水蘇堿調節Hippo-YAP信號通路對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的神經保護作用

〔摘要〕 目的 "探究水蘇堿（stachydrine，STA）對缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）新生大鼠的神經保護作用，并分析其作用機制。方法 將新生SD大鼠隨機分為假手術組、HIBD組、STA低劑量（5 mg/kg）組、STA中劑量（10 mg/kg）組、STA高劑量（20 mg/kg）組、維替泊芬（10 mg/kg）+STA高劑量（20 mg/kg）組，除假手術組外，其余大鼠構建HIBD大鼠模型。對各組大鼠進行神經功能缺損評分，采用Morris水迷宮實驗進行認知功能評價，測定各組大鼠腦含水量和腦指數，HE染色、尼氏染色觀察腦組織神經元損傷，TUNEL染色觀察腦組織神經元細胞凋亡情況，Western blot法檢測YES相關蛋白（YES associated protein，YAP）、p-YAP、哺乳動物STE20樣蛋白激酶1（mammalian sterile 20-like kinase 1，MST1）、p-MST1、具有PDZ基序的轉錄共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）蛋白表達。結果 與假手術組比較，HIBD組海馬組織損傷加重，尼氏小體減少（P＜0.05），神經功能缺損評分、逃避潛伏期、腦組織含水量、腦指數、神經元細胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值顯著增加（P＜0.05），穿越平臺次數、TAZ表達顯著降低（P＜0.05）；與HIBD組相比，STA低、中、高劑量組海馬組織損傷改善，尼氏小體增加（P＜0.05），神經功能缺損評分、逃避潛伏期、腦組織含水量、腦指數、神經元細胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值顯著降低（P＜0.05），穿越平臺次數、TAZ表達顯著增加（P＜0.05）；與STA高劑量組相比，維替泊芬+STA高劑量組海馬組織損傷加重，尼氏小體減少（P＜0.05），神經功能缺損評分、逃避潛伏期、腦組織含水量、腦指數、神經元細胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值顯著增加（P＜0.05），穿越平臺次數、TAZ表達顯著降低（P＜0.05）。結論 STA可能通過調控Hippo-YAP信號通路、減少神經損傷和神經元細胞凋亡、改善神經功能，發揮對HIBD新生大鼠的神經保護作用。

〔關鍵詞〕 缺氧缺血性腦損傷；神經保護；新生大鼠；神經元；細胞凋亡；水蘇堿；Hippo-YES相關蛋白信號通路

〔中圖分類號〕R285.5 " " " " 〔文獻標志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.006

Neuroprotective effects of stachydrine on hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats by regulating Hippo-YAP signaling pathway

LI Yapeng， LI Qin， LI Li， CHEN Yanjun， PENG Hao*

Pediatric Center， Suining Central Hospital， Suining， Sichuan 629000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the neuroprotective effects of stachydrine （STA） on neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage （HIBD） and analyze its mechanism of action. Methods Neonatal SD rats were randomly grouped into sham-operated group， HIBD group， low-， medium-， and high-dose STA groups （5 mg/kg， 10 mg/kg， and 20 mg/kg， respectively）， and verteporfin （10 mg/kg）+high-dose STA （20 mg/kg） group. Except for the sham-operated group， other rats were applied to establishing HIBD rat models. The neurological deficits of rats in each group were scored， and Morris water maze experiment was performed to evaluate the cognitive function. The brain water content and brain index of rats in each group were measured. HE staining and Nissl staining were used to observe neuronal damage in the brain tissue， TUNEL staining to observe neuronal apoptosis， and Western blot to determine the protein expressions of YES associated protein （YAP）， p-YAP， mammalian sterile20-like kinase 1 （MST1）， p-MST1， and transcriptional coactivator with PDZ-binding motif （TAZ）. Results Compared with sham-operated group， the hippocampal tissue damage in HIBD group was aggravated， the number of Nissl bodies decreased （Plt;0.05）， the neurological deficit score， escape latency， brain tissue water content， brain index， neuronal apoptosis rate， and ratios of p-YAP/YAP and p-MST1/MST1 were significantly higher （Plt;0.05）， but the platform crossing times and TAZ expression were significantly reduced （Plt;0.05）. Compared with HIBD group， the hippocampal tissue damage in the low-， medium-， and high-dose STA groups was reduced， the number of Nissl bodies increased （Plt;0.05）， the neurological deficit score， escape latency， brain tissue water content， brain index， neuronal apoptosis rate， and ratios of p-YAP/YAP and p-MST1/MST1 were significantly lower （Plt;0.05）， while the platform crossing times and TAZ expression significantly increased （Plt;0.05）. Compared with high-dose STA group， the hippocampal tissue damage in verteporfin+high-dose STA group was aggravated， the number of Nissl bodies decreased （Plt;0.05）， the neurological deficit score， escape latency， brain tissue water content， brain index， neuronal apoptosis rate， and ratios of p-YAP/YAP and p-MST1/MST1 were significantly elevated （Plt;0.05）， but the platform crossing times and TAZ expression were significantly reduced （Plt;0.05）. Conclusion STA may exert neuroprotective effects on HIBD neonatal rats by regulating Hippo-YAP signaling pathway， reducing neuron damage and neuronal apoptosis， and thus improving the neurological function.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 hypoxic-ischemic brain damage; neuroprotection; neonatal rat; neuron; apoptosis; stachydrine; Hippo-YES associated protein signaling pathway

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是圍產期新生兒死亡的主要原因，約占新生兒死亡率的25%[1]。HIBD幸存者伴隨終生神經功能缺損的概率會增加，包括腦癱、認知障礙、學習障礙、發育遲緩、自閉癥和癲癇等[2]。此外，考慮到導致神經元細胞死亡的多重因素，HIBD的潛在機制仍然難以確定。亞低溫治療是目前治療HIBD的標準療法，然而，在亞低溫治療下存活的新生兒仍存在認知障礙、學習障礙和發育遲緩的風險，給家庭和社會帶來沉重的負擔[3]。因此，必須探索更有效的治療策略來改善HIBD的結局。水蘇堿（stachydrine，STA）是益母草的主要生物堿成分，已被證明具有抗炎、抗氧化、抗凝血、抗凋亡、血管擴張等廣泛的生物活性[4]。研究發現，STA具有改善中樞神經系統疾病的作用，能夠通過減少炎癥和細胞凋亡對腦缺血/再灌注損傷發揮保護作用[5]。Hippo-YES相關蛋白（Hippo-YES associated protein，Hippo-YAP）信號通路是一條高度保守的信號通路，是維持細胞穩態、器官大小、組織再生和腫瘤抑制的關鍵調節因子[6]。Hippo-YAP信號通路中的關鍵蛋白是YAP和具有PDZ基序的轉錄共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ），活化的YAP/TAZ通路參與干細胞自我更新、細胞增殖、腫瘤發生和器官生長等[7]。研究表明，Hippo-YAP信號通路對受損的大腦具有神經保護作用，可減輕腦缺血/再灌注損傷后血腦屏障破壞[8]。且有研究表明，過表達Hippo通路中YAP可減輕HIBD大鼠神經行為障礙和神經元損傷，改善認知[9]。但Hippo-YAP信號通路在HIBD中的報道較少，且STA是否通過調控Hippo-YAP信號通路對HIBD大鼠起神經保護作用尚不清楚。本研究通過探究STA對HIBD新生大鼠神經功能、神經元凋亡及Hippo-YAP信號通路的影響，為STA治療HIBD提供臨床依據。

1 材料與方法

1.1 "實驗材料

新生SD大鼠（出生7 d），購自廣東萊迪生物醫藥研究院有限公司，生產許可證號：SCXK（粵）2022-0064，體質量10～15 g，飼養于遂寧市中心醫院實驗動物房內，本實驗經遂寧市中心醫院倫理委員會審批通過（倫理批準號：LLSNCH20200013）。

1.2 "主要試劑與儀器

STA（純度gt;97%，北京伊塔生物科技有限公司，批號：YT11672）；維替泊芬、尼氏染色液（北京百奧萊博科技有限公司，批號：M06973-LTQ、YT167）；HE染色液（北京伊塔生物科技有限公司，批號：SY2022）；TUNEL染色試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：A113-01）；一抗YAP、p-YAP、哺乳動物STE20樣蛋白激酶1（mammalian sterile 20-like kinase 1，MST1）、p-MST1、TAZ、GAPDH抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：12395、13619、14946、49332、83669、3683）；HRP標記羊抗小鼠二抗（上海烜雅生物科技有限公司，批號：XY6161）。

酶標儀（美國Molecular Devices公司，型號：SpectraMax 190）；光學顯微鏡（德國徠卡公司，型號：DM500）；熒光顯微鏡（日本尼康公司，型號：Ni-U/Ni-E）；電泳儀（美國Bio-rad公司，型號：1658033）。

1.3 "實驗方法

1.3.1 "HIBD模型構建、分組和藥物干預 "構建大鼠HIBD模型[10]：異氟醚麻醉大鼠，仰臥位固定在手術臺上，切開皮膚，暴露右側頸總動脈，用5-0縫合線結扎后縫合切口。術后2.5 h，待幼鼠清醒后放入缺氧箱（8% O2、92% N2混合氣）中2 h，體溫維持在37 ℃。另選取15只正常新生大鼠作為假手術組，假手術組大鼠在麻醉狀態下手術暴露頸總動脈，但不結扎和不做缺氧處理。

造模過程中新生大鼠死亡6只，將剩余造模成功的75只大鼠分為：HIBD組、STA低劑量組、STA中劑量組、STA高劑量組、維替泊芬+STA高劑量組，每組15只。對各組大鼠進行藥物干預，其中STA低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg STA[11]，維替泊芬+STA高劑量組腹腔注射10 mg/kg維替泊芬[12]后注射20 mg/kg STA，每天1次，連續7 d。假手術組和HIBD組注射相同劑量的生理鹽水。

1.3.2 "神經功能缺損評分 "各組大鼠在治療第1、4、7天相同時間點，采用Longa評分[13]對大鼠神經功能缺損情況進行評估，評分范圍0～4分。0分：無神經功能缺損；1分：幼鼠左前臂輕癱；2分：行走時向左轉；3分：向左跌倒，無自發活動；4分：無法活動和意識障礙。評分為1～3分的大鼠用于后續實驗。

1.3.3 "Morris水迷宮實驗 "采用一個充滿水的黑色圓形水池（直徑180 cm，高60 cm），水溫（22±1） ℃，水深40 cm。將水池分為4個象限，并在其中一個象限的水面下1 cm處放置（12 cm）平臺。給藥7 d后，對大鼠進行Morris水迷宮實驗。訓練大鼠4 d，每天從4個象限將大鼠放入水中，記錄定位平臺所需的時間，即逃避潛伏期，若大鼠超過60 s未能找到平臺，將其引導至平臺上，并在平臺上停留10 s，則記逃避潛伏期為60 s。記錄第5天時大鼠在4個象限的平均逃避潛伏期。隨后撤除平臺，進行空間探索實驗，記錄大鼠60 s內穿越平臺位置的次數。

1.3.4 "腦含水量和腦指數測量 "上述實驗完成后，各組隨機選取5只大鼠麻醉處死，取腦組織標本，測量左右大腦半球濕重，后將大腦半球在106 ℃烘箱中干燥24 h，測量干重。腦含水量（%）=（濕量-干量）/濕重×100%，腦指數（%）=腦質量/體質量×100%。

1.3.5 "HE染色、尼氏染色 "各組隨機選取5只大鼠，麻醉后處死，取腦海馬組織CA1區固定、脫水、石蠟包埋，制成5 μm切片，后用HE染色液或尼氏染色液染色，梯度乙醇脫水，封片后在顯微鏡下觀察。并隨機選取視野，統計尼氏染色細胞的數量，使用Image-Pro Plus 6.0進行分析。

1.3.6 "TUNEL染色 "取大鼠腦海馬組織CA1區石蠟切片，蛋白酶K處理后與TUNEL反應混合液在37 ℃避光標記1 h，PBS清洗切片并用蘇木精染色，凋亡細胞被染成棕色，非凋亡細胞被染成藍色。使用電子目鏡顯微鏡進行拍照分析，并計算凋亡率。

1.3.7 "Western blot檢測Hippo-YAP信號通路蛋白表達 "取各組剩余5只大鼠，收集大鼠海馬組織，在RIPA裂解緩沖液中裂解，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，采用SDS-聚丙烯酰胺分離凝膠電泳分離蛋白，將條帶轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶溶液封閉4 h后，將膜與一抗YAP、p-YAP、MST1、p-MST1、TAZ和GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜，洗滌后與二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h。ECL化學發光試劑盒顯影并通過成像系統進行量化。

1.4 "統計學處理

數據采用SPSS 22.0統計軟件和GraphPad Prism 7.0軟件進行處理，計量資料以“ｘ±s”表示。兩組間比較采用Tukey's事后檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 "STA對各組大鼠神經功能缺損評分的影響

與假手術組比較，HIBD組大鼠第1、3、7天神經功能缺損評分顯著升高（P＜0.05）；與HIBD組比較，STA低、中、高劑量組第3、7天神經功能缺損評分顯著降低（P＜0.05）；與STA高劑量組比較，維替泊芬＋STA高劑量組第3、7天神經功能缺損評分顯著升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 "STA對各組大鼠Morris水迷宮實驗結果的影響

與假手術組比較，HIBD組大鼠逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺次數顯著減少（P＜0.05）；與HIBD組比較，STA低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期顯著縮短、穿越平臺次數顯著增加（P＜0.05）；與STA高劑量組比較，維替泊芬＋STA高劑量組大鼠逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺次數顯著減少（P＜0.05）。詳見表2、圖1。

2.3 "STA對各組大鼠腦含水量和腦指數的影響

與假手術組比較，HIBD組大鼠腦組織含水量、腦指數顯著升高（P＜0.05）；與HIBD組比較，STA低、中、高劑量組大鼠腦組織含水量、腦指數顯著降低（P＜0.05）；與STA高劑量組比較，維替泊芬＋STA高劑量組大鼠腦組織含水量、腦指數顯著升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 "STA對各組大鼠腦組織神經元細胞損傷的影響

HE染色顯示，假手術組大鼠海馬組織結構正常，未見損傷；HIBD組大鼠海馬組織結構紊亂、萎縮，細胞排列錯亂，水腫變性；STA低、中、高劑量組大鼠海馬組織結構有所恢復，細胞排列整齊，形態有所恢復；維替泊芬＋STA高劑量組相比于STA高劑量組大鼠海馬組織結構損傷嚴重。尼氏染色顯示，假手術組大鼠海馬神經元細胞大而圓，排列整齊，細胞核周圍觀察到許多尼氏小體；與假手術組比較，HIBD組大鼠海馬組織可見形態不規則、體積相對較小的神經元細胞壞死、死亡和丟失，尼氏小體顯著減少（P＜0.05）；與HIBD組比較，STA低、中、高劑量組大鼠海馬神經元細胞恢復，尼氏小體顯著增加（P＜0.05）；與STA高劑量組比較，維替泊芬＋STA高劑量組大鼠神經元細胞損傷，尼氏小體減少（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.5 "STA對各組大鼠腦組織神經元細胞凋亡的影響

與假手術組比較，HIBD組大鼠神經元細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與HIBD組比較，STA低、中、高劑量組大鼠神經元細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與STA高劑量組比較，維替泊芬＋STA高劑量組大鼠神經元細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

2.6 "STA對各組大鼠Hippo-YAP信號通路蛋白表達的影響

與假手術組比較，HIBD組大鼠p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值顯著升高（P＜0.05），TAZ表達顯著降低（P＜0.05）；與HIBD組比較，STA低、中、高劑量組大鼠p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值顯著降低（P＜0.05），TAZ表達顯著升高（P＜0.05）；與STA高劑量組比較，維替泊芬+STA高劑量組p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值顯著升高（P＜0.05），TAZ表達顯著降低（P＜0.05）。詳見圖4、表6。

3 討論

由缺氧和大腦血液供應中斷引起的HIBD，是導致新生兒死亡和終身殘疾的主要原因之一[14]。盡管亞低溫治療對HIBD起到神經保護作用，但對兒童的預后改善作用有限。因此，需要發現新的治療藥物來改善預后。STA已被證明在各種神經系統疾病中表現出神經保護作用，SUN等[15]發現，STA能改善創傷性腦損傷大鼠神經功能、腦水腫和認知障礙，減少神經元細胞凋亡，起到神經保護作用；ZHANG等[16]發現，STA衍生物能顯著減少大腦中動脈閉塞模型大鼠的梗死體積，發揮神經保護作用；此外，張魯等[17]也發現，STA能夠通過改善HIBD新生大鼠腦梗死、腦細胞凋亡、氧化應激反應及神經元炎癥改善腦損傷。因此，STA可能對HIBD新生大鼠有神經保護作用。

HIBD的主要病理因素包括氧化應激、腦水腫、腦缺血再灌注、炎癥、線粒體功能障礙以及促凋亡機制的激活，導致神經元死亡，最終引發神經損傷[18]。其中腦缺血、缺氧會導致腦血流量減少，引發無氧代謝、細胞外氨基酸積累和細胞腫脹，導致線粒體功能障礙、大量活性氧產生以及細胞內鈣離子、各種炎癥因子的釋放，誘導神經元細胞凋亡[19]。本研究通過構建新生大鼠HIBD模型發現，HIBD大鼠海馬組織損傷嚴重，神經元細胞凋亡，神經功能和認知功能下降，表明HIBD發生時，腦組織受損嚴重，大量神經元細胞凋亡，進而導致神經損傷。STA已被報道能夠減少腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經功能障礙、神經元損傷，減少神經元凋亡[5]。本研究發現，STA治療后，大鼠海馬組織損傷減輕，神經功能缺損評分、腦組織含水量、腦指數、神經元細胞凋亡率均顯著下降，認知障礙減輕，表明STA提高了腦組織功能、神經功能和認知功能，抑制神經元損傷，對HIBD大鼠神經損傷有保護作用。

Hippo通路由MST1/2和腫瘤抑制因子1/2組成，YAP是Hippo通路的主要下游介質[20]。Hippo通路的激活導致MST1/2下游的YAP直接磷酸化失活，YAP/TAZ復合物解離，抑制細胞分化、遷移和信號轉導[21]。Hippo-YAP信號通路在中樞神經系統發育中發揮重要作用，已有研究發現，Hippo-YAP信號通路中YAP/TAZ活化可減少體內神經缺損、腦含水量、神經元死亡和凋亡以及腦梗死體積，對腦缺血/再灌注損傷大鼠有神經保護作用[22]。Hippo-YAP信號通路也參與新生兒腦病的發生發展，YAN等[9]發現，過表達Hippo信號通路中YAP1可減輕新生大鼠HIBD神經行為障礙和神經元損傷，減緩神經元凋亡，促進海馬神經元的細胞活力；LIN等[23]發現，氧-糖剝奪小鼠神經元細胞中YAP1蛋白水平受到抑制，導致神經元線粒體自噬受到抑制，出現腦功能失調。此外，Hippo信號通路對中樞神經系統發育的影響可能與其影響神經元細胞凋亡有關，當Hippo信號通路失活時，YAP/TAZ分子發生核易位，復合體轉錄抗凋亡基因并維持細胞存活和細胞增殖；而該通路的激活導致YAP磷酸化激活及YAP/TAZ核易位受限，磷酸化的YAP/TAZ留在細胞質中并進行蛋白水解降解，迫使細胞發生凋亡[24]。如在圍產期腦損傷動物（缺氧缺血性和宮內炎癥）模型中，細胞核YAP的減少和細胞內let-7b-5p的減少與神經元凋亡相關[25]。本研究發現，HIBD組大鼠海馬組織p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值顯著升高，TAZ表達顯著降低，表明缺血缺氧可能抑制腦組織中Hippo-YAP信號通路的激活，抑制神經元細胞增殖，促進凋亡，引發神經損傷。經STA治療后，p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值顯著降低，TAZ表達升高，表明STA可能通過激活腦組織Hippo-YAP信號通路，發揮神經保護作用。維替泊芬為YAP抑制劑，能夠抑制YAP與TEAD結合，抑制細胞增殖。本研究在STA高劑量組的基礎上使用維替泊芬，結果發現p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值升高，TAZ表達降低，且STA高劑量組對神經損傷的改善作用被逆轉。由此表明，STA對HIBD模型的神經保護作用可能與Hippo-YAP信號通路激活有關。

綜上所述，STA可能通過調控Hippo-YAP信號通路，減少神經損傷和神經元細胞凋亡，改善神經功能，發揮對HIBD新生大鼠的神經保護作用。本研究為STA在臨床上治療HIBD后腦損傷提供了實驗基礎，但HIBD涉及多種信號通路且與神經發生關系密切，后續還需進一步研究其他通路并探討STA對神經發育相關指標的影響。

參考文獻

[1] RUSS J B， SIMMONS R， GLASS H C. Neonatal encephalopathy： Beyond hypoxic-ischemic encephalopathy[J]. Neoreviews， 2021， 22（3）： e148-e162.

[2] ZHOU K Q， MCDOUALL A， DRURY P P， et al. Treating seizures after hypoxic-ischemic encephalopathy-current controversies and future directions[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（13）： 7121-7134.

[3] HU Y， CHEN F， XIANG X， et al. Early versus delayed enteral nutrition for neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy undergoing therapeutic hypothermia： A randomized controlled trial[J]. Italian Journal of Pediatrics， 2022， 48（1）： 146-159.

[4] LIAO L， TANG Y， LI B， et al. Stachydrine， a potential drug for the treatment of cardiovascular system and central nervous system diseases[J]. Biomed Pharmacother， 2023， 161（1）： 1-10.

[5] LI L，SUN L， QIU Y， et al. Protective effect of stachydrine against cerebral ischemia-reperfusion injury by reducing inflammation and apoptosis through P65 and JAK2/STAT3 signaling pathway[J]. Frontiers in Pharmacology， 2020， 11（1）： 64-77.

[6] WEI X， HUANG G， LIU J， et al. An update on the role of Hippo signaling pathway in ischemia-associated central nervous system diseases[J]. Biomed Pharmacother， 2023， 162（1）： 2-11.

[7] GONG S， MA H， ZHENG F， et al. Inhibiting YAP in endothelial cells from entering the nucleus attenuates blood-brain barrier damage during ischemia-reperfusion injury[J]. Frontiers in Pharmacology， 2021， 12（1）： 1-13.

[8] GONG P， ZHANG Z， ZOU C， et al. Hippo/YAP signaling pathway mitigates blood-brain barrier disruption after cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Behavioural Brain Research， 2019， 356（1）： 8-17.

[9] YAN G， TAO Z， XING X， et al. Down-regulated microRNA-192-5p protects against hypoxic-ischemic brain damage via regulation of YAP1-mediated Hippo signaling pathway[J]. Neurochemical Research， 2022， 47（5）： 1243-1254.

[10] 趙玉霞， 陳鶯倩.迷迭香酸通過AMPK/mTOR通路減輕新生大鼠缺血缺氧性腦損傷研究[J]. 中草藥， 2021， 52（22）： 6897-6903.

[11] YU N， HU S， HAO Z. Benificial effect of stachydrine on the traumatic brain injury induced neurodegeneration by attenuating the expressions of Akt/mTOR/PI3K and TLR4/NF-κB pathway[J]. Translational Neuroscience， 2018， 9（1）： 175-182.

[12] LIANG L， "XU W， "SHEN A， "et al. Inhibition of YAP1 activity ameliorates acute lung injury through promotion of M2 macrophage polarization[J]. MedComm， 2023， 4（3）： e293-e310.

[13] ROTHER J. Neuro protection does not work[J]. Stroke， 2008， 39（2）： 523-524.

[14] VICTOR S， ROCHA-FERREIRA E， RAHIM A， et al. New possibilities for neuroprotection in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy[J]. European Journal of Pediatrics， 2022， 181（3）： 875-887.

[15] SUN M， AN Z， WEI H， et al. Xenon attenuates hypoxic-ischemic brain damage by inhibiting autophagy in neonatal rats[J]. Neuroreport， 2023， 34（5）： 273-279.

[16] ZHANG L， LI F， HOU C， et al. Design， synthesis， and biologi？鄄

cal evaluation of novel stachydrine derivatives as potent neuroprotective agents for cerebral ischemic stroke[J]. Naunyn-schmiedebergs Archives of Pharmacology， 2020， 393（12）： 2529-2542.

[17] 張 "魯. 水蘇堿改善新生大鼠腦組織缺血損傷的相關研究[D].濟南： 山東大學， 2017.

[18] SECHI G P， BARDANZELLU F， PINTUS MC， et al. Thiamine as a possible neuroprotective strategy in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy[J]. Antioxidants （Basel）， 2021， 11（1）： 42-56.

[19] CHEN T， HU Y， "LU L， et al. Myricetin attenuates hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats via NRF2 signaling pathway[J]. Frontiers in Pharmacology， 2023， 14（1）： 1-17.

[20] FU M， HU Y， LAN T， et al. The Hippo signalling pathway and its implications in human health and diseases[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2022， 7（1）： 376.

[21] ZHENG M， LI RG， SONG J， et al. Hippo-Yap signaling maintains sinoatrial node homeostasis[J]. Circulation， 2022， 146（22）： 1694-1711.

[22] GONG P， ZOU Y， ZHANG W， et al. The neuroprotective effects of insulin-like growth factor 1 via the Hippo/YAP signaling pathway are mediated by the PI3K/AKT cascade following cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Brain Research Bulletin， 2021， 177（1）： 373-387.

[23] LIN C， LI L， XU Q， et al. Yap1-Usp14 axis inhibits neuronal mitophagy during neonatal hypoxia-ischemia encephalopathy by regulation of beclin-1 ubiquitination in mouse[J]. Molecular Neurobiology， 2023， 60（8）： 4273-4287.

[24] SAHU M R， MONDAL A C. Neuronal Hippo signaling： From development to diseases[J]. Developmental Neurobiology， 2021， 81（2）： 92-109.

[25] PONNUSAMY V， IP RTH， MOHAMED MAEK， et al. Neuronal let-7b-5p acts through the Hippo-YAP pathway in neonatal encephalopathy[J]. Communications Biology， 2021， 4（1）： 1143.