基于網絡藥理學、分子對接、實驗研究探討白屈菜治療鼻咽癌的物質基礎及潛在機制

〔摘要〕 目的 運用網絡藥理學和分子對接技術預測白屈菜抗鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）的作用靶點和機制，并通過實驗驗證主要活性成分對NPC細胞增殖和凋亡的影響。方法 借助在線數據平臺TCMSP、ETCM和BATMAN-TCM檢索白屈菜的化學成分和作用靶點。通過 GEO數據庫檢索NPC相關靶點，生信在線工具分析白屈菜與NPC的交集靶點。使用STRING構建共同靶點的PPI網絡，運用Cytoscape 3.7.1獲得核心靶點。通過R軟件編程進行 GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析。分子對接分析核心靶點與主要活性成分之間的結合情況。實驗驗證：（1）將5-8F細胞分為溶劑對照組、血根堿（2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1）組、白屈菜紅堿（2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1）組、順鉑4 μg·mL-1組。MTT檢測白屈菜主要活性成分對NPC細胞增殖的影響。（2）將5-8F細胞分為溶劑對照組、血根堿5 μmol·L-1組、白屈菜紅堿5 μmol·L-1組、順鉑4 μg·mL-1組；Annexin-V FITC/PI雙熒光染色法檢測細胞凋亡；Western blot檢測白屈菜主要活性成分對NPC細胞增殖、凋亡、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路關鍵蛋白的影響。結果 檢索得到白屈菜37個主要活性成分和1 419個作用靶點。檢索GEO數據庫共收集到7 852個NPC疾病基因，白屈菜與NPC共有327個交集靶點，其中核心靶基因共10個，分別是EGFR、TP53、VEGFA、TNF、FN1、MMP9、JUN、FGF2、LYN、F2。GO分析主要涉及泛素蛋白連接酶結合、硫化物結合、整合素結合、肝素結合和糖胺聚糖結合，KEGG分析主要涉及MAPK、PI3K/AKT信號通路等，分子對接結果顯示核心靶點與對應的活性成分具有良好的結合能力。實驗驗證顯示，與溶劑對照組相比，血根堿和白屈菜紅堿均明顯降低NPC細胞相對增殖率（P＜0.01），并提高細胞凋亡率（P＜0.01），且血根堿和白屈菜紅堿降低5-8F細胞中XIAP、PCNA、ERK1/2、AKT的蛋白表達水平（P＜0.05或P＜0.01）。結論 白屈菜可通過多成分、多靶點和多通路發揮抗NPC的作用，且經實驗驗證，血根堿和白屈菜紅堿均可抑制NPC細胞增殖并誘導凋亡，其機制可能與MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路有關。

〔關鍵詞〕 鼻咽癌；網絡藥理學；分子對接；白屈菜；MAPK信號通路；PI3K/AKT信號通路

〔中圖分類號〕R285 " " " " 〔文獻標志碼〕A " " " " "〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.02.015

Material basis and potential mechanism of Baiqucai （Chelidonii Herba） in treating nasopharyngeal carcinoma based on network pharmacology， molecular docking， and experimental research

CHEN Sirui1， WU Tianhong1， LIU Jie1，2， ZHANG Wenqing1，2， Yao Jingxin1， HE Yingchun1，2*，

SHI Hongjian1， WANG Xianwen2，3， FAN Jingying1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Key Laboratory for Prevention amp; Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

3. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To predict the action targets and mechanism of Baiqucai （Chelidonii Herba） against nasopharyngeal carcinoma （NPC） by network pharmacology and molecular docking techniques， and to verify the effects of its main active ingredients on the proliferation and apoptosis of NPC cells through experiments. Methods Through the online platforms of TCMSP， ETCM， and BATMAN-TCM， the chemical constituents and action targets of Baiqucai （Chelidonii Herba） were searched. The relevant targets of NPC were retrieved through the GEO database， and the intersection targets of Baiqucai （Chelidonii Herba） and NPC were analyzed by Shengxin online tool. STRING was used to build a protein-protein interaction （PPI） network of the common targets， and Cytoscape 3.7.1 was used to obtain core targets. GO function and KEGG pathway enrichment analyses were performed by R software programming. The condition of binding between the core targets and the main active ingredients was analyzed by molecular docking. Experimental verification： （1） 5-8F cells were divided into solvent control， sanguinarine （2.5 μmol·L-1， 5 μmol·L-1）， chelerythrine （2.5 μmol·L-1， 5 μmol·L-1）， and cisplatin 4 μg·mL-1 groups; MTT was used to test the effects of the main active ingredients of Baiqucai （Chelidonii Herba） on the proliferation of NPC cells. （2） 5-8F cells were divided into solvent control， sanguinarine 5 μmol·L-1， chelerythrine 5 μmol·L-1， and cisplatin 4 μg·mL-1 groups; apoptosis was determined by Annexin-V FITC/PI double fluorescence staining; Western blot was used to measure the effects of the main active ingredients on the proliferation， apoptosis， as well as the key proteins of mitogen-activated protein kinase （MAPK） and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B （AKT） signaling pathways of NPC cells. Results A total of 37 main active ingredients and 1 419 action targets of Baiqucai （Chelidonii Herba） were obtained. A total of 7 852 NPC disease genes were collected by searching the GEO database. There were 327 intersection targets between Baiqucai （Chelidonii Herba） and NPC， among which ten core target genes were EGFR， TP53， VEGFA， TNF， FN1， MMP9， JUN， FGF2， LYN， and F2. GO analysis mainly involved ubiquitin protein ligase binding， ubiquitin-like protein ligase binding， sulfur compound binding， integrin binding， heparin binding， and glycosaminoglycan binding. KEGG analysis mainly involved MAPK and PI3K/AKT signaling pathways. Molecular docking showed that the core targets had good binding ability with corresponding active ingredients. The experimental verification showed that compared with the solvent control group， sanguinarine and chelerythrine significantly reduced the relative proliferation rate of NPC cells （Plt;0.01）， increased the apoptosis rate （Plt;0.01）， and decreased the protein expression levels of XIAP， PCNA， ERK1/2， and AKT in 5-8F cells （Plt;0.05 or Plt;0.01）. Conclusion Baiqucai （Chelidonii Herba） can play an anti-NPC role through multi-component， multi-target， and multi-pathway， and it has been verified by experiments that sanguinarine and chelerythrine can both inhibit the proliferation of NPC cells and induce apoptosis， the mechanism of which may be related to MAPK and PI3K/AKT signaling pathways.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 nasopharyngeal carcinoma： network pharmacology; molecular docking; Baiqucai （Chelidonii Herba）; MAPK signaling pathway; PI3K/AKT signaling pathway

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其惡性程度高，70%的患者被確診時已是晚期[1-2]。以放療和化療相結合的綜合治療是目前治療NPC的主要方法，但復發和遠處轉移仍是治療失敗的主要原因[3]。目前，中醫藥抗腫瘤藥物日益受到關注，因其與化療藥物相比，在抑殺腫瘤細胞的同時，具有毒副作用小、不易產生耐藥性等優勢[4]。

白屈菜主產區位于我國東北部，是罌粟科屬植物白屈菜的干燥全草，其性涼、味苦、有毒。白屈菜最早記載于《救荒本草》[5]，具有止咳平喘、消腫、利尿、鎮痛、解毒之功效。現代研究表明，白屈菜的生物活性成分在治療癌癥、呼吸道疾病、肝纖維化等方面具有研究價值[6]。且隨著人工栽培及加工技術的提高，白屈菜的產量將在未來足以提供臨床藥用[7]，這使其具有較高的商業前景。圍繞白屈菜的抗腫瘤活性，研究發現其主要化學活性成分為異喹啉類生物堿，實驗證實[8-9]，白屈菜的有效成分可通過多途徑抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡。目前，白屈菜已用于治療多種腫瘤，如胃癌、食管癌、肝膽腫瘤和各種中晚期腫瘤腹轉移等[10]。白屈菜的活性成分白屈菜紅堿被證實在非小細胞肺癌[11]、宮頸癌[12]等腫瘤中，都具有較好的療效，但在NPC領域尚未被廣泛應用。而另一主要活性成分血根堿在NPC領域中的相關研究報道也較少見。目前，白屈菜治療NPC的物質基礎及作用機制尚不明確。

因此，本研究基于網絡藥理學，構建白屈菜的活性成分、NPC與藥物靶點之間的相互作用網絡，借助分子對接技術分析白屈菜主要活性成分與核心靶點的結合情況，最后通過實驗驗證白屈菜主要活性成分對NPC的作用，為揭示白屈菜治療NPC的物質基礎及潛在分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 "白屈菜作用靶點的篩選

在TCMSP（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）、ETCM （http：//www.tcmip.cn/ETCM/）、BATMAN-TCM數據庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/

Home/Index/index），輸入關鍵詞“Baiqucai”“Chelidonium majus”，BATMAN-TCM數據庫選擇score＞5的靶點，合并上述結果得到白屈菜的活性成分和作用靶點，并通過UniProt數據中reviewed（Swiss-Prot）and Human矯正。

1.2 "NPC靶點的篩選

選擇GEO數據庫中與NPC相關的轉錄組數據集，分別為GSE68799、GSE118719、GSE134884，具體信息見表1。通過R語言V 4.1.3“DEseq2”“limma”等分析3個轉錄組，選擇P＜0.05，|log2FC|＞1的基因為差異基因，合并所有差異基因為NPC靶點。最后，將白屈菜相關靶點與NPC相關靶點通過生信在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）進行韋恩圖映射，獲得白屈菜治療NPC作用的交集靶點。

1.3 "白屈菜治療NPC模塊靶點的篩選及其PPI網絡構建

將映射后獲得的白屈菜治療NPC作用的交集靶點，在STRING數據庫中獲得靶點-靶點功能相關蛋白間的網絡相互作用關系，選擇的最小相互作用得分gt;0.700，得到靶點PPI網絡圖及其tsv.數據。運用Cytoscape 3.7.1中network analyzer，分析網絡中自由度中位數和最大自由度等拓撲參數，選取degree前10的靶點作為核心靶點。

1.4 "靶點的GO和KEGG通路富集分析

應用R語言V4.1.3中的“ClusterProfiler”等R包，對獲得的核心靶點進行GO分析、KEGG通路富集分析及可視化，基因注釋信息來自“org.Hs.eg.Db”，富集時的p-value Cutoff=0.05，q-value-Cutoff=0.05。

1.5 "分子對接

通過分子對接可以預測蛋白與小分子的結合能力。白屈菜的結構從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）獲取，對應的蛋白結構從PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）獲得。通過Chem Bio

Office軟件中的3D Draw模塊將白屈菜活性成分結構進行最小能MM2力場優化，通過Raccoon軟件轉化為PDBQT。通過Autodock Vina軟件的配套工具MGLTools 1.5.6處理蛋白，加氫，Gasteiger電荷，合并非極性氫等操作，保存pdbqt格式，為配體對接做好準備。

1.6 "實驗驗證

1.6.1 "細胞株 "人NPC細胞株5-8F購自商城北納創聯生物科技有限公司，由本實驗室傳代培養。

1.6.2 "藥物與試劑 "對照品血根堿（貨號：B21412-20 mg，質量分數≥98％）、白屈菜紅堿（貨號：B20052-20 mg，質量分數≥98％）均購自上海源葉生物科技有限公司；5-氟尿嘧啶（大連美侖生物技術有限公司，貨號：51-21-8）；RPMI 1640培養基（美國HyClone公司，貨號：PM150110）；胎牛血清（美國Gbico公司，貨號：04-001-1A）；噻唑藍（貨號：M8180）、marker（貨號：PR1910-100T）均購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：VBD53M1ZL3）；BCA蛋白定量試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司，貨號：70-PQ0012）；脫脂奶粉[生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號：A600669-0250]；順鉑（美國Sigma公司，批號：MKCM2435）；蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）（貨號：60203-2-Ig）、磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K）（貨號：00070453）、GAPDH（貨號：00113797）、β-actin（貨號：10024215）購自美國Proteintech公司；ERK1/2（美國Cell Signaling Technology公司，貨號：4695S）；PCNA（北京博奧森生物技術有限公司，批號：AH08154079）；Goat anti-Mouse二抗（貨號：926-68070）、Goat anti-Rabbit二抗（貨號：926-32211）均購自美國Licor公司。

1.6.3 "主要儀器 "倒置顯微鏡（日本Olympus公司，型號：CKX31）；CO2培養箱（上海賽默飛世爾公司，型號：HERAcell150i）；微孔板分光光度計（美國Biotek公司，型號：800TS）；雙熒光細胞分析儀（美國Nexcelom公司，型號：Cellometer K2）；高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司，型號：Microfuge 20R）；多功能熒光成像儀（美國Licor 公司，型號：Odyssey CLX）；藍箭快轉儀（廣州道一科學技術有限公司，型號：FTB95）；電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司，型號：JY600HE）。

1.6.4 "MTT法檢測細胞增殖能力 "采用MTT實驗法檢測白屈菜主要活性成分中具有明顯抗腫瘤作用的血根堿、白屈菜紅堿對NPC細胞增殖的影響。取對數生長周期的5-8F細胞，用胰酶消化后收集細胞（5×103個/孔）接種于96孔培養板中，于細胞培養箱中培養7 h。待細胞貼壁后，吸棄原培養液，分別加入不同的含藥培養液培養處理24 h和48 h后，吸棄上清液，每孔加入100 μL MTT工作液，37 ℃避光培養4 h，再次棄上清液，加入100 μL DMSO，避光搖晃10 min后，用酶標儀檢測490 nm波長處OD值，計算細胞相對增殖率。細胞相對增殖率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.6.5 "Annexin-V FITC/PI雙熒光染色法檢測細胞凋亡 "5-8F細胞經胰酶消化后，將細胞平鋪于6 cm培養皿，待細胞貼壁后，加入相應的藥物，待藥物干預細胞24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶將細胞消化后收集細胞懸液，離心后保留細胞沉淀，然后用100 μL 1×Blinding buffer重懸，加入5 μL FITC和5 μL PI染液，室溫下避光孵育15 min后終止染色，采用雙熒光細胞分析儀檢測細胞凋亡率。

1.6.6 "Western blot法檢測相關蛋白表達水平 "采用Western blot實驗檢測白屈菜主要活性成分中具有明顯抗腫瘤作用的血根堿、白屈菜紅堿對NPC細胞的影響。設置血根堿5 μmol·L-1組、白屈菜紅堿5 μmol·L-1組、溶劑對照組以及陽性對照組（順鉑4 μg·mL-1組），處理24 h后，在冰上使用PBS清洗細胞，再向培養皿中加入RIPA裂解液，用細胞刮收集細胞碎片，置于離心管內。4 ℃裂解30 min后，將離心管置于提前預冷的離心機中按12 000 r/min離心10 min，收集上清液。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，測定蛋白濃度。按60 μg上樣量配制樣品并變性。于SDS-PAGE凝膠電泳按40 V，分離后6 h，采用半干轉膜儀轉膜20 min。用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗XIAP（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、ERK1/2（1∶1 000）和AKT（1∶1 000）孵育過夜，第2天洗膜后，避光孵育熒光二抗（1∶10 000）2 h，洗膜，最后在Odyssey多功能熒光成像儀成像，Image studio軟件框選條帶信號值。

1.7 "統計學分析

采用SPSS 26.0統計軟件處理，計量資料實驗數據服從正態分布，數據以“ｘ±s”表示。單因素設計和多組間計量資料比較采用單因素方差分析，多重比較則采用LSD法，Plt;0.05認為差異有統計學意義。結果分析圖由GraphPad Prism 8.0軟件制作完成。

2 結果

2.1 "白屈菜活性成分和作用靶點篩選

如圖1所示，根據限制條件對TCMSP、BATMAN-TCM數據庫中白屈菜活性成分進行檢索，去掉重復成分后共得到37個生物活性成分，通過SwissTargetPrediction等數據庫檢索藥物靶點，去除重復項后經UniProt數據庫矯正得到1 419個白屈菜靶點。

2.2 "白屈菜治療NPC作用靶點篩選及其PPI網絡

檢索GEO數據庫，共收集到7 852個NPC疾病基因，通過生信在線工具獲得白屈菜與NPC的交集靶點共327個，詳見圖2。同時，應用STRING數據庫收集327個靶點功能相關的PPI數據，構建白屈菜治療NPC靶點及其功能相關PPI網絡。詳見圖3。

2.3 "PPI網絡拓撲參數分析及核心靶點篩選

將映射得到的交集蛋白導入Cytoscape 3.7.1，計算白屈菜抗NPC靶點及功能相關PPI網絡的拓撲參數，可得靶點自由度的中位數為5.662，最大自由度為48，前10個核心靶點分別為：EGFR、TP53、VEGFA、TNF、FN1、MMP9、JUN、FGF2、LYN、F2。核心靶點所對應的活性成分如圖4所示，主要活性成分包括：血根堿、白屈菜紅堿、鵝去氧膽堿和氧化槐果堿等。

2.4 "核心靶點的GO分析和KEGG通路富集分析

通過R語言相關的包對核心靶點進行GO富集分析。其中，生物過程（biological processes，BP）主要涉及創傷治愈、神經發生調控和神經系統發育調控。細胞組分（cellular component，CC）主要涉及囊泡腔、膜筏、膜微區和含膠原的細胞外基質。分子功能（molecular function，MF）主要涉及泛素蛋白連接酶結合、硫化物結合、整合素結合、肝素結合和糖胺聚糖結合。詳見圖5。KEGG信號通路主要富集到MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路。詳見圖6。

2.5 "分子對接結果

通過PDB數據庫搜索10個核心靶點相關的蛋白，建立合適的活性空腔盒子模型后，與對應的化合物進行分子對接，結果通過pymol V 2.3展示。在EGFR（PDB ID：5UGC）、TP53（PDB ID：2MWO）、VEGFA（PDB ID：5T89）、TNF（PDB ID：6OOY）、FN1（PDB ID：2CG6），MMP9（PDB ID：4XCT）、JUN（PDB ID：2P33）、LYN（PDB ID：5XY1）、F2（PDB ID：1AE8）蛋白分子中，對應的分子與其對接的結果均小于0（圖7），而FGF2未找到合適的蛋白分子。圖8展示了血根堿、白屈菜紅堿與其對應的核心靶點之間具體的結合部位。

2.6 "白屈菜主要活性成分抑制NPC細胞增殖

MTT結果顯示，與溶劑對照組比較，順鉑4 μg·mL-1組、不同濃度的血根堿（2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1）組和白屈菜紅堿（2.5 μmol·L-1、5 μmol·L-1）組分別作用于NPC 5-8F細胞24、48 h后，5-8F細胞相對增殖率明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01）。結果見圖9。

2.7 "白屈菜主要活性成分誘導NPC細胞凋亡

與溶劑對照組比較，血根堿5 μmol·L-1組、白屈菜紅堿5 μmol·L-1組和順鉑4 μg·mL-1組作用于5-8F細胞24 h后，細胞凋亡率均明顯增高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。結果見圖10。

2.8 "白屈菜主要活性成分對NPC細胞增殖和凋亡相關蛋白的影響

Western blot結果顯示，與溶劑對照組比較，血根堿5 μmol·L-1組和白屈菜紅堿5 μmol·L-1組的增殖相關蛋白PCNA及凋亡相關蛋白XIAP的表達水平均降低，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；順鉑4 μg·mL-1組的凋亡相關蛋白XIAP的表達水顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01），增殖相關蛋白PCNA的表達水平降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖11。

2.9 "白屈菜主要活性成分對NPC細胞中AKT、ERK1/2表達水平的影響

與溶劑對照組比較，血根堿 5 μmol·L-1組、白屈菜紅堿5 μmol·L-1組、順鉑 4 μg·mL-1組中PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白AKT和MAPK信號通路關鍵蛋白ERK1/2的表達水平均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖12。

3 討論

NPC是一種上皮源性惡性腫瘤，目前其主要的治療方法為放化療。傳統的化學藥物雖療效顯著，但毒副作用大、易出現耐藥性，如何有效改善，是臨床較為關注的問題[13]。中醫學認為，NPC的主要病機為氣虛染毒，治宜益氣解毒。白屈菜性涼，味苦，具有較強的抗腫瘤活性，但其治療NPC的物質基礎及作用機制尚不明確。

網絡藥理學通過蛋白質組學、基因組學、生物信息學等數據庫檢索，從分子和整體水平進行中藥的系統分析，獲得中藥的核心化學成分-蛋白靶點，明確中藥的作用機制，為中藥研究提供新的思路[14]。本研究基于網絡藥理學，挖掘白屈菜治療NPC的物質基礎和分子機制。通過數據庫篩選，本研究共獲得白屈菜的生物活性成分37個，并從活性成分-靶點相互作用網絡構建結果中，得到其關鍵活性成分血根堿、白屈菜紅堿等。研究表明，血根堿可通過影響多細胞靶點、酶的活性及MAPK、PI3K/AKT和NF-？資B等多個信號傳導通路參與腫瘤的發生、發展[15]。針對NPC，血根堿能夠抑制NPC增殖、誘導自噬和凋亡，其作用機制可能與調控MAPK、PI3K/AKT和AMPK/mTOR信號通路有關[16-18]。CHMURA等[19]通過體外研究證實，白屈菜紅堿對9種腫瘤細胞均具有抑制作用，且表現出細胞毒性[20]。這些網絡藥理學預測結果與近年來研究報道相吻合，說明基于網絡藥理學的方法預測中藥有效成分具有一定的科學性和可行性。同時，本實驗證實，血根堿和白屈菜紅堿能夠明顯抑制NPC細胞增殖并誘導細胞凋亡。

通過核心靶點分析得到白屈菜抗NPC的核心靶點主要有EGFR、TP53、VEGFA、TNF、FN1、MMP9、JUN、FGF2、LYN、F2，主要涉及泛素蛋白連接酶結合、硫化物結合、整合素結合、肝素結合和糖胺聚糖結合等，并主要富集在MAPK、PI3K/AKT等信號通路。MAPK信號通路的失調和過表達是癌癥中最常見的改變，其主要的家族成員包括ERK、JNK/SAPK和P38MAPK[21-22]。胡晶等[23-24]研究發現，益氣解毒方水提物可通過下調MAPK/ERK信號通路關鍵蛋白p-c-Raf、p-MEK、p-ERK1/2的表達，阻滯細胞周期，抑制NPC細胞增殖并誘導細胞凋亡。PI3K/AKT信號通路在NPC生物學進展中發揮了重要作用，研究表明，益氣解毒方可通過調控PI3K/AKT信號通路誘導NPC細胞自噬并促進凋亡[25-26]。在本文Western blot實驗中，證實白屈菜相關活性成分白屈菜紅堿、血根堿使NPC凋亡相關蛋白XIAP、增殖相關蛋白PCNA、MAPK信號通路相關蛋白ERK1/2、PI3K/AKT通路相關蛋白AKT下調，佐證了網絡藥理學對白屈菜活性成分及相關通路靶點網絡的有效性。

綜上所述，本研究系統預測了白屈菜治療NPC的作用機制，且證實了血根堿、白屈菜紅堿是白屈菜抗NPC的重要物質基礎，MAPK、PI3K/AKT信號通路可能是其發揮抗NPC作用的重要機制，為白屈菜臨床干預NPC提供了一定的理論依據。

參考文獻

[1] 何文龍， 呂 "炎， 胡云揚， 等. 放射聯合藥物治療鼻咽癌的現狀[J]. 實用癌癥雜志， 2019， 34（2）： 3.

[2] PETERSSON F. Nasopharyngeal carcinoma： A review[J]. Seminars in Diagnostic Pathology， 2015， 32（1）： 54-73.

[3] 邱元正， 劉 "超， 李 "果. 鼻咽癌放射治療的現狀與對策[J]. 中國耳鼻咽喉顱底外科雜志， 2015， 21（6）： 435-438.

[4] 黃自麗， 黃修燕， 鄭 "起. 中藥抗腫瘤作用及其作用機制研究進展[J]. 醫學綜述， 2010， 16（3）： 386-389.

[5] 山 "爾. 《〈救荒本草〉校釋與研究》出版[J]. 中華醫史雜志， 2007， 37（2）： 1.

[6] 洪 "波， 孟 "琦， 江健梅， 等. 白屈菜生物堿研究進展[J]. 人參研究， 2022， 34（2）： 58-62.

[7] 趙國成， 張國財. 白屈菜人工栽培及加工處理技術的研究[J]. 中國林副特產， 2022， 180（5）： 22-24.

[8] 李學哲， 樸惠順. 異喹啉類生物堿的抗腫瘤作用及機制的研究進展[J]. 華西藥學雜志， 2014， 29（1）： 94-97.

[9] 宗永立， 劉艷平. 白屈菜紅堿對人胃癌BGC823細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用[J]. 中草藥， 2006， 37（7）： 1054-1056.

[10] 鄒 "翔， 王雨蒙， 王嘉琪， 等. 白屈菜堿的藥理作用研究進展[J]. 現代藥物與臨床， 2014， 29（11）： 1326-1330.

[11] 何 "苗. 白屈菜紅堿聯合厄洛替尼抗非小細胞肺癌的作用機理研究[D]. 長春： 吉林大學， 2017.

[12] YANG T， XU R， SU Q， et al. Chelerythrine hydrochloride inhibits proliferation and induces mitochondrial apoptosis in cervical cancer cells via PI3K/BAD signaling pathway[J]. Toxicology in Vitro， 2020， 68： 104965-104965.

[13] 謝民強. 鼻咽癌治療研究進展[J]. 中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2023， 29（6）： 1-10.

[14] 劉鑫馗， 吳嘉瑞， 張 "丹， 等. 基于網絡藥理學的參附湯作用機制分析[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2017， 23（16）： 211-218.

[15] DING Z H， TANG S C， WEERASINGHE P， et al. The alkaloid sanguinarine is effective against multidrug resistance in human cervical cells via bimodal cell death[J]. Biochemical Pharmacology， 2002， 63（8）： 1415-1421.

[16] 彭佳欣， 陶陽陽， 彭江敏， 等. 血根堿聯用5-氟尿嘧啶對鼻咽癌裸鼠移植瘤細胞自噬和凋亡的影響[J]. 中國藥學雜志， 2022， 57（24）： 2092-2098.

[17] 蘇俐丹， 何迎春， 黃立中， 等. AMPK/mTOR信號通路介導的自噬在血根堿抑制鼻咽癌細胞增殖中的作用研究[J]. 中國免疫學雜志， 2022， 38（23）： 2870-2875.

[18] 譚愛軍. 血根堿通過MAPK/ERK信號通路抑制鼻咽癌細胞增殖的研究[D]. 長沙： 湖南中醫藥大學， 2021.

[19] CHMURA S J， DOLAN M E， CHA A， et al. In vitro and in vivo activity of protein kinase C inhibitor chelerythrine chloride induces tumor cell toxicity and growth delay in vivo[J]. Clinical Cancer Research， 2000， 6（2）： 737-742.

[20] 羅飛亞， 馬新群， 林 "飛. 白屈菜紅堿對大鼠的長期毒性試驗研究[J]. 癌變·畸變·突變， 2014， 26（6）： 459-462.

[21] GORRINI C， HARRIS I S， MAK T W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy[J]. Nature Reviews Drug Disco？鄄very， 2013， 12： 931-947.

[22] 范慧寧， 張 "靖， 朱金水. 血根堿抗腫瘤機制的研究進展[J]. 現代腫瘤醫學， 2019， 27（18）： 3323-3327.

[23] 胡 "晶， 戴 "娜， 徐冰雁， 等. 益氣解毒方通過MAPK/ERK信號通路抑制鼻咽癌細胞增殖[J]. 中國中藥雜志， 2018， 43（6）： 1221-1227.

[24] 胡 "晶， 劉 "潔， 徐冰雁， 等. MAPK/ERK信號通路在益氣解毒方水提物誘導鼻咽癌細胞凋亡中的作用[J]. 中國藥理學通報， 2019， 35（11）： 1613-1621.

[25] 藺 "婷， 戴 "娜， 羅晶婧， 等. 益氣解毒方通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導鼻咽癌細胞自噬的研究[J]. 中華中醫藥雜志， 2020， 35（3）： 1484-1488.

[26] 藺 "婷， 羅晶婧， 周芳亮， 等. 益氣解毒方通過誘導自噬促進鼻咽癌細胞凋亡的作用研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理， 2019， 30（10）： 1149-1158.