牛大力亞慢性毒性研究

摘要：目的" 通過開展牛大力的亞慢性毒性試驗(yàn)，為其安全性評價提供試驗(yàn)依據(jù)。方法" 80只SPF級SD種大鼠（雌雄各半）分成4個組，分別為低、中、高3個劑量組[0.86、2.58、7.73 g/（kg·bw）]和陰性對照組，經(jīng)口灌胃分別給予相應(yīng)劑量的牛大力，陰性對照組給予純凈水，連續(xù)灌胃90 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠經(jīng)腹腔麻醉后采血檢測血液指標(biāo)，采集臟器稱重及計(jì)算臟/體比，并進(jìn)行病理學(xué)檢查。結(jié)果" 各劑量組動物生長發(fā)育良好，體重、攝食量、食物利用率、血常規(guī)、凝血、血生化指標(biāo)、臟器重，以及臟/體比指標(biāo)與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），組織病理學(xué)觀察未見與受試樣品有關(guān)的病理改變。結(jié)論" 在本試驗(yàn)條件下，確定受試樣品牛大力對雌、雄性大鼠的未觀察到有害作用劑量（NOAEL）均為75.00 g/（kg·bw），未見亞慢性毒性。

關(guān)鍵詞：牛大力；亞慢性毒性；安全性評價；有害作用劑量

中圖分類號：R29" " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.07.011

文章編號：1006-1959（2024）07-0062-07

Study on Subchronic Toxicity of Millettia Speciosa

TANG Li1，HU Shuai-er1，CHEN Mei-fen1，ZHANG Zi-hong1，LI Wen-li1，LI Dong-li2

（1.Institute of Toxicology，Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 511430，Guangdong，China;

2.School of Biotechnology and Health Sciences，Wuyi University，Jiangmen 529000，Guangdong，China）

Abstract：Objective" To provide experimental basis for safety evaluation of Millettia speciosa by conducting subchronic toxicity test.Methods" A total of 80 SPF SD rats （sex in half） were divided into low， medium and high dose groups [0.86、2.58、7.73 g/（kg·bw）] and a negative control group. Rats in the dose groups were orally administered the corresponding doses of millettia speciosa， while rats in the negative control group were given purified water. The oral gavage lasted for 90 days consecutively. At the end of the experiment， blood samples were collected from rats anesthetized by intraperitoneal injection for blood indexes analyses. Major organs were harvested and weighed to calculate organ-to-body weight ratios. Histopathological examinations were also performed on organ tissues.Results" The growth and development of the animals in each dose group were good. There was no significant difference in body weight， food intake， food utilization rate， blood routine， blood clotting， blood biochemical index， organ weight， and viscera/body ratio index between each dose group and the negative control group （Pgt;0.05）. No pathological changes related to the test samples were observed by histopathological observation.Conclusion" Under the conditions of this experiment， the no observed adverse effect level （NOAEL） of the test sample Millettia speciosa on female and male rats is determined to be 75.00 g/（kg·bw）， and no subchronic toxicity is observed.

Key words：Millettia speciosa;Subchronic toxicity;Safety assessment;No observed adverse effect level

基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（編號：20221060）

作者簡介：湯莉（1983.10-），女，廣東廣州人，碩士，主管技師，主要從事食品毒理及動物病理研究

牛大力是豆科蝶形花亞科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millettia speciosa Champ.）的干燥根，又名山蓮藕、豬腳笠、九龍串珠、扒山虎、大力薯等，味甘、性平，有補(bǔ)虛潤肺，強(qiáng)筋活絡(luò)之功效[1]。牛大力在國內(nèi)外均有分布，國內(nèi)以廣東、廣西、海南、福建、湖南、貴州為主，是多年生草本或半灌木，高10～30 cm，根狀莖短縮或稍粗，直徑2～5 mm，是一種藥食同源植物，根部可入藥，是廣東、廣西地區(qū)常用的補(bǔ)骨健筋類藥材，多用于燉湯，配制藥膳，藥酒等[2]。近年來，隨著對牛大力的深入研究，從中分離鑒定出其所含的多種生物活性成分，包括生物堿、黃酮類、苯丙素類、揮發(fā)油、甾醇類以及微量元素如鐵、錳、鋅、銅、鈣、鎂[3，4]。其中，生物堿成分具抗菌作用，黃酮類具抗炎鎮(zhèn)痛效果，苯丙素類和揮發(fā)油具抗氧化和抑菌活性，甾醇類，具抗腫瘤功效，尤其牛大力苷和牛大力甙兩個成分表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤潛能，可開發(fā)為抗腫瘤藥物[5]。既往研究顯示，牛大力具有廣譜藥理活性，比如抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛[6]、抗氧化[7，8]、抗腫瘤、抗疲勞[9]、增強(qiáng)免疫力[10，11]、護(hù)肝[12]、降尿酸、降血糖等，可用于治療腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、慢性肝炎、遺精、白帶等癥。其中，高麗槐素為特征性成分，也是檢驗(yàn)牛大力質(zhì)量的一個重要標(biāo)準(zhǔn)，并具有抗腫瘤和抗菌藥效[13]。牛大力具有較高的藥用價值與營養(yǎng)價值，在中草藥中被廣泛應(yīng)用，明確其毒性特征是保障患者的用藥安全的關(guān)鍵。但關(guān)于牛大力的毒理學(xué)研究還非常有限，有關(guān)牛大力的毒性實(shí)驗(yàn)報道較少。本研究依照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)要求，進(jìn)行大鼠90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)，以確定亞慢性經(jīng)口最大無作用劑量（NOAEL）參數(shù)和毒性靶器官，旨在為牛大力在食用安全性評價和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1受試樣品" 牛大力，樣品批號為202009EP，塑料袋裝，黑褐色膏體，由五邑大學(xué)提供。牛大力（提取物濃縮液）制備工藝：采集牛大力植物的新鮮根，加入10倍量50%乙醇煮沸回流提取2 h，過濾得濾液和濾渣，濾渣用相同方法再提取一次，得到的濾渣用10倍量的水回流提取2 h，合并3次的濾液，濃縮至浸膏。牛大力干品人體推薦每日服用量為15 g，以成人體重60 kg計(jì)，每日服用量為0.25 g/（kg·bw），按五邑大學(xué)提供的牛大力（提取濃縮液）得率10.3%折算，則牛大力（提取濃縮液）的人體推薦每日服用量為0.025 75 g/（kg·bw）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物" SPF級SD種健康大白鼠80只，體重：70～80 g由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2016-0041，質(zhì)量合格證編號：NO.44002100026556，所有動物均采用的顆粒飼料為SPF級維持鼠料，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)于廣東省疾病預(yù)防控制中心屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0011，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%。

1.3儀器與試劑

1.3.1主要儀器" 日立7600-020自動生化分析儀、東亞sysmex XT-2000i全自動血球計(jì)數(shù)儀、STA COMPACT MAX血凝儀、迪瑞H800尿液分析儀。ZEISS Axioskop 40顯微鏡、MICROM HM355s切片機(jī)、Intelsint RVG-1脫水機(jī)、MICROM AP280包埋機(jī)、SAKURA染片機(jī)。

1.3.2主要試劑" 血液學(xué)檢測、血凝檢測試劑均由原儀器生產(chǎn)商供應(yīng)，血液學(xué)生化學(xué)指標(biāo)檢測試劑由九強(qiáng)生物科技公司提供，鈉、鉀、氯檢測試劑由日立公司提供。

1.4亞慢性毒性試驗(yàn)" 設(shè)3個劑量組，劑量分別為0.86、2.58、7.73 g/（kg·bw）相當(dāng)于人體推薦每日服用量的33.3、100、300倍。80只SD大鼠按照體重隨機(jī)分成4個組，分別為低、中、高3個劑量組，以及陰性對照組。每組20只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，經(jīng)口灌胃給予受試物，按1.0 ml/100 g bw灌胃，陰性對照組按同等容量灌胃給予純凈水，每天灌胃1次，連續(xù)90 d。試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算大鼠的體重總增重、總攝食量和總食物利用率，并對其進(jìn)行血液學(xué)和血清生化檢查，大體解剖后進(jìn)行臟器稱重，計(jì)算臟器指數(shù)，最后對高劑量組和陰性對照組動物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。檢測臟器包括腦、垂體、甲狀腺、胸腺、肺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、胰、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、子宮、睪丸、附睪、前列腺、膀胱。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料使用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)行一個或多個實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組之間均數(shù)比較。分類資料采用Fisher精確分布檢驗(yàn)、？字2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)；等級資料采用Ridit分析、秩和檢驗(yàn)等，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動物一般臨床狀況" 各試驗(yàn)組大鼠一般生理體征、行為表現(xiàn)、外觀、皮毛、黏膜、分泌物、大小便等均未見異常，試驗(yàn)期間動物無死亡。

2.2試驗(yàn)期間大鼠體重、飼料攝食量和食物利用率的變化" 各劑量組大鼠體質(zhì)量總增重、總攝食量和總食物利用率指標(biāo)與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3血常規(guī)、凝血指標(biāo)" 雌性高劑量組凝血酶原時間與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在本實(shí)驗(yàn)室檢測正常值范圍內(nèi)，無生物學(xué)意義。其余各劑量組各血液學(xué)指標(biāo)與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.4血液生化指標(biāo)" 雌性高劑量組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各劑量組各項(xiàng)生化指標(biāo)與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.5臟器重量、臟/體比值" 各劑量組臟器指標(biāo)與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明該受試樣品90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)臟器重量、臟/體比值指標(biāo)正常，見表4、表5。

2.6病理學(xué)檢查結(jié)果" 大鼠陰性對照組與高劑量組動物臟器病理切片檢查發(fā)現(xiàn)有少數(shù)動物出現(xiàn)肝、肺和胰腺輕微病理改變，見圖1。

2.6.1肺和支氣管" 雌、雄性陰性對照組和雌、雄高劑量組各有1例動物見部分支氣管周圍炎細(xì)胞浸潤或局部肺間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤。

2.6.2肝臟" 雄性陰性對照組和高劑量組各1例動物可見肝小葉周邊部部分肝細(xì)胞呈輕度空泡變性。

2.6.3胰腺" 雄性陰性對照組和高劑量組各1例動物胰腺外分泌部見少量脂肪細(xì)胞浸潤。

2.6.4其他" 其余陰性對照組與高劑量組大鼠的腦、垂體、甲狀腺、胸腺、肺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、胰、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、子宮、睪丸、附睪、前列腺、膀胱組織病理學(xué)觀察結(jié)果大致相同，未見與受試物有關(guān)的病理改變。

3討論

牛大力是廣東和廣西的本地藥材，已被列入《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》和《廣西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，這說明它具有較高的質(zhì)量控制水平和臨床應(yīng)用價值。在我國，牛大力作為傳統(tǒng)藥用植物已有一千多年歷史，隨著現(xiàn)代醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展，開展牛大力等傳統(tǒng)藥用植物的安全性評價研究，是合理利用中藥資源的重要環(huán)節(jié)。

亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠一般臨床觀察未見異常，試驗(yàn)期間無動物死亡，牛大力對大鼠體重、攝食量、食物利用率、血常規(guī)、血清生化指標(biāo)、臟器重及臟/體比無明顯影響。雌性高劑量組凝血酶原時間與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在本實(shí)驗(yàn)室檢測正常值范圍內(nèi)，無生物學(xué)意義。病理學(xué)檢查未見受試物引起的特殊病理學(xué)改變。牛大力提取物濃縮液對雌雄性大鼠無亞慢性毒性，未觀察到損害作用的劑量為7.73 g/（kg·bw），折算成牛大力干品劑量為75.00 g/（kg·bw），牛大力干品人體推薦每日服用量為15 g/d，未觀察到損害作用的劑量相當(dāng)于人體推薦每日服用量的300倍。本研究團(tuán)隊(duì)前期已完成牛大力提取物濃縮液急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)，急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明牛大力提取物濃縮液20.0 g/（kg·bw）劑量組未觀察到小鼠出現(xiàn)中毒反應(yīng)和死亡，獲得雌雄性小鼠LD50＞20.0 g/（kg·bw），相當(dāng)于受試物人體推薦每日服用量的777倍。遺傳毒性試驗(yàn)中小鼠紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)、細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性[14]。本研究采用的牛大力濃縮液是先后用50%乙醇和水對牛大力新鮮根進(jìn)行多次熱回流提取，合并濾液濃縮制得的浸膏。該提取方法操作簡便高效，適合獲取牛大力多種活性成分，并為牛大力的毒性、功能研究和藥效評價提供有效的試驗(yàn)材料。

目前對牛大力的安全性評價研究較為有限。楊增艷等[15]對小鼠最大耐受量的測定，其研究結(jié)果顯示牛大力水提物的小鼠最大耐受量大于1000 g/（kg·bw），相當(dāng)于人體推薦每日服用量的110倍；牛大力醇提物的小鼠最大耐受量大于1700 g/（kg·bw），相當(dāng)于人體推薦每日服用量的186倍。在實(shí)驗(yàn)中，受試動物未出現(xiàn)任何中毒癥狀，也沒有發(fā)生死亡病例，表明牛大力具有較高的安全性且沒有明顯毒副作用。陳曉白等[16]應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上證實(shí)了牛大力在推薦量范圍內(nèi)對小鼠肺、腎、肝、睪丸細(xì)胞的DNA均未見明顯損傷。

本研究結(jié)果顯示，雌性高劑量組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）與陰性對照組比較下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），雌性高劑量組ALT、AST與陰性對照組比較下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但這三種肝臟酶指標(biāo)變化趨勢一致，且本研究肝臟病理學(xué)檢查未見明顯不良反應(yīng)，間接說明牛大力具有護(hù)肝作用。GGT、ALT和AST的降低可能提示牛大力有輕度負(fù)調(diào)控肝臟代謝酶的作用，適度的負(fù)調(diào)控可能降低肝臟負(fù)荷，從而起到保護(hù)肝臟的功效，這與周添濃等[17]、曹志方等[18]關(guān)于牛大力對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究結(jié)果一致。牛大力具有一定護(hù)肝功效可能與牛大力中多糖和黃酮類成分對肝細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用有關(guān)[19，20]，本研究可為牛大力的護(hù)肝功效的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，確定受試樣品牛大力對雌、雄性大鼠的未觀察到有害作用的劑量均為75.00 g/（kg·bw），未見亞慢性毒性。后續(xù)還需繼續(xù)從多方面開展研究以完善其毒理學(xué)和藥效學(xué)數(shù)據(jù)庫，為牛大力的臨床應(yīng)用提供科學(xué)參考。

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收稿日期：2023-08-24；修回日期：2023-09-20

編輯/肖婷婷