通路被激活。

參附注射液由紅參和制附子組成，其具有益氣回陽、固攝心陽的作用，用于治療由陽虛引起的各種疾病，其有效成分為人參皂苷、烏頭類生物堿和人參多糖等。人參皂苷能促進心臟營養物質代謝，增強心臟收縮力，烏頭類生物堿能促進心室收縮，優化心肌血流量，改善心功能[27-28]。研究證實，參附注射液具有改善心肌纖維化、減輕左心室纖維化程度、減輕心肌損傷、促使心肌修復的作用，可從多方面治療心力衰竭等疾病[29-30]。

miRNA通過多種途徑參與心室病理性重構，在纖維性疾病中發揮著重要作用[31]。miR-139具有抗心肌損傷作用，可調節細胞凋亡和自噬，拮抗ISO誘導的心肌細胞肥大和ANP、BNP上調，從而預防心肌缺血和再灌注損傷[10，12，32]。Wnt/β-catenin信號通路在調控心肌纖維化方面起到了重要作用[13-14]。正常成人心臟中Wnt信號是靜止的，在心臟損傷后，該信號被激活并促進纖維化，而Wnt拮抗劑可減輕受損心臟的纖維化狀態[33-36]。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵蛋白之一，與組織纖維化密切相關[37]。而Wnt3a蛋白是β-catenin的有效刺激物，可阻止β-catenin被磷酸化，阻止其被蛋白酶體識別和降解[33]。含有Wnt3a的外泌體可激活心臟成纖維細胞中的Wnt/β-catenin信號，抑制GSK3β的活性，使β-catenin進入細胞核，最終促進心肌纖維化[38]。研究表明，miR-139-5p通過Wnt/β-catenin通路在心臟疾病中發揮重要作用[39]。

本研究結果顯示：與模型組相比，參附注射液組大鼠精神狀態、行為活動、飲食飲水情況明顯改善，毛發光澤恢復，體質量明顯增加，心臟質量指數以及左心室質量指數顯著降低；從超聲心動圖結果分析，心功能指標LVEDD、LVESD顯著下降，LVEF、LVFS顯著上升；從生物標志物分析，血清NT-proBNP水平顯著下降；從病理結果分析，心肌細胞結構完整，細胞排列趨于整齊，纖維結締組織增生和炎癥細胞浸潤明顯減少，膠原纖維沉積明顯減少，纖維化程度明顯減輕；從蛋白、基因角度分析，參附注射液組大鼠心肌組織中miR-139相對表達量顯著升高，Wnt/β-catenin信號通路相關因子Wnt3a、β-catenin、GSK3β蛋白和mRNA相對表達量均顯著降低，心肌組織中心肌纖維化相關因子Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA、MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA相對表達量均顯著降低。上述結果說明參附注射液能有效改善CHF大鼠的心肌纖維化損傷情況，且治療效果較卡托普利組更為顯著。可見，參附注射液可能通過抑制miR-139/Wnt/β-catenin信號通路，發揮改善CHF大鼠心功能及心肌纖維化的作用。

綜上，本研究通過ISO誘導構建CHF大鼠模型，探討參附注射液對CHF大鼠心肌纖維化的改善機制。研究結果表明，參附注射液能夠改善CHF大鼠的心功能，減輕心肌纖維化程度，降低心肌組織中的纖維化相關蛋白及mRNA的表達，其機制可能與上調心肌組織中的miR-139表達，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。為了進一步驗證該結果，后續計劃在細胞實驗中進一步探索miR-139與Wnt/β-catenin信號通路之間的具體作用位點，探索參附注射液對CHF心肌纖維化的保護機制，為CHF的臨床應用和藥物研發提供更充分的科學實驗依據。

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