脫氫卡維丁對CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的改善作用

〔摘要〕 目的 探討脫氫卡維丁對四氯化碳（carbon tetrachloride， CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的改善作用及可能機(jī)制。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、水飛薊賓組（30 mg/kg）、脫氫卡維丁組（50 mg/kg），每組6只。除正常組外，其他各組采用30% CCl4橄欖油溶液（1 mL/kg）腹腔注射復(fù)制肝纖維化模型，每周2次，連續(xù)14周。各給藥組于造模第13、14周每天按設(shè)定劑量灌胃相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)。正常組與模型組大鼠灌胃等體積的生理鹽水。末次給藥12 h后，測定各組大鼠肝脾指數(shù)；采用HE染色與Masson染色觀察肝組織病理學(xué)變化，比色法檢測大鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）的含量；采用ELISA檢測血清透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）、層黏連蛋白（laminin， LN）、Ⅲ型前膠原蛋白（type Ⅲ procollagen， PCⅢ）及Ⅳ型膠原蛋白（collagen Ⅳ， Col Ⅳ）的表達(dá)水平；Western blot法檢測肝組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠肝脾指數(shù)顯著增加（P＜0.001），肝組織纖維化進(jìn)展明顯，膠原容積分?jǐn)?shù)明顯增加（P＜0.001），血清中ALT、AST、MDA、LN、HA、PCⅢ和Col Ⅳ水平顯著升高（P＜0.001），SOD明顯下降（P＜0.001）；肝組織TGF-β1、α-SMA及N-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯上升（P＜0.001），E-cadherin蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.001）。與模型組比較，脫氫卡維丁組大鼠肝脾指數(shù)明顯降低（P＜0.001），肝組織病理學(xué)損傷和纖維增生有效改善，膠原容積分?jǐn)?shù)明顯下降（P＜0.001），血清ALT、AST、MDA含量顯著降低（P＜0.001），血清SOD的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001），LN、HA、PCⅢ、Col Ⅳ的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.001），肝組織TGF-β1、α-SMA和N-cadherin蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.001），而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.001）。結(jié)論 脫氫卡維丁對肝纖維化大鼠具有良好的改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)、下調(diào)N-cadherin、α-SMA、TGF-β1蛋白表達(dá)及上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 脫氫卡維丁；肝纖維化；氧化應(yīng)激；E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白；α-平滑肌肌動蛋白；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

〔中圖分類號〕R285.5 " " " " 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.007

Alleviating effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in rats

QIN Ni1，2， ZHOU Liu1，2， LI Junwei1，2， WU Teng1， LI Qiuping1， TAO Xiaojing1， HUANG Lingcong1，

WEI Xiling1， ZHANG Hongping1，2， LU Shiyin1，2*

1. Liuzhou Key Laboratory for Preparation Development of Chinese Medicines （Zhuang and Yao Medicines）， Liuzhou Chinese Medical Hospital （Liuzhou Hospital of Zhuang Medicine）， Liuzhou， Guangxi 545026， China; 2. Liuzhou Engineering Technology Research Center for Preparation Development of Chinese Medicines （Zhuang and Yao Medicines）， Liuzhou Chinese Medical Hospital （Liuzhou Hospital of Zhuang Medicine）， Liuzhou， Guangxi 545026， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the alleviating effects and their possible mechanism of dehydrocavidine on carbon tetrachloride （CCl4）-induced hepatic fibrosis in rats. Methods SD rats were randomized into normal group， model group， silibinin group （30 mg/kg）， and dehydrocavidine group （50 mg/kg）， with six rats in each group. Except for normal group， the other three groups were injected intraperitoneally with 30% CCl4 olive oil solution （1 mL/kg） to establish the hepatic fibrosis model， twice a week for 14 weeks. At the 13th and 14th weeks of modeling， each medication group was given the corresponding drug at the set dose intragastrically every day. Meanwhile， normal and model groups were given the equal volume of normal saline intragastrically. After 12 h of the last administration， the rat hepatic and splenic tissue were collected to measure the hepatic and splenic indexes; HE staining and Masson staining were used to observe the histopathological changes of the liver; colorimetric method was carried out to determine the content of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， malondialdehyde （MDA）， and superoxide dismutase （SOD） in rat serum. ELISA was performed to measure the expression levels of serum hyaluronic acid （HA）， laminin （LN）， type Ⅲ procollagen （PCⅢ） and collagen Ⅳ （Col Ⅳ）; Western blot was applied to examining the protein expression levels of transforming growth factor β1 （TGF-β1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， E-cadherin， and N-cadherin in the liver tissue. Results Compared with normal group， the hepatic and splenic indexes of rats in model group significantly increased （Plt;0.001）， the degree of hepatic fibrosis was remarkable， and the collagen volume fraction was significantly elevated （Plt;0.001）; meanwhile， the serum levels of ALT， AST， MDA， LN， HA， PCⅢ， and Col Ⅳ were fairly higher （Plt;0.001）， while the level of SOD was obviously lower （Plt;0.001）; the protein expression levels of TGF-β1， α-SMA， and N-cadherin in the liver tissue were significantly up-regulated （Plt;0.001）， while that of E-cadherin was obviously down-regulated （Plt;0.001）. Compared with model group， the hepatic and splenic indexes of rats in dehydrocavidine group were significantly reduced （Plt;0.001）， the histopathological damage and fibrous hyperplasia were effectively alleviated， and the collagen volume fraction decreased significantly （Plt;0.001）; the serum levels of ALT， AST， and MDA were significantly lower （Plt;0.001）， while that of SOD was significantly higher （Plt;0.001）; the serum expression levels of LN， HA， PCⅢ， and Col Ⅳ were obviously up-regulated （Plt;0.05， Plt;0.001）; the protein expression levels of TGF-β1， α-SMA， and N-cadherin in the liver tissue markedly decreased （Plt;0.001）， while that of E-cadherin significantly increased （Plt;0.001）. Conclusion Dehydrocavidine can alleviate hepatic fibrosis in rats significantly， the mechanism of which may be related to the intervention in the oxidative stress， down-regulation of N-cadherin， α-SMA， and TGF-β1 protein expressions， and up-regulation of E-cadherin protein expression in the liver tissue.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 dehydrocavidine; hepatic fibrosis; oxidative stress; E-cadherin; N-cadherin; α-smooth muscle actin; transforming growth factor β1

肝纖維化是諸多有害因素造成的持久的慢性肝損傷時，機(jī)體產(chǎn)生自我修復(fù)反應(yīng)進(jìn)程中誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell， HSC）激活并大量增殖，進(jìn)而導(dǎo)致肝內(nèi)彌散性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）過度積聚的病理進(jìn)程，若未及早干預(yù)可發(fā)展為肝硬化和肝癌[1]。據(jù)報道，肝纖維化和早期肝硬化可經(jīng)干預(yù)手段逆轉(zhuǎn)[2]。因此，緩解乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的惡化對防治與改善慢性肝病具有重大現(xiàn)實(shí)意義。HSC活化轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，后者分泌大量ECM，此過程被認(rèn)為是肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）為HSC轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的重要機(jī)制[4]。因此，調(diào)控EMT過程中的關(guān)鍵分子和信號通路是治療肝纖維化的潛在重要靶點(diǎn)。

壯醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，肝纖維化及肝硬化均屬“蠱病”范疇，肝纖維化由于蠱病日久，濕毒熱毒漸消，蠱毒停滯于龍路火路，在腹中瘀積結(jié)塊所致[5]；因而疏通龍路火路為主要治療手段，輔以祛濕清熱解毒以從整體發(fā)揮療效。壯藥巖黃連Corydalis saxicola

Bunting為壯族民間常用于治療肝病的草藥，專用于疏通龍路火路、清除熱毒濕毒，是壯醫(yī)治療蠱毒、腹部硬塊的良藥，具有清熱解毒、利濕、抗炎、保肝、止痛等功效[6]。結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論“肝腎同源，腎生髓、髓生肝”，若遵循“理氣、補(bǔ)腎、祛瘀解毒”的治療原則，則可更好地協(xié)同抗肝纖維化作用，修復(fù)損傷的肝細(xì)胞，抑制炎癥因子表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體免疫，從而改善肝纖維化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，以脫氫卡維丁為代表的巖黃連總生物堿能保肝護(hù)肝、改善肝臟的功能，對急慢性肝損傷具有較好的保護(hù)作用[7-8]；此外，脫氫卡維丁可通過抑制HSC活化而抗肝纖維化[9]。然而，有關(guān)脫氫卡維丁抗肝纖維化的作用機(jī)制鮮見報道。為此，基于前期的研究基礎(chǔ)，本研究采用CCl4誘導(dǎo)復(fù)制大鼠肝纖維化模型，以水飛薊賓為陽性對照藥物，從EMT的角度進(jìn)一步探討脫氫卡維丁在大鼠模型中的抗肝纖維化效果及其可能機(jī)制，為脫氫卡維丁抗肝纖維化的研究與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 "動物

24只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（120±20） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001。采用標(biāo)準(zhǔn)大鼠籠飼養(yǎng)于條件良好的動物房，12 h光照晝夜循環(huán)，溫度20～25 ℃，相對濕度55%～65%。自由攝食標(biāo)準(zhǔn)飼料及滅菌注射用水。

1.2 "藥物與主要試劑

脫氫卡維丁（批號：111667-200401，中國食品藥品檢定研究院）；水飛薊賓膠囊（批號：150709063，天津天力士圣特制藥有限公司）；CCl4（批號：20210422，天津博迪生化股份有限公司）；橄欖油（批號：20190711，山東魯花集團(tuán)商貿(mào)有限公司）；ALT（批號：20210419）、AST（批號：20210420）、MDA（批號：20210417）和SOD（批號：20210420）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛（批號：21235935，廣州賽國生物科技有限公司）；HE染色液（批號：20210419）、Masson染色液（批號：20210707）均購自北京索萊寶科技有限公司；透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）、層粘連蛋白（laminin， LN）、Ⅲ型前膠原（type Ⅲ procollagen， PCⅢ）及Ⅳ型膠原（collagen Ⅳ， Col Ⅳ）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號均為20220310，武漢貝茵萊生物科技有限公司）；兔抗TGF-β1（批號：150203）、α-SMA（批號：140202）、E-cadherin（批號：150205）、N-cadherin（批號：140301）一抗均購自美國Abcam公司；兔抗β-actin一抗（批號：150303，美國CST公司）；Western快速凝膠試劑盒（批號：090222

220909，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 "主要儀器

Bio-Rad 680 iMark型酶標(biāo)儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；SC-20電熱恒溫水浴鍋（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGD-20MC高速低溫離心機(jī)（長沙湘銳離心機(jī)有限公司）；JY2002電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；IMS-130制冰機(jī)（常熟雪科制冷設(shè)備有限公司）；DYCZ-24DN雙垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；YB-6LF生物組織石蠟包埋機(jī)（孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；RM2235石蠟切片機(jī)（德國LAICA公司）；MI52-N倒置顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）；DG5033A酶聯(lián)免疫檢測儀（南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）；Tanon-5200全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）；TD5臺式離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；GWB-1超純水器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

2 方法

2.1 "動物分組、造模及給藥

大鼠自由攝食飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、脫氫卡維丁組（50 mg/kg，預(yù)實(shí)驗(yàn)劑量為25、50 mg/kg，結(jié)果提示50 mg/kg改善肝纖維化作用較顯著，故本研究采用50 mg/kg作為脫氫卡維丁給藥劑量）和水飛薊賓組[10]（陽性對照，30 mg/kg）組，每組6只。除正常組大鼠腹腔注射橄欖油（1 mL/kg）外，其余各組分別于大鼠腹腔注射30% CCl4橄欖油混合液（1 mL/kg）以建立肝纖維化模型[11]，每周2次，連續(xù)14 周，于第12周末解剖模型組大鼠1只，通過HE及Masson肝組織病理染色確認(rèn)造模成功。各給藥組在造模第13周按設(shè)定劑量（10 mL/kg）每天給予大鼠灌胃相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食飲水，每天觀察各組大鼠活動情況，每周稱定質(zhì)量1次。大鼠末次給藥后，禁食12 h。采用3%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，腹主動脈采血，3 500 r/min離心（半徑5 cm）15 min取血清，于-80 ℃超低溫冰箱保存待檢。完成血樣采集后處死大鼠，取出肝臟和脾臟并用預(yù)冷生理鹽水清洗后，濾紙拭干，稱重，計算肝（脾）臟指數(shù)，臟器指數(shù)（%）＝臟器濕重（g）/體質(zhì)量（g）×100%。取適量肝組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，其余肝臟置于-80 ℃超低溫冰箱保存待用。

2.2 "肝組織病理學(xué)觀察

取肝臟組織右葉同一位置約1 cm3大小，常規(guī)4％多聚甲醛液固定，脫水，石蠟包埋，切片（厚度約為3 μm），經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇常規(guī)逐級脫水，蘇木精染液染色，洗掉多余的染液后用0.5%鹽酸乙醇分色，分別行HE染色和Masson染色，再次乙醇常規(guī)逐級脫水，二甲苯透明后采用中性樹膠封片，通過顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。以Image J軟件測定膠原纖維面積，計算膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF=膠原陽性的藍(lán)色面積/總面積）。

2.3 "大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的檢測

取分離好的大鼠血清，應(yīng)用比色法檢測血清中ALT、AST、MDA、SOD的水平，采用ELISA法檢測血清中HA、LN、PCⅢ、Col Ⅳ的含量。上述指標(biāo)均嚴(yán)格遵照檢測試劑盒步驟操作，并于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定。

2.4 "Western blot檢測肝組織TGF-β1、α-SMA、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達(dá)

各組隨機(jī)抽取3個標(biāo)本，稱量肝組織塊體質(zhì)量，剪碎后加入組織蛋白提取試劑，提取總蛋白，檢測各樣本蛋白含量。根據(jù)目的蛋白分子量大小配制合適的SDS-PAGE分離膠，蛋白經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉后與相應(yīng)目的蛋白一抗（1∶1 500）在4 ℃條件下孵育過夜。洗滌后置于二抗（1∶3 000）中孵育1 h。洗滌后進(jìn)行ECL發(fā)光顯影與定影。通過DU 4圖像分析軟件測定蛋白條帶的灰度值以做定量分析，以內(nèi)參β-actin作為參考，結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參的積分光密度值的比值表示。

2.5 "統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較使用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 "脫氫卡維丁對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

正常組大鼠狀態(tài)良好、皮毛光亮，飲食、排便均正常，體質(zhì)量增長穩(wěn)定。與正常組相比，模型組大鼠毛發(fā)顯著發(fā)黃、粗糙，食欲減退，排便稀爛，活躍度降低，體質(zhì)量長勢緩慢。而脫氫卡維丁組和水飛薊賓組大鼠毛色、精神狀態(tài)、食欲和體質(zhì)量增長等較模型組明顯改善。如表1所示，實(shí)驗(yàn)后，相比于正常組，模型組大鼠體質(zhì)量較小（P＜0.001），肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.001）；與水飛薊賓組比較，脫氫卡維丁組體質(zhì)量較大（P＜0.05）。與模型組比較，脫氫卡維丁組及水飛薊賓組肝纖維化大鼠肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.001），且脫氫卡維丁組低于水飛薊賓的作用（P＜0.05）。

3.2 "脫氫卡維丁對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠血清生化指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST與MDA水平明顯上升（P＜0.001），SOD水平顯著下降（P＜0.001），表明CCl4造成了大鼠肝損傷。相較于模型組，經(jīng)脫氫卡維丁組干預(yù)后和水飛薊賓大鼠血清中ALT、AST與MDA含量顯著下降（P＜0.05，P＜0.001），血清SOD水平顯著提高（P＜0.001）。相較于水飛薊賓組，脫氫卡維丁組對ALT、AST、MDA與SOD調(diào)控改善作用更強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.001）。詳見表2。

3.3 "脫氫卡維丁對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Col Ⅳ表達(dá)的調(diào)控作用

與正常組比較，模型組血清中HA、LN、PCⅢ和Col Ⅳ水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，水飛薊賓組、脫氫卡維丁組血清中HA、LN、PCⅢ和Col Ⅳ含量明顯下降（P＜0.05、P＜0.001），且脫氫卡維丁組上述指標(biāo)含量明顯低于水飛薊賓組（P＜0.001）。詳見表3。

3.4 "脫氫卡維丁對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織病理變化的影響

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，未見病理性纖維組織增生。與正常組相比，模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂明顯，肝細(xì)胞排列紊亂，可見細(xì)胞空泡變性與細(xì)胞壞死增加，纖維間隔內(nèi)發(fā)生明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，纖維化顯著。脫氫卡維丁組與水飛薊賓組對CCl4所致大鼠肝纖維化均有改善，且脫氫卡維丁組效果較水飛薊賓組更為突出。詳見圖1。

如圖2所示，Masson染色可見正常組大鼠肝組織有輕微被染成藍(lán)色的膠原纖維，未發(fā)現(xiàn)病理性改變。模型組可觀察到明顯、大量致密藍(lán)染膠原沉積，肝臟匯管區(qū)纖維組織明顯增生，且纖維間隔增大，部分已形成假小葉及膠原纖維束。與模型組比較，脫氫卡維丁組與水飛薊賓組有不同程度的改善與逆轉(zhuǎn)，膠原纖維增生范圍顯著減少、變細(xì)，膠原容積分?jǐn)?shù)明顯減少（Plt;0.001），其中脫氫卡維丁組膠原容積分?jǐn)?shù)小于水飛薊賓組（Plt;0.05）。詳見表4。

3.5 "脫氫卡維丁對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織內(nèi)E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、TGF-β1蛋白相對表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組大鼠N-cadherin、α-SMA、TGF-β1蛋白表達(dá)增加明顯（P＜0.001），E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.001）。與模型組比較，水飛薊賓組和脫氫卡維丁組N-cadherin、α-SMA、TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.001）；E-cadherin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001）。與水飛薊賓組比較，脫氫卡維丁組誘導(dǎo)E-cadherin、抑制N-cadherin及α-SMA蛋白表達(dá)作用更強(qiáng)，具有顯著差異（P＜0.001）。詳見表5、圖3。

4 討論

肝纖維化通常由病毒、代謝、損傷等因素誘發(fā)慢性肝病所引起，若未采取干預(yù)而任其發(fā)展，可發(fā)展為肝硬化、肝癌；同時，肝纖維化作為影響慢性肝病預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對肝病患者的健康及生存質(zhì)量影響密切[12]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝纖維化的病理學(xué)基礎(chǔ)為ECM的合成異常增多，導(dǎo)致膠原在肝臟中過度沉積，而HSC是肝臟合成ECM的主要細(xì)胞[13]。HSC的活化和增殖在肝纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[14]。然而，尚未找到治療肝纖維化的有效方法，地方特色民族醫(yī)藥因其對肝纖維化的良好防治效果及低毒性反應(yīng)等優(yōu)勢，越發(fā)引起關(guān)注與重視。肝纖維化在壯醫(yī)醫(yī)學(xué)中歸屬于“咪疊蠱病”范疇，壯醫(yī)認(rèn)為“咪疊蠱”發(fā)生與進(jìn)展是由于人體正氣虧虛，熱毒入侵機(jī)體并滯留于肝臟[15]，壯藥巖黃連為清熱解毒、利濕、通絡(luò)止痛，常用于主治肝纖維化、肝硬化及肝癌的藥材。前期研究發(fā)現(xiàn)，巖黃連總生物堿具有良好的抗肝纖維化作用，且生物堿成分脫氫卡維丁抗肝纖維化作用較強(qiáng)，然而，有關(guān)脫氫卡維丁抗肝纖維化的作用與機(jī)制尚未明確。基于此，本實(shí)驗(yàn)將脫氫卡維丁對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的改善效果及可能作用機(jī)制開展初步研究。水飛薊賓作為臨床治療肝纖維化的常用藥，在抗炎、抗氧化、抗肝纖維化方面作用較好[16]，故選其作為本研究的陽性對照藥物。

本研究采用經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動物肝纖維化模型誘導(dǎo)劑CCl4，其在體內(nèi)對肝細(xì)胞具有靶向性破壞作用，進(jìn)而引起毒性三氯甲基自由基激發(fā)炎癥反應(yīng)，激活HSC后產(chǎn)生過量ECM，最終導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷[17]。ALT、AST為評價肝損傷的典型標(biāo)志[18]。MDA是機(jī)體中自由基參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)時的終產(chǎn)物，MDA異常升高可嚴(yán)重?fù)p壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹與壞死[19]。SOD作為關(guān)鍵的抗氧化酶之一，可有效清除機(jī)體中的自由基，從而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)物的生成，發(fā)揮自身保護(hù)作用[20]。本研究造模14周后，病理組織學(xué)結(jié)果表明，模型組大鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的損傷與纖維化，且血清ALT、AST含量明顯升高。經(jīng)脫氫卡維丁干預(yù)后，上述血清生化指標(biāo)、肝組織病理損傷及纖維化病變均具有較大程度的改善。同時，脫氫卡維丁可修正CCl4誘導(dǎo)的大鼠血清脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA和SOD水平。提示調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善肝脂質(zhì)過氧化損傷以及提高抗氧化酶活性是脫氫卡維丁保肝作用的機(jī)制之一。

HA為HSC合成的ECM的主要成分，機(jī)體血清中HA含量異常增加可提示HSC的活躍程度；LN為HSC合成的一種糖蛋白，在肝纖維化病理進(jìn)展中，血清LN濃度與纖維化進(jìn)程密切相關(guān)；體內(nèi)合成膠原蛋白時，PCⅢ經(jīng)酶誘導(dǎo)釋放到血清中，常用于ECM沉積程度的判定；Col Ⅳ作為肝組織ECM的重要組成部分，其血清水平與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[21]。因此，血清HA、LN、PCⅢ和Col Ⅳ的含量可作為肝纖維化的診療指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，脫氫卡維丁干預(yù)可有效抑制肝纖維化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Col Ⅳ的表達(dá)，提示脫氫卡維丁對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有良好的改善作用。

上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程稱為EMT，主要包括細(xì)胞黏附連接蛋白E-cadherin減少，間質(zhì)細(xì)胞特征如細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、α-SMA等水平顯著升高[22]。TGF-β信號通路可調(diào)節(jié)EMT過程[23]。TGF-β1具有激活HSC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，抑制TGF-β1表達(dá)可延緩肝纖維化進(jìn)展[24]。α-SMA是HSC活化的特異性標(biāo)志蛋白，其表達(dá)增加可促進(jìn)肝纖維化和肝損傷程度，成為預(yù)測肝硬化甚至肝癌進(jìn)展的有效指標(biāo)[25]。HSC活化前表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin，活化后E-cadherin表達(dá)受抑制，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin水平上升，同時分泌Ι型膠原。由此可見，EMT與肝纖維化的進(jìn)程高度相關(guān)。因此，調(diào)控EMT發(fā)生、發(fā)展是改善和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的一種重要手段。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組肝纖維化組織TGF-β1、α-SMA和N-cadherin蛋白表達(dá)增加，E-cadherin蛋白含量減少；經(jīng)過脫氫卡維丁干預(yù)后，肝組織TGF-β1、α-SMA和N-cadherin蛋白水平下調(diào)，E-cadherin蛋白含量升高。說明脫氫卡維丁可有效抑制HSC的活化，對肝纖維化有一定的抑制作用，提示脫氫卡維丁可能通過抑制EMT而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

綜上所述，脫氫卡維丁對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，脫氫卡維丁能抑制肝纖維組織增生，改善肝功能，其抗肝纖維化機(jī)制可能與下調(diào)N-cadherin、α-SMA、TGF-β1的蛋白表達(dá)，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞EMT有關(guān)。本研究為脫氫卡維丁抗肝纖維化的開發(fā)利用奠定了科學(xué)依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍有待后續(xù)深入研究。

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