MicroRNA-27a-3p靶向調控SLC7A11抑制結直腸癌細胞鐵死亡

［摘要］ 目的： 探究微小RNA-27a-3p（microRNA-27a-3p，miR-27a-3p）對結直腸癌細胞系HT-29和SW480鐵死亡的調控及作用機制。方法： 分別用0、2.5和5 μmol/L Erastin處理結直腸癌細胞系HT-29和SW480，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測各組細胞溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）mRNA表達水平，篩選Erastin的合適濃度；將HT-29和SW480細胞各分為siControl組、siSLC7A11-1組和siSLC7A11-2組，分別轉染對照siRNA、siSLC7A11-1和siSLC7A11-2，與5 μmol/L Erastin共培養0、24、48、72 h，檢測不同時間點細胞增殖活性，并檢測細胞內丙二醛水平。另將HT-29和SW480細胞各分為miR-NC組、miR-27a-3p組和anti-miR-27a-3p組，分別轉染miR-NC、miR-27a-3模擬物和miR-27a-3p抑制物，采用qRT-PCR法檢測SLC7A11 mRNA表達水平，采用熒光素酶報告基因實驗檢測SLC7A11 3′UTR序列（SLC7A11-WT）及突變序列（SLC7A11-Mut）熒光素酶活力;與5 μmol/L Erastin共培養0、24、48、72 h，檢測不同時間點細胞增殖活性，并檢測細胞內丙二醛含量。結果： 隨Erastin濃度升高，結直腸癌HT-29和SW480細胞SLC7A11 mRNA表達水平顯著升高（P均＜0.01）；在結直腸癌HT-29和SW480細胞中，與siControl組相比，siSLC7A11-1組和siSLC7A11-2組48 h和72 h細胞增殖活性顯著增強（P＜0.05），丙二醛含量顯著下降（P＜0.05）；與miR-NC組相比，miR-27a-3p組細胞增殖活性顯著增強（P＜0.05），丙二醛水平和SLC7A11-WT熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），SLC7A11-Mut熒光素酶活性沒有顯著變化（P＞0.05），anti-miR-27a-3p組細胞活力顯著下降（P＜0.01），丙二醛含量和SLC7A11-WT熒光素酶活性顯著升高（P均＜0.01），SLC7A11-Mut熒光素酶活性沒有顯著變化（P＞0.05）。結論： miR-27a-3p可能通過靶向SLC7A11 mRNA 3′UTR，調控Erastin誘導的結直腸癌細胞鐵死亡。

［關鍵詞］ 結直腸癌；鐵死亡；微小RNA-27a-3p；溶質載體7A11

［中圖分類號］ R735.3

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）03-0228-06

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230054

［引用格式］張耀月，譚招麗，石悅. MicroRNA-27a-3p靶向調控SLC7A11抑制結直腸癌細胞鐵死亡［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（3）： 228-233.

MicroRNA-27a-3p inhibits colorectal cancer cell ferroptosis-induced by Erastin through targeting on SLC7A11

ZHANG Yaoyue， TAN Zhaoli， SHI Yue

（Department of Oncology， the Fifth Medical Center， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100071， China）

［Abstract］ Objective： To explore the regulation and mechanism of microRNA-27a-3p （miR-27a-3p） on ferroptosis of colorectal cancer cell line HT-29 and SW480. Methods： Colorectal cancer cell lines HT-29 and SW480 were treated with 0， 2.5 and 5 μmol/L Erastin， respectively. Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the mRNA expression of solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11） in each group and the optimal concentration of Erastin was screened. HT-29 and SW480 cells were divided into siControl group， siSLC7A11-1 group and siSLC7A11-2 group， and transfected with control siRNA， siSLC7A11-1 and siSLC7A11-2， respectively. The cells were co-cultured with 5 μmol/LErastin for 0， 24， 48 and 72 h to detect the cell proliferation activity and the level of malondialdehyde in the cells at different time points. HT-29 and SW480 cells were divided into miR-NC group， miR-27a-3p group and anti-miR-27a-3p group， respectively， and transfected with miR-NC， miR-27a-3 mimics and miR-27a-3p inhibitors， respectively. The mRNA expression level of SLC7A11 was detected by qRT-PCR， and the luciferase reporter gene assay was used to detect the luciferase activity of SLC7A11 3′UTR sequence （SLC7A11-WT） and mutant sequence （SLC7A11-Mut）. The cells were co-cultured with 5 μmol/L Erastin for 0， 24， 48 and 72 h， and the cell proliferation activity was detected at different time points， and the intracellular malondialdehyde level was detected. Results： The mRNA expression of SLC7A11 in colorectal cancer HT-29 and SW480 cells was significantly increased with the increase of Erastin concentration （Plt;0.01）. In colorectal cancer HT-29 and SW480 cells， compared with the siControl group， the cell proliferation activity in siSLC7A11-1 and siSLC7A11-2 groups was significantly increased at 48 h and 72 h （Plt;0.05）， with a significant decrease in malondialdehyde levels （Plt;0.05）. Compared with the miR-NC group， cell proliferation activity in miR-27a-3p group was significantly enhanced （Plt;0.05）， while malondialdehyde levels and luciferase activity of SLC7A11-WT group were significantly decreased （Plt;0.05 or Plt;0.01）， and luciferase activity of SLC7A11-Mut group showed no significant changes（Pgt;0.05）; and the cell viability of anti-miR-27a-3p group was significantly decreased （Plt;0.01）， the level of malondialdehyde and the luciferase activity of SLC7A11-WT were significantly increased （Plt;0.01）， and the luciferase activity of SLC7A11-Mut was not significantly changed （Pgt;0.05）. Conclusion： miR-27a-3p may regulate Erastin-induced ferroptosis in colorectal cancer cells by targeting the 3′UTR of SLC7A11 mRNA.

［Key words］ colorectal cancer; ferroptosis; miR-27a-3p; solute carriers 7A11

結直腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，我國每年新增患者近40萬［1］。目前結直腸癌的治療仍以手術切除及術后聯合放療、化療為主［2］。盡管近年來新型靶向藥物和免疫療法顯著改善了結直腸癌患者的預后［3］，但新型藥物的開發仍局限于少數幾個靶點，導致進展較慢。

鐵死亡是一種細胞程序性死亡，其發生與鐵依賴細胞活性氧積累、脂質過氧化密切相關，且在細胞形態、調控機制等方面與細胞凋亡、壞死等其他細胞程序性死亡有明顯差別［4］。在腫瘤發生過程中，鐵死亡的激活可以有效抑制腫瘤細胞增殖，進而抑制腫瘤的進展［5］，但結直腸癌細胞鐵死亡的激活機制仍不清楚。研究發現，胱氨酸/谷氨酸轉運受體可以向細胞內轉運半胱氨酸，同時向細胞外轉運谷氨酸［6］。當細胞外半胱氨酸轉運受阻時，細胞內谷胱甘肽水平下降，谷胱甘肽過氧化酶4活性被抑制，進而導致脂質過氧化水平升高，最終引起細胞鐵死亡［7］。研究表明，溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是胱氨酸/谷氨酸轉運受體的重要組分，SLC7A11表達水平與腫瘤患者預后呈一定的相關性［8］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約22 nt的非編碼RNA，可以通過結合下游基因mRNA對基因的表達進行轉錄后調控。其中，miR-27a-3p與腫瘤發生密切相關，在食管癌［9］、非小細胞肺癌［10］和結直腸癌［11］等多種癌組織中呈異常表達，具有抑癌作用。Lu等［10］研究顯示，miR-27a-3p靶向SLC7A11參與調控非小細胞肺癌細胞的鐵死亡過程，但miR-27a-3p是否參與調控結直腸癌細胞的鐵死亡過程尚不清楚。因此，本研究利用鐵死亡誘導劑Erastin誘導結直腸癌細胞鐵死亡細胞模型，分析miR-27a-3p對結直腸癌細胞鐵死亡的調控及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞和主要試劑

人結直腸癌細胞系HT-29和SW480均購自中國醫學科學院細胞庫。DMEM、胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰酶消化液、Lipofectamine RNAiMax、Trizol裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；Erastin購自美國Sigma-Aldrich公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自翌圣生物科技公司；CCK-8細胞活力檢測試劑盒、脂質氧化（丙二醛）檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司；莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉錄酶購自美國普洛麥格科技公司；實時熒光定量PCR（qRT-PCR） DNA聚合酶混合物購自南京諾唯贊公司；siRNA和miRNA均由廣州銳博生物科技公司合成。

1.2 細胞培養

將人結直腸癌細胞系HT-29和SW480分別接種于24孔板，添加含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素鏈霉素的DMEM，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。當細胞匯合度達70%～90%時，用胰酶消化液消化細胞，并按照1∶3比例傳代。

1.3 qRT-PCR檢測結直腸癌細胞SLC7A11 mRNA表達水平篩選Erastin合適濃度

取人結直腸癌細胞HT-29和SW480，分別用0、2.5和5 μmol/L Erastin處理24 h；取1 mL Trizol裂解細胞，加入200 μL氯仿，12 000×g離心10 min，分離水相和有機相；取500 μL上層水相，加入1 mL無水乙醇，充分混勻，繼續12 000×g離心10 min；取RNA沉淀，70%乙醇漂洗2次，充分晾干后加入無核酸酶雙蒸水溶解，即得到細胞總RNA。取0.5 μg總RNA，加入1 μL oligo-dT引物，另加入蒸餾水調整總體積至10 μL，70 ℃預熱5 min；然后分別加入1 μL M-MLV逆轉錄酶、2.5 μL逆轉錄緩沖液、1 μL RNA酶抑制劑和1 μL dNTP，加入蒸餾水將總體積補充至25 μL，42 ℃反應1 h，得到cDNA。以cDNA為模板行qRT-PCR。反應體系：1 μL cDNA、10 μL DNA聚合酶混合物，并加入蒸餾水將總體積補充至20 μL，擴增反應程序為90 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個循環，95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s，1個循環。每組樣品設置3個重復對照。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法分析SLC7A11 mRNA相對表達量。引物序列：SLC7A11正向，5′-GTCCCGGCGTAT-TACCTCTT-3′，SLC7A11反向，5′-GCAGATGGCCAA-GGATTTGAT-3′；GAPDH正向，5′-TGGAGTCTACTG-GCGTCTT-3′，GAPDH反向：5′-TGTCATATTTCTCGT-GGTTCA-3′。

1.4 細胞分組和轉染

對于檢測SLC7A11功能的實驗，將HT-29和SW480細胞分為siControl組、siSLC7A11-1組、siSLC7A11-2組，分別轉染對照siRNA、siSLC7A11-1和siSLC7A11-2。對于檢測miR-27a-3p的相關實驗，將HT-29和SW480細胞分為miR-NC組、miR-27a-3p組和anti-miR-27a-3p組，分別轉染對照microRNA、miR-27a-3p模擬物和miR-27a-3p抑制物。

具體轉染步驟：首先取40 pmol RNA與50 μL DMEM混合，另取2 μL Lipofectamin 2000轉染試劑與50 μL DMEM混合，室溫放置5 min；將RNA稀釋液與轉染試劑稀釋液混合，繼續在室溫放置10 min；最后加入到細胞培養基中。

1.5 CCK-8法檢測結直腸癌細胞活力

取“1.4”分組轉染人結直腸癌HT-29和SW480細胞，將各組細胞用5 μmol/L Erastin分別共培養處理0、24、48和72 h，每孔分別加入10 μL CCK-8檢測液，繼續培養2 h；取出培養板，用酶標儀檢測各孔450 nm處光密度值。

1.6 qRT-PCR檢測轉染后結直腸癌細胞SLC7A11 mRNA相對表達水平

取“1.4”miR-NC組、miR-27a-3p組和anti-miR-27a-3p組轉染后人結直腸癌HT-29和SW480細胞，檢測SLC7A11 mRNA，具體方法同“1.3”。

1.7 熒光素酶報告基因實驗檢測miR-27a-3p對SLC7A11靶向調控

設計SLC7A11 3′非翻譯區（UTR）序列（SLC7A11-WT）及突變序列（SLC7A11-Mut）的雙熒光報告質粒，將雙熒光報告質粒與miR-27a-3p、anti-miR-27a-3p和miR-NC共同轉染至結直腸癌HT-29和SW480細胞中，轉染24 h；棄培養基，PBS漂洗2次；細胞培養板中加入500 μL細胞裂解液，冰上孵育5 min，待細胞充分裂解；取20 μL細胞裂解液至96孔板中，加入100 μL螢火蟲熒光素酶反應液，用酶標儀讀取自發熒光信號，檢測完成后，每孔再加入100 μL海腎熒光素酶反應液，再次讀取自發熒光信號。

1.8 TargetScan 8.0在線工具預測miR-27a-3p對SLC7A11的結合位點

登錄TargetScan 8.0網站（https：//www.targetscan.org/vert_80/），進入miRBase數據庫，在搜索欄中輸入“miR-27a-3p”，在搜索結果中選擇“miR-27a-3p”，然后選擇“預測靶基因”選項，輸入要查詢SLC7A11基因名稱，點擊“搜索”或相應的按鈕以執行搜索，頁面將顯示與SLC7A11相關的miR-27a-3p的預測結合位點信息。

1.9 硫代巴比妥酸顯色法檢測結直腸癌細胞中丙二醛含量

用雙蒸水配置濃度為0、1、2、5、10、20和50 μmol/L丙二醛標準品。取“1.4”人結直腸癌HT-29和SW480細胞，分組轉染24 h；胰酶消化、收集；加入500 μL細胞裂解液冰上放置30 min；12 000×g離心10 min；取200 μL丙二醛檢測工作液分別加入細胞裂解液上清液和標準品中，充分混勻，100 ℃沸水浴加熱15 min；冷卻至室溫，1 000×g離心10 min；取200 μL上清液加入96孔板中，用酶標儀檢測530 nm處光密度值。根據標準品濃度繪制標準曲線，并計算各組細胞丙二醛含量。

另配置濃度為0、10、20、50、100、200 μg/mL牛血清白蛋白標準品，取100 μL細胞裂解液，加入BCA檢測液，37 ℃孵育30 min；用酶標儀檢測562 nm處光密度值，并根據標準品濃度繪制標準曲線，計算各組總蛋白含量。最后用各組細胞丙二醛含量和總蛋白含量計算丙二醛相對含量。

1.10 統計分析

采用GraphPad 8.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Erastin對結直腸癌細胞SLC7A11 mRNA表達水平的影響

qRT-PCR結果顯示，不同濃度Erastin處理HT-29細胞和SW480細胞24 h后，與0 μmol/L Erastin組相比，2.5 μmol/L Erastin組和5 μmol/L Erastin組SLC7A11 mRNA表達水平顯著升高（P均＜0.01）；與2.5 μmol/L Erastin組相比，5 μmol/L Erastin組SLC7A11 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）。見圖1。由此可見，兩種結直腸癌細胞中SLC7A11 mRNA表達水平呈一定Erastin濃度依賴性升高，故選用5 μmol/L Erastin進行后續實驗。

2.2 敲低SLC7A11對Erastin處理的結直腸癌細胞活性的影響

與siControl組相比，siSLC7A11-1組和siSLC7A11-2組人結直腸癌HT-29和SW480細胞48 h和72 h細胞活性均顯著增強（P均＜0.01），siSLC7A11-1組和siSLC7A11-2組各個時間點間細胞活性比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見圖2。

與miR-NC組相比，miR-27a-3p組結直腸癌HT-29和SW480細胞72 h細胞活力顯著升高（P均＜0.01），anti-miR-27a-3p組細胞活力顯著降低（P均＜0.01）。見圖2。

2.3 miR-27a-3p調控SLC7A11 mRNA表達

qRT-PCR結果顯示，在人結直腸癌HT-29和SW480細胞中，與miR-NC組相比，miR-27a-3p組SLC7A11 mRNA表達水平顯著降低（P均＜0.01），anti-miR-27a-3p組SLC7A11 mRNA表達水平顯著升高（P均＜0.01，圖3A）。

采用在線工具Targetscan 8.0預測靶向SLC7A11的microRNAs，結果發現miR-27a-3p可與SLC7A11 mRNA 3′UTR區域結合（圖3B）。熒光素酶活性檢測結果顯示，在轉染SLC7A11-WT報告基因質粒的細胞中，與miR-NC組相比，miR-27a-3p組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），而anti-miR-27a-3p組熒光素酶活性顯著升高（P＜0.01）；在轉染SLC7A11-Mut報告基因質粒的細胞中，與miR-NC組相比，miR-27a-3p組和anti-miR-27a-3p組細胞熒光素酶活性沒有顯著變化（P均＞0.05，圖3C）。

2.4 miR-27a-3p對結直腸癌細胞丙二醛含量的影響

結果顯示，在結直腸癌SW480和HT-29細胞中，與siControl組相比，siSLC7A11-1組和siSLC7A11-2組丙二醛含量顯著降低（P均＜0.01）；與miR-NC組相比，miR-27a-3p組丙二醛含量顯著降低（P＜0.05），anti-miR-27a-3p組細胞丙二醛含量顯著升高（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

研究顯示，在細胞鐵死亡過程中，活性氧激活的下游信號通路可上調SLC7A11表達，SLC7A11高表達可降低細胞氧化應激水平，減緩鐵死亡［12］。本研究結果顯示，在人結直腸癌HT-29和SW480細胞中，在Erastin誘導的結直腸癌細胞鐵死亡過程中，SLC7A11 mRNA表達水平顯著升高，且呈一定的Erastin濃度依賴性，利用RNA干擾技術敲低SLC7A11 mRNA表達可增強細胞對Erastin的耐受。其中，Erastin是一種可抑制細胞半胱氨酸攝取誘導細胞鐵死亡的工具藥［13］。由此表明，SLC7A11可能在結直腸癌的發生發展過程中發揮抑制腫瘤鐵死亡，促進腫瘤進展的作用。

研究發現，在乳腺癌、胃癌中，SLC7A11可以結合多種miRNA，如miR-26b［14］和miR-375［15］，并受其調控。本研究結果顯示，miR-27a-3p可靶向結合SLC7A11 3′UTR區，當人結直腸癌HT-29和SW480細胞中過表達miR-27a-3p可顯著抑制SLC7A11 mRNA表達，而抑制miR-27a-3p則促進SLC7A11 mRNA表達；熒光素酶報告基因實驗也進一步證實miR-27a-3p可直接作用于SLC7A11 mRNA 3′UTR。由此可見，在結直腸癌細胞中，miR-27a-3p可直接靶向SLC7A11并調節其mRNA表達。研究發現，miR-27a-3p高表達可促進結直腸癌的發展［9］。Su等［16］研究發現，miR-27a-3p在結直腸癌組織和細胞系中呈高表達，敲低miR-27a-3p可抑制結直腸癌細胞系HCT-116增殖，促進其凋亡。

細胞鐵死亡常常伴隨細胞脂質過氧化，其中丙二醛是脂質過氧化的主要產物。本研究結果顯示，與miR-NC組相比，miR-27a-3p組丙二醛含量顯著下降（P＜0.05），由此表明，在結直腸癌HT-29和SW480細胞中，敲低miR-27a-3p可增強Erastin誘導的脂質過氧化，過表達miR-27a-3p則相反；結合miRNA靶基因數據庫及熒光素酶報告基因實驗，miR-27a-3p可通過抑制SLC7A11表達進而抑制結直腸癌細胞的鐵死亡。由于本實驗過程排除了細胞異質性產生的干擾，由此表明，miR-27a-3p/SLC7A11對結直腸癌細胞鐵死亡的調控機制趨于保守，且該調控機制與Lu等［10］在非小細胞肺癌中的研究結果相一致。然而，本研究也存在不足：在鐵死亡過程中，miR-27a-3p表達水平變化及其調控機制未深入研究；盡管人結直腸癌SW480和HT-29細胞是兩種常用的結直腸癌細胞，但兩者均存在一定的遺傳異質性［17］，若能從結直腸癌組織中培養原代細胞，更具有結直腸癌原始腫瘤組織的特性，有待后續深入探究。

綜上所述，miR-27a-3p可能通過靶向SLC7A11 mRNA 3′UTR，調控Erastin誘導的人結直腸癌HT-29和SW480細胞鐵死亡。

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［收稿日期］ 2023-02-20" ［編輯］ 劉星星

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（82002474）

［作者簡介］張耀月（1990—），女，主治醫師，主要從事消化道腫瘤疾病的化療、靶向及免疫治療等；石悅（通訊作者），主治醫師，E-mail： 17601650540@163.com