表兒茶素對放射性口腔炎小鼠的抗炎和抗氧化應激作用

摘要：目的" 初步從抗炎和抗氧化應激角度探討表兒茶素對放射性口腔炎小鼠的保護作用。方法" 將30只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為空白對照組、模型組和表兒茶素組，采用單次照射17 Gy X射線方法建立小鼠口腔炎模型。其中表兒茶素組于造模后連續7 d灌胃給予表兒茶素30 mg/kg，其余兩組灌胃給予等量生理鹽水。各組小鼠進行口腔炎癥評分，HE染色法觀察口腔黏膜病理變化，酶聯免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）水平；化學發光法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）的活性以及丙二醛（MDA）水平。結果" 與空白對照組比較，模型組小鼠口腔炎癥評分、血清TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平升高（P＜0.05），血清SOD、GSH-Px和CAT活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，表兒茶素組口腔炎癥評分、血清TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平降低（P＜0.05），血清SOD、GSH-Px和CAT活性升高（P＜0.05）。結論" 表兒茶素對放射性口腔炎小鼠具有較好的保護作用，其機制可能與抑制炎癥和抗氧化損傷有關。

關鍵詞：表兒茶素；炎癥；氧化損傷；小鼠

中圖分類號：R781.5" " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.07.016

文章編號：1006-1959（2024）07-0089-05

Anti-inflammatory and Anti-oxidative Stress Effects of Epicatechin

on Radiation-induced Stomatitis in Mice

XIE Xiao-hong，LI Qing-xian，WEI Hong-fa，LIU Jiao，WU Chao-wen

（Endocrine Departments of Central Hospitol of Longhua District，Shenzhen 518110，Guangdong，China）

Abstract：Objective" To investigate the protective effect of epicatechin on radiation stomatitis mice from the perspective of anti-inflammatory and anti-oxidative stress.Methods" Thirty male C57 BL/6J mice were randomly divided into blank control group， model group and epicatechin group. The mouse model of stomatitis was established by single irradiation of 17 Gy X-ray. The epicatechin group was given epicatechin 30 mg/kg by gavage for 7 consecutive days after modeling， and the other two groups were given the same amount of normal saline by gavage. The oral inflammation score of mice in each group was evaluated. The pathological changes of oral mucosa were observed by HE staining.The levels of serum tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. And the activities of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px） and catalase （CAT） and the level of malondialdehyde （MDA） in serum were detected by chemiluminescence.Results" Compared with blank control group， the oral inflammation score， serum levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 and MDA in model group were increased （Plt;0.05）， while the serum activities of SOD， GSH-Px and CAT were decreased （Plt;0.05）. Compared with model group， the oral inflammation score， serum levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 and MDA in epicatechin group were decreased （Plt;0.05）， while the serum activities of SOD， GSH-Px and CAT were increased （Plt;0.05）.Conclusion" Epicatechin has a good protective effect on mice with radiation stomatitis， and its mechanism may be related to the inhibition of inflammation and antioxidant damage.

Key words：Epicatechin;Inflammation;Oxidative damage;Mice

基金項目：深圳市龍華區醫療衛生機構區級科研項目（編號：2021021）

作者簡介：謝小紅（1979.2-），女，廣東始興縣人，本科，主管護師，主要從事中藥藥理研究

通訊作者：吳朝文（1974.11-），男，廣東羅定人，本科，副主任醫師，主要從事中藥藥理研究

頭頸部腫瘤發病率較高，約占惡性腫瘤的8%，是臨床較為常見腫瘤之一。臨床上的治療手段主要包括手術治療和放射性化療[1-3]。據研究數據顯示[4-6]，頭頸部腫瘤患者曾接受過放射性化療概率高達70%，由于鼻咽癌對放射性治療敏感度較高，放射性治療常是其首選的治療方法。然而放射治療中最常見的不良反應為放射性口腔黏膜炎（radioactive stomatitis， ROM），高達80%發生率。常見舌黏膜潰瘍性損傷，患者經受疼痛和飲食受困，嚴重影響患者的生活質量。臨床治療藥物有限，治療效果不佳，不良反應多，尋找高效低毒的抗放射性口腔炎新藥仍是目前研究重點。表兒茶素（Epicatechin）是茶多酚中主要的活性單體，藥理作用廣泛，研究發現其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、預防心血管疾病、改善糖尿病和免疫調節等作用[7-9]，其中優越的抗炎和抗氧化活性值得關注。但其對ROM的影響尚未見相關研究報道。本研究旨在初步從抗炎和抗氧化應激角度探討表兒茶素對放射性口腔炎小鼠的保護作用，以期為臨床研究開發提供部分理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物" SPF級雄性C57BL/6J小鼠30只，體質量18～22 g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司[許可證號：SCXK（遼）2020-0001]。本研究符合實驗動物倫理基本原則。

1.2藥物與試劑" 表兒茶素，純度＞98%，批號：SE8100，購于上海脈鉑醫藥科技有限公司；TNF-α、IL-1β和IL-6ELISA 試劑盒，購于武漢博士德生物技術有限公司；SOD、GSH-Px、CAT和MDA檢測試劑盒，購于南京建成生物有限公司。

1.3儀器" RS-2000X 射線機：自美國Precision X-ray 公司；KM1-HD-325型輪轉式切片機：北京海富達科技有限公司；CX23CX33型Olympus 顯微鏡：日本Olympus 公司；SKSW-KC-100型酶標儀：北京海富達科技有限公司。

1.4方法

1.4.1動物分組、造模與給藥" 按體重隨機分為空白對照組、模型組和表兒茶素組，每組10只，其中表兒茶素組灌胃給與表兒茶素30 mg/kg。建模方法主要參考文獻[10]，方法如下：腹腔注射4%水合氯醛溶液麻醉。麻醉后仰臥放入自制照射盒中，按照射劑量率為1.325 Gy/min（電壓220 kV，電流25 mA），一次性照射頭頸部。空白對照組同樣麻醉、固定，不接受放射，造模后連續7 d灌胃給藥。

1.4.2樣品采集" 造模第8 d后，10%水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球取血，4 ℃靜置3 h后，于4 ℃ 3500 r/min離心10 min，-80 ℃冰箱備用。分離小鼠口腔黏膜組織，4%多聚甲醛溶液浸泡固定。常規石蠟包埋切片，用于蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察黏膜組織的形態學變化。

1.4.3口腔炎癥評分" 口腔炎癥評分標準主要參照文獻[11]方法，分別根據口腔黏膜的損傷程度，評分值為總得分的平均值。在給藥前及取材前分別進行評分，評分方法見表1。

1.4.4口腔黏膜形態學觀察" 從10%中性甲醛中取出并選取同一部位，面積約為5 mm大小的黏膜組織，分別經過酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片等石蠟包埋步驟，HE染色（蘇木素染色15 min，伊紅染色10 s），晾干后，中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察口腔黏膜組織形態學變化。

1.4.5酶聯免疫吸附法測定血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平" 根據相應炎癥因子ELISA 試劑盒說明書檢測步驟，配合使用酶標儀檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.4.6化學發光法檢測各血清SOD、GSH-Px、CAT活性以及MDA水平" 根據相應氧化應激試劑盒說明書檢測步驟，配合使用酶標儀檢測血清中SOD、GSH-Px、CAT活性以及MDA水平。

1.5統計學方法" 采用SPSS 19.0 軟件分析各組數據，其中計量資料用（x±s）表示。根據數據是否符合正態分布或方差齊性，采用單因素方差分析。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組口腔炎癥評分比較" 與空白對照組比較，模型組小鼠口腔炎癥評分上升（P＜0.05）；與模型組比較，表兒茶素組小鼠口腔炎癥評分降低（P＜0.05），見表2。

2.2各組口腔黏膜組織病理學觀察" 空白對照組小鼠口腔黏膜整體結構完整，細胞排列整齊、有序，無壞死和炎癥細胞浸潤。模型組小鼠口腔黏膜整體結構破壞嚴重，可見部分細胞脫落、壞死，較多炎性細胞浸潤，表兒茶素組較模型組口腔黏膜有改善，無明顯炎癥細胞浸潤和細胞壞死，見圖1。

2.3各組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較" 與空白對照組相比較，模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，表兒茶素組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（P＜0.05），見圖2。

2.4各組血清SOD、GSH-Px、CAT活性以及MDA水平比較" 與空白對照組比較，模型組小鼠血清SOD、GSH-Px和CAT活性降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，表兒茶素組小鼠血清SOD、GSH-Px和CAT活性升高，MDA水平降低（P＜0.05），見圖3。

3討論

頭頸部腫瘤患者在放射性治療過程中最常見的不良反應為口腔炎，根據患者個體差異和治療周期的異同，輕、中、重度的口腔炎均會出現，而重度約占總體的30%以上，出現嚴重的黏膜上皮脫落，甚至壞死[12]。對于放射性口腔黏膜炎的動物模型的建立，早于90年代，放射性口腔黏膜炎動物模型已在國內外建立，其中應用較多的動物為大鼠和小鼠，其中由于小鼠具備可重復性、經濟性、易行性等優點，廣泛應用于該領域的科研研究[13]。放射性口腔黏膜炎涉及的機制異常復雜。炎癥、氧化損傷和致病微生物三者相互作用可能是放射性口腔黏膜炎發生發展重要的因素[14]。表兒茶素藥理作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、預防心血管疾病、改善糖尿病和免疫調節等作用[7-9]，其中以抗炎和抗氧化活性最為顯著，其是否對放射性口腔炎具有較好的保護作用值得探討。

放射過程中可誘導多種炎性因子的產生，如TNF-α、IL -1β和IL-6。TNF-α、IL -1β和IL-6不但可直接引起口腔粘膜炎癥損傷，還可引發炎癥風暴，促進炎癥爆發，進一步促進口腔損傷[15，16]。本研究發現，模型組小鼠口腔炎癥評分較空白對照組升高，口腔粘膜組織損傷嚴重，可見大量的炎癥細胞浸潤；此外，血清促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，提示了放射性口腔炎小鼠模型構建成功。給予表兒茶素可改善口腔粘膜組織損傷和炎癥細胞浸潤，降低血清促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，提示表兒茶素通過抑制炎癥，改善放射性口腔炎損傷。

放射過程同時可誘導機體產生氧化損傷，其在口腔炎的發病過程中有著重要的作用[17]。SOD、GSH-Px、CAT活性以及MDA的水平是反映機體氧化應激損傷嚴重程度的重要指標[18]。SOD、GSH-Px和CAT是機體內幾種重要的抗氧化酶，可消除多種自由基，是防御機體氧化損傷的重要保護酶[19]。MDA是機體脂質氧化后產生的代謝產物，其水平是機體氧化損傷重要的參考指標之一。本研究發現，模型組小鼠血清SOD、GSH-Px和CAT活性降低，而MDA含量升高。而給予表兒茶素后，血清SOD、GSH-Px和CAT活性升高，MDA含量降低，提示表兒茶素可通過抑制氧化應激損傷，改善放射性口腔炎損傷。

綜上所述，表兒茶素對放射性口腔炎小鼠具有較好的保護作用，其機制可能與抑制炎癥和抗氧化損傷有關。

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收稿日期：2023-04-06；修回日期：2023-05-02

編輯/成森