斑馬魚tectb內耳基因敲除品系的構建及其作用機制

摘 要：TECTB基因編碼的β-蓋膜蛋白（β-tectorin）在人類聽覺功能中具有重要的調控作用，是內耳器官中覆蓋膜的重要組成成分，在聲音轉導為神經信號的過程中發(fā)揮著關鍵作用。β-tectorin突變會導致人類非綜合征性耳聾的發(fā)生，而目前關于聽覺障礙發(fā)生的分子機制仍然有待研究。斑馬魚（Danio rerio）是一種常用的試驗動物模型，能夠對內耳發(fā)育和相關疾病的研究提供重要的價值。為了研究tectb基因在斑馬魚內耳發(fā)育中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，成功構建tectb內耳基因缺失型斑馬魚模型，并對tectb基因缺失的斑馬魚表型進行初步分析。首先，在tectb基因的第三號外顯子上設計靶位點以及基因型檢測引物，經體外擴增得到向導DNA（sgDNA），再對其進行體外轉錄，得到向導RNA（sgRNA）；然后，將sgRNA與Cas9酶通過顯微注射的方式注射到野生型斑馬魚胚胎中，經基因型鑒定篩選出攜帶突變的嵌合體F0代魚，培養(yǎng)至性成熟后與野生型斑馬魚雜交得到F1代突變體雜合子；在遺傳穩(wěn)定性鑒定及基因序列測序之后，保留突變類型為移碼突變的F1代魚，培養(yǎng)至成年后，經過自交得到F2代tectb突變體純合子；最后，通過體式顯微鏡初步觀察及毛細胞染色試驗，發(fā)現(xiàn)突變體斑馬魚內耳組織結構正常，耳石形態(tài)和大小沒有明顯差異，毛細胞的發(fā)育也沒有明顯缺陷，但是體內器官與組織的發(fā)育是否發(fā)生變化，需要進行深入研究。這項研究為深入了解內耳發(fā)育的分子機制和耳聾等人類疾病提供了有價值的研究模型，借助tectb基因敲除斑馬魚模型，我們可以探究該基因在疾病發(fā)生中的具體作用，更好地研究內耳發(fā)育中的關鍵途徑，有利于進一步深入研究聽力的調控機制。

關鍵詞：斑馬魚；tectb；CRISPR/Cas9；內耳發(fā)育；毛細胞

中圖分類號：Q341；Q812 " " " " " " " " " " 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.02.006

Construction and Mechanism of tectb Inner Ear Gene Knockout Line in Zebrafish

LIU Ling， ZHU Junwei， ZENG Ting， XIE Binling， TAO Guifang， ZHU Xianyu， XIE Huaping*

（Laboratory of Animal Nutrition and Human Health， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract： β-tectorin， encoded by the TECTB gene， plays an important regulatory role in human hearing function， is an important component of the covering membrane in the inner ear organ， and plays a key role in the process of sound transduction into neural signals. The mutation of β-tectorin can lead to the occurrence of non-syndromic deafness in humans. However， the molecular mechanism of hearing impairment remains unclear. To study the role of the tectb gene in zebrafish inner ear development， this study successfully constructed a zebrafish model with tectb gene deletion using CRISPR/Cas9 gene editing technology and conducted a preliminary analysis of the phenotype. First， target sites and genotype identification primers were designed on exon 3 of tectb gene. Guide DNA （sgDNA） was amplified in vitro， next guide RNA （sgRNA） was obtained by in vitro transcription. Then， sgRNA and Cas9 enzymes were co-injected into wild-type zebrafish embryos by microinjection. After genotyping， the mutant chimera F0 generation fish were screened; and after being raised to adult， they were crossed with wild-type zebrafish to obtain the mutant heterozygotes of the F1. After genetic stability identification and sequencing， F1-generation fish with frameshift mutation were raised to adulthood， they were crossed to obtain F2 tectb homozygotes. Finally， through observation and hair cell staining experiments， it was found that the inner ear structure of the homozygotes mutant zebrafish appears normal， with no obvious difference in the shape and size of the otolith， and no obvious defect in the development of hair cells. However， whether there were changes in the development of internal organs and tissues should be further studied. This study provides us with a research model to gain insight into the molecular mechanisms of inner ear development and human diseases. With the help of the tectb gene knockout zebrafish model， we can elucidate the role of this gene in diseases and better understand the pathways involved in inner ear development， which is conducive to further research on the regulatory mechanism of hearing.

Key words： zebrafish; tectb; CRISPR/Cas9; inner ear development; hair cells

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（2）： 143-150）

在內耳柯替氏器（corti）中，毛細胞立體纖毛束的頂端被一種稱為覆蓋膜（tectorial membrane，TM）的凝膠狀基質所覆蓋［1］。哺乳動物的TM是由3種不同的膠原蛋白（II、V和IX型）和3種非膠原性糖基化多肽組成的，被稱為α-蓋膜蛋白（α-tectorin）、β-蓋膜蛋白（β-tectorin）和耳膠蛋白（otogelin）［2-6］。TM是一種沿耳蝸長螺旋排列的細胞外結構，它在由聲音觸發(fā)的基底膜振動過程中使毛細胞的立體纖毛偏轉，而毛細胞有助于將聲音轉導為神經信號［7-8］。α-tectorin和β-tectorin屬于含有透明帶（zona pellucida，ZP）結構域的蛋白質家族。ZP最初是作為一種包圍在卵母細胞質膜周圍的糖蛋白被發(fā)現(xiàn)的，它在受精過程中起著重要的作用。ZP結構域是許多胞外蛋白所共有的一個序列，具有從結構組分到受體的多種功能［9］。ZP結構域由8～10個保守的半胱氨酸殘基、1個C末端、1個疏水性跨膜區(qū)和1個短的細胞質尾部組成［10-11］。含有ZP結構域的蛋白質在所有物種中均高度保守，通常是糖基化的，存在于纖維和/或基質中，在蛋白質聚合中起著重要的作用［9，12］。

據報道，α-tectorin或β-tectorin的突變會導致人類非綜合征性耳聾［13］。對人類α-tectorin基因TECTA的研究表明，它與語前非進行性耳聾的DFNA8（MIM601543）和DFNA12（MIM601842）［14］基因上的顯性形式或DFNB21基因上的隱性形式有關［15］。另一方面，編碼β-tectorin的TECTB在維持TM的正常功能方面也發(fā)揮著重要的作用。先前對基因敲除小鼠的研究報告稱，Tectb-/-小鼠的條紋片狀基質（striated-sheet matrix，SSM）結構被破壞，耳蝸調諧被銳化［16］，而有助于維持TM彈性的β-tectorin也參與了SSM的組成［17］。總而言之，這兩種蓋膜蛋白對于維持內耳的正常聽覺功能都很重要。

目前只有哺乳動物和雞的蓋膜蛋白被鑒定和克隆［18］。斑馬魚（Danio rerio）β-tectorin及其在胚胎發(fā)育中的作用知之甚少。斑馬魚作為研究內耳發(fā)育相關基因的模型動物有許多優(yōu)點：第一，斑馬魚的卵在體外發(fā)育；第二，斑馬魚的耳朵在生命的最初幾周是透明的；第三，正向基因篩選和反義技術已經成熟［19］。斑馬魚的內耳系統(tǒng)由半規(guī)管、耳石和由毛細胞形成的不同感覺塊組成。半規(guī)管附著在稱為嵴（cristae）的感覺上皮上，嵴對于感知頭部位置和角加速度很重要。被稱為耳石的多晶團與2個或2個以上的黃斑器官相連，這些器官被稱為球囊或橢圓囊［19］。

斑馬魚被認為是硬骨魚家族中一種聽力很好的魚，因為韋伯氏聽小骨的功能是將魚鰾連接到球囊上，從而實現(xiàn)聲音放大［20-21］。因為沒有耳蝸，斑馬魚內耳的結構與哺乳動物內耳的結構有很大的不同，但其操作的便利性以及內耳發(fā)育的進化保守的分子機制使斑馬魚成為研究內耳發(fā)育的良好動物模型［22］。但目前對于其中的致病機理和分子調控機制鮮有了解，因此，本研究利用斑馬魚作為模式動物，對β-tectorin在斑馬魚內耳發(fā)育過程中的功能及其作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

本試驗所使用的野生型斑馬魚為TU品系，由湖南師范大學動物營養(yǎng)與人體健康實驗室養(yǎng)殖。成魚養(yǎng)殖水溫為（28.5±1.0）℃，pH值維持在7.5左右，人工模擬光照條件為14 h光照和10 h黑暗交替循環(huán)。斑馬魚幼魚從第5天開始喂食草履蟲（Paramecium），第20天左右轉移至系統(tǒng)架上喂食豐年蟲（Artemia sinica）。經過2至3代繁殖后，取3至6月齡的斑馬魚用于產卵。

1.1.2 試驗試劑

Endo-Free Plasmid Mini Kit Ⅱ（DP106，Omega公司）；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（B518131，上海生工生物工程股份有限公司）；T7體外轉錄試劑盒（E131，蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司）；RNA純化試劑盒（74104，Qiagen公司）；Cas9蛋白（A36498，Invitrogen公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Sanger測序委托北京擎科生物科技有限公司進行。

1.1.3 試驗儀器

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（愛生生物公司）；-80℃超低溫冰箱（海爾公司）；PCR儀（Eppendorf）；凝膠成像儀（Bio-Rad）；小型電泳槽（Bio-Rad Mini-Sub Cell GT）；體式熒光顯微鏡（Zeiss）；移液槍（Eppendorf）。

1.2 試驗方法

1.2.1 向導RNA（sgRNA）靶位點設計

在Ensembl網站（http：//www.ensembl.org/index.html）上查找到斑馬魚tectb基因的完整基因組序列（ENSDARG00000045268）信息，然后，在E-CRISP網站（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP）上篩選出一對靶序列并評估其脫靶情況，再根據所選定的靶位點在Primer3網站（https：//primer3.ut.ee/）上設計一對基因型檢測引物tectb-F和tectb-R。sgRNA正向引物序列的構成為：保護堿基（GCG）+T7啟動子（TAATACGACTCACTATA）+靶序列+sgRNA骨架上游序列（GTTTTAGAGCTAGAAATAG）。sgRNA的反向引物序列為固定序列：AAGCACCGACTCGGTGCCACT（表1）。

1.2.2 合成sgRNA

以Template DNA序列作為模板［23］，sgRNA1-F/sgRNA-R和sgRNA2-F/sgRNA-R作為引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），得到DNA模板，再通過瓊脂糖凝膠電泳以及膠回收試劑盒對DNA進行回收、純化；使用T7體外轉錄試劑盒將所得DNA進行體外轉錄，再通過瓊脂糖凝膠電泳判斷轉錄是否成功，若電泳條帶清晰且明亮，則證明成功轉錄；之后再進行RNA純化，將所得sgRNA樣品放入-80℃冰箱中存儲備用。

1.2.3 顯微注射

注射前1天晚上，將斑馬魚按照1：1的雌雄比例放在雜交缸中，第2天8：00拔出中間隔板并更換新的養(yǎng)殖水。待斑馬魚產卵后，15 min內收集胚胎擺放在注射模具凹槽上。從-80℃冰箱中分別取出合成好的sgRNA與Cas9充分混合并置于冰上（sgRNA≥80 ng/μL，Cas9≥300 ng/μL），注射前將混合液注入注射針中。隨后，在體式顯微鏡下逐一對斑馬魚胚胎進行顯微注射，注射后的胚胎放入培養(yǎng)液中，置于28.5℃胚胎培養(yǎng)箱，受精后每12 h對胚胎發(fā)育情況進行觀察。

1.2.4 可穩(wěn)定遺傳突變體的篩選

將注射后的胚胎培養(yǎng)至1個月左右，對幼魚逐條剪尾，提取其基因組DNA進行基因型鑒定。對基因組進行PCR擴增后再進行瓊脂糖凝膠電泳，若產物同時出現(xiàn)野生型目的條帶以及比野生型目的條帶小的條帶，那么這些幼魚為攜帶突變的F0代魚。由于F0代斑馬魚為嵌合體，因此，需要篩選出可將突變穩(wěn)定遺傳至下一代的斑馬魚。將F0代魚培養(yǎng)至性成熟后與野生型進行雜交，提取其受精卵基因組DNA并進行基因型檢測，篩選出可穩(wěn)定遺傳突變的魚，再通過Sanger測序得到突變胚胎序列信息，與野生型序列進行比對，保留移碼突變的斑馬魚繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 毛細胞染色

分別取20條基因敲除和野生型斑馬魚幼魚置于24孔板中，用含2 μmol/L惡唑黃（oxazole yellow，YO-PRO-1）染料的培養(yǎng)液培養(yǎng)，并于黑暗處過夜孵育。第2天，用不含染料的培養(yǎng)水清洗胚胎3次，每次5 min。然后使用0.4%的三卡因溶液麻醉斑馬魚，在載玻片中加入1%的低熔點瓊脂糖，將斑馬魚包埋在瓊脂糖中。在體式熒光顯微鏡下觀察毛細胞染色情況并拍照。

2 結果與分析

2.1 TECTB蛋白結構域分析

根據Ensembl數據庫的檢索，斑馬魚tectb基因位于第12號染色體，有2個不同的轉錄本，其中1個為包含內含子的可變剪接轉錄本，不編碼蛋白質，另1個轉錄本一共有11個外顯子，包含1 499個堿基，編碼336個氨基酸。之后，利用SMART網站（http：//smart.embl-heidelberg.de）對該序列的蛋白質結構域進行分析，結果如圖1所示，TECTB蛋白包含一個ZP結構域。

2.2 tectb基因敲除靶位點設計

CRISPR/Cas9是一種近年來比較常用的基因編輯工具，可對生物體的內源基因進行靶向編輯。該系統(tǒng)中的sgRNA可以識別特定序列，并將Cas9核酸酶引導至靶位點處識別并匹配間隔序列相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM），同時切割DNA雙鏈［24］。本研究在tectb基因的第3號外顯子上選擇了1對較合適的基因敲除靶位點，并通過Primer3網站設計了1對基因型檢測引物（圖2）。

2.3 tectb基因敲除sgRNA的合成

根據靶位點合成的通式，在靶位點的前面加上了保護堿基以及T7啟動子序列，后面加上了T7骨架序列（引物序列如表1所示）。以sgRNA-F作為正向引物，sgRNA-R為反向引物，將Template DNA序列作為模板進行PCR擴增，所得產物經瓊脂糖電泳進行分離純化，并經吸附柱回收及體外轉錄后得到sgRNA，放置在-80℃冰箱中保存。合成的sgRNA的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示，2個條帶大小均為100 bp左右，單一且明亮，說明成功合成了sgRNA。

2.4 F0代突變等位基因嵌合體成年斑馬魚的篩選

將配制好的sgRNA及Cas9混合溶液注射至野生型斑馬魚胚胎卵黃中，每顆胚胎中注射大約1 nL，本次試驗大約注射300枚胚胎。待其發(fā)育至受精后40 d左右時，逐條剪尾并進行編號，提取尾鰭基因組DNA，并將其作為PCR模板進行基因型鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖4所示，第12條泳道出現(xiàn)了1條較野生型條帶更小的條帶，說明第12號魚為基因組被成功編輯的F0代嵌合體魚。

2.5 穩(wěn)定遺傳突變體的篩選及Sanger測序

將上一步試驗篩選得到的F0代嵌合體養(yǎng)至性成熟（約3個月大小），與野生型斑馬魚進行雜交，所產下的胚胎即為F1代突變體。隨機挑選發(fā)育至36 h的胚胎，提取其基因組DNA進行基因型鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖5所示，第1、6、15、20號胚胎出現(xiàn)與F0代一致的電泳條帶，表明我們挑選的F0代魚的生殖細胞同樣也發(fā)生了基因編輯，可以將其攜帶的基因突變遺傳給下一代。隨后，對遺傳突變的F1代魚進行Sanger測序，并將測序結果與野生型斑馬魚tectb基因序列進行比對，結果如圖6所示，該突變體斑馬魚的tectb基因共缺失31 bp堿基，導致其開放閱讀框發(fā)生移碼突變，并提前使蛋白質翻譯終止。通過SMART網站對突變斑馬魚的氨基酸序列進行分析，結果表明，該突變斑馬魚無法正常編碼ZP結構域，證明已成功構建出了可遺傳的tectb基因敲除斑馬魚品系。

2.6 tectb突變體F2代純合子篩選

經過上一步基因型鑒定，將攜帶突變的斑馬魚培養(yǎng)至性成熟之后進行自交，根據孟德爾遺傳定律，得到的F2代斑馬魚中有野生型、雜合子以及純合子3種類型。將斑馬魚胚胎養(yǎng)至成年，提取其尾鰭基因組進行PCR擴增反應，再經過瓊脂糖凝膠電泳篩選出F2代純合突變體。結果如圖7所示，16條雜合子自交所產下的F2代斑馬魚中含有6條tectb突變純合子（第1、5、6、7、9、11號魚）。這證明了tectb基因突變斑馬魚可正常發(fā)育并存活至成魚。

2.7 形態(tài)學觀察及毛細胞染色

取相同培養(yǎng)條件下的野生型和突變體斑馬魚，每隔12 h對它們的內耳發(fā)育情況進行觀察，并使用體視顯微鏡對發(fā)育至第5天的斑馬魚進行整體拍攝。結果如圖8所示，與野生型相比，突變體斑馬魚的內耳（圖中紅色框所示）未出現(xiàn)明顯缺陷，大、小耳石均發(fā)育正常，且整體形態(tài)也并未出現(xiàn)異常。隨后，利用YO-PRO-1染料對野生型和突變體斑馬魚的毛細胞進行染色。結果如圖9所示，突變體毛細胞發(fā)育正常，說明敲除tectb基因對斑馬魚胚胎的早期發(fā)育沒有顯著影響。對突變體進行持續(xù)觀察至成年，均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

3 討論

哺乳動物的內耳可以根據聲音的頻率來區(qū)分聲音，這種能力的喪失會削弱在嘈雜環(huán)境中對語言的理解，而這是助聽器無法彌補的，而且其分子機制還不清楚。聽力障礙遺傳模型的發(fā)展為研究哺乳動物頻率選擇性的細胞和分子機制提供了重要的價值［25］。在迄今發(fā)現(xiàn)的約400種聽力障礙突變體中［26］，有驚人數量的基因特異性靶向覆蓋在毛細胞上的細胞外基質TM上［27-29］。TM產生缺陷后，人體表現(xiàn)出很明顯的聽力障礙，但這些缺陷背后的物理機制仍未被理解。

在組成TM的非膠原蛋白中，TECTA和TECTB在蛋白質含量中占主導地位。在小鼠中，它們的mRNA在大約出生22 d后就不再表達，因此，在老年動物中需要由其他蛋白質的持續(xù)產生（如CEACAM16）來維持TM膠原纖維基質的穩(wěn)定性［30-31］。有趣的是，β-tectorin在斑馬魚耳蝸組織中不是作為TM的成分表達，而是在斑馬魚耳朵的前后黃斑中表達。Yang等［32］對斑馬魚β-tectorin進行了嗎啉（morpholino，MO）敲低試驗，結果表明，突變斑馬魚幼體無法形成正常的耳石，表現(xiàn)為大小耳石融合或只有一個耳石，同時還表現(xiàn)出無法保持平衡和漂浮的情況。為了進一步探究β-tectorin在內耳發(fā)育中的調控機制，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，在斑馬魚中對tectb基因進行了基因敲除，使斑馬魚TECTB蛋白翻譯提前終止，無法正常編碼ZP結構域，喪失功能。通過后續(xù)的觀察，并未發(fā)現(xiàn)突變體較野生型斑馬魚出現(xiàn)明顯的內耳發(fā)育缺陷，游泳狀態(tài)正常，內耳及側線毛細胞均發(fā)育正常，純合子突變斑馬魚可以正常發(fā)育至成魚并進行繁殖。該結果說明，敲除tectb基因對斑馬魚內耳及整體發(fā)育沒有顯著影響，但具體分子機制仍需要進一步探究。

除了TECTA和TECTB之外，還有一些細胞外基質蛋白在斑馬魚內耳的發(fā)育過程中同樣發(fā)揮著重要的作用。例如，敲低omp-1可導致耳石變小，敲低otolin-1可導致耳石融合，starmaker突變體表現(xiàn)出星型或塊狀耳石，且starmaker與tectb的mRNA在內耳的前后黃斑中的表達模式類似［33-34］。因此可推測，多種蛋白之間的相互作用可能是耳石形成的基礎，在完全敲除斑馬魚tectb基因之后，其他基因的過度表達代償了tectb的缺失，從而使tectb突變斑馬魚維持正常的發(fā)育與生理狀態(tài)。但仍需進一步試驗驗證這一推測。根據這項研究，后續(xù)的研究方向包括：1）進一步研究tectb基因敲除對斑馬魚內耳發(fā)育和聽覺功能的影響。通過行為學試驗、驚嚇反應和電生理學方法等評估敲除tectb基因對斑馬魚聽覺功能的影響，比如可以測量其聽覺閾值和聽覺反應的變化。2）探究tectb基因在內耳中的作用機制。可以通過免疫組織化學和整胚原位雜交等技術來研究tectb基因在內耳中的定位和表達水平，探究其在內耳中的表達模式和調控機制，以及與其他基因如tecta和starmaker等的相互作用。3）探索tectb基因的功能調控網絡。可以利用轉錄組學或蛋白質組學等高通量技術，研究tectb基因在內耳發(fā)育和聽覺功能中的調控網絡，以及敲除tectb之后其他基因的表達水平變化。4）開發(fā)tectb基因敲除斑馬魚模型的臨床應用。可以利用tectb基因敲除斑馬魚模型進行藥物篩選，為聽力障礙的治療提供新的方法。

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