柯薩奇病毒A組10型VP1蛋白線性中和表位的篩選和鑒定

摘 要：柯薩奇病毒A組10型（CV-A10）是引起手足口病（HFMD）的常見病原體之一。應用重疊肽法篩選出覆蓋CV-A10全長 VP1區氨基酸序列的39條候選表位肽段，以間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）及微量中和抑制試驗驗證。結果發現，候選表位P6（CV-A10 VP1區第39～53位氨基酸）與CV-A10全病毒抗血清具有高反應性，且在3.91 μg/mL的稀釋質量濃度時仍具有中和抑制作用，為潛在中和表位。用P6肽免疫小鼠制備相應的抗血清，并以微量中和試驗驗證其保護能力，結果顯示，P6抗血清的幾何平均中和效價為1：8.97，可確定P6為CV-A10的中和表位。為了解P6序列在CV-A10型內的保守性，將P6的氨基酸序列與CV-A10各基因型代表株進行比對分析，結果顯示，P6在CV-A10型內高度保守，表明P6為CV-A10的廣譜性中和表位，可應用于CV-A10表位疫苗的研發。本研究旨在篩選鑒定CV-A10 VP1蛋白上的線性中和表位，為CV-A10表位疫苗的研發和HFMD的防控奠定基礎。

關鍵詞：柯薩奇病毒A組10型；VP1蛋白；線性中和表位；疫苗；手足口病

中圖分類號：R373.2；R512.5 " " " " " " " " " "文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.02.008

Screening and Identification of Linear Epitopes on the VP1 Protein of Coxsackievirus A10

GAN Yanmei1#， HE Yunyi2#， QU Ying1， WU Yue1， LIU Qiliang3*， LIU Hongbo1， 2*

（1. Department of Laboratory Medicine， the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin 541199， China; 2. College of Medical Laboratory Science， Guilin Medical University， Guilin 541199， China; 3. College of Intelligent Medicine and Biotechnology， Guilin Medical University， Guilin 541199， China）

Abstract： Coxsackievirus A10 （CV-A10） is one of the most common pathogens causing hand， foot and mouth disease （HFMD）. The 39 candidate epitope peptides covering the amino acid sequence of the VP1 region of CV-A10 were screened by using the overlapping peptide method and verified by indirect enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） and microneutralization inhibition assays. It has been found that candidate epitope P6 （amino acid 39～53 in VP1 region of CV-A10） showed high reactivity with CV-A10 virus serum， and still showed neutralizing inhibition effect at 3.91 μg/mL dilution mass concentration， which was a potential neutralizing epitope. P6 antiserum was prepared by immunizing mice with P6 peptide， and microneutralization test was used to verify its protective effect. The results showed a 1：8.97 geometric mean neutralizing titer for P6 antiserum， which identified P6 as the neutralizing epitope of CV-A10. In order to understand the conservativeness of P6 sequence in CV-A10， the amino acid sequence of the P6 was compared with the representative strains of CV-A10 genotype， and the results showed that P6 was highly conserved in CV-A10. It indicated that P6 is a conserved linear neutralization epitope of CV-A10， which has the potential to resist the infection of various genotypes of CV-A10， and can be used as a target for the development of CV-A10 epitope vaccine. This study aimed to screen and identify linearly neutralizing epitopes on the CV-A10 VP1 protein and to lay a foundation for the development of CV-A10 epitope vaccine and HFMD prevention.

Key words： coxsackievirus A10; VP1 protein; linear neutral epitope; vaccine; hand， foot and mouth disease

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（2）： 160-166）

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由腸道病毒（enteroviruses，EVs）感染所致的兒童常見傳染病［1-3］。其發病多表現為發熱，口腔、手、足及臀部皮疹或水泡等癥狀，嚴重時可引起腦膜炎、急性弛緩性麻痹等中樞神經系統并發癥，甚至危及患兒的生命［3-5］。腸道病毒A組71型（enterovirus A71，EV-A71）和柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus A16，CV-A16）是引起HFMD的常見病原體［6-8］。但隨著HFMD病原譜的不斷變化，由柯薩奇病毒A組10型（coxsackievirus A10，CV-A10）感染引起的HFMD呈逐步上升的趨勢，CV-A10現已成為非EV-A71和非CV-A16致HFMD的主要病原［9-10］。與此同時，多項研究發現，CV-A10與重癥HFMD相關，可能是致重癥HFMD的主要病原［11-13］。然而，目前尚無可用的疫苗及特異抗病毒藥物，因此，研發CV-A10疫苗對于預防控制CV-A10的流行具有重要意義。

表位疫苗是借助基因工程，以體外表達或化學合成病原微生物抗原表位為基礎的一類新型疫苗，較傳統的滅活疫苗具有安全無毒、可針對性誘發免疫應答、易于生產和更新等優勢［13-15］。成熟的CV-A10病毒顆粒與其他EVs結構一致，為四種結構蛋白（viral protein，VP）（VP1、VP2、VP3及VP4）組成的二十面體對稱的球形顆粒。其中VP1蛋白位于病毒顆粒表面，是抗原中和表位和病毒受體識別位點集中的區域，為疫苗研制的主要靶點［16-18］。本研究以CV-A10 VP1蛋白為研究對象，采用重疊肽法篩選以及試驗鑒定的方法確定CV-A10的線性中和表位，為CV-A10表位疫苗的研發和HFMD的防控工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞及毒株

人橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）細胞為本課題組保存；CV-A10分離株（CV-A10 P148/ZS/CHN/2012，以下簡稱CV-A10 P148）（GenBank：MK645898）由HFMD患者糞便中分離。

1.2 主要儀器及試劑

酶標儀購自賽默飛公司；杜氏改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium， DMEM）、胰酶-乙二胺四乙酸細胞消化液購于Gibco公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠IgG購于Proteintech公司；辣根過氧化物酶-四甲基聯苯胺（horse radish peroxidase-tetramethylbenzidine，HRP-TMB）顯色試劑盒購于Takara公司；96微孔板、T25細胞培養瓶、酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于Thermo公司。

1.3 表位的篩選、合成及抗體獲得

應用相鄰兩肽重疊8個氨基酸的重疊肽法，篩選覆蓋CV-A10 P148分離株VP1蛋白的長度為15個氨基酸的候選表位，共39條；通過化學法合成篩選出的候選表位肽段，各肽段純度均大于90%；表位抗體由候選表位多肽偶聯鑰孔血藍蛋白后輔以弗氏佐劑免疫小鼠所得；CV-A10抗體由滅活的 CV-A10 P148分離株免疫小鼠所得。

1.4 候選表位的反應性測定

應用間接ELISA法測定表位多肽與CV-A10病毒血清的反應性。以丙型肝炎病毒包膜蛋白E2（hepatitis C virus envelope protein E2，HCV-E2）肽為陰性對照，CV-A10病毒血清（1：2 000體積比稀釋）為一抗，HRP標記IgG抗體（1：5 000體積比稀釋）為二抗，進行ELISA反應。反應結束后以TMB顯色，硫酸溶液終止，并在450 nm波長處檢測各反應孔吸光度（optical density，OD）值，以大于等于陰性對照孔OD值的2.1倍為陽性判定標準。

1.5 候選表位的中和抑制能力測定

應用微量中和抑制試驗篩選候選表位的中和抑制潛能。將高反應性表位多肽進行2倍質量比系列稀釋，質量濃度范圍為1.95～62.50 μg/mL；取各稀釋表位多肽50 μL與相同體積的CV-A10病毒血清在微孔板中混合，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育2 h；每孔加入25 μL的半數組織培養感染劑量（50% tissue culture infective dose，TCID50 ）為100的CV-A10病毒以及100 μL每毫升2×105 個的RD細胞，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，同時設置CV-A10病毒+RD細胞混合孔為陽性對照孔，CV-A10病毒血清+CV-A10病毒+RD細胞懸液混合孔為陰性對照孔，逐日觀察各反應孔細胞病變效應（cytopathic effect，CPE）。當陽性對照組細胞全部出現CPE，陰性對照組細胞生長正常時，能使50%的細胞出現CPE的表位多肽則被認為具有中和抑制作用，判為陽性，反之判為陰性。

1.6 候選中和表位的抗體中和效價測定

應用微量中和試驗檢測候選中和表位的抗體中和效價。將滅活的候選表位抗體進行2倍體積比系列稀釋，稀釋度為1：2、1：4、1：8、1：16、1：32；取各稀釋度抗體25 μL與相同體積的100 TCID50 CV-A10病毒在微孔板中混合，置于37℃培養箱中孵育2 h；每孔加入100 μL每毫升2×105個的RD細胞，輕震混勻后置于37℃、5% CO2培養箱中培養，同時設置病毒對照、抗體對照和細胞對照；逐日觀察各反應孔CPE，待病毒對照孔內細胞全部出現CPE時，以能保護50%細胞不出現CPE的血清最高稀釋度的倒數為抗體的中和效價。

1.7 候選中和表位的序列保守性分析

基于全長VP1區核苷酸序列，利用序列劃分工具（sequence demarcation tool，SDT）軟件，以Muscle法將CV-A10 P148分離株與NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中獲取的CV-A10分離株進行一致性分析，以熱圖中核苷酸序列一致性大于85%為基因型劃分標準；利用Clustal X2軟件對上述分型的CV-A10分離株的氨基酸序列進行比對，分析候選中和表位在CV-A10型內的保守性。

2 結果與分析

2.1 候選表位的反應性

間接ELISA檢測結果顯示，通過重疊肽法篩選的39條肽段中，P1、P6、P15、P17和P33 共5條肽段與CV-A10病毒血清反應明顯，為CV-A10的候選表位（圖1）。候選表位對應的氨基酸序列信息見表1。

2.2 候選表位的中和抑制效果

微量中和抑制試驗結果顯示，候選表位P1和P6具有高中和抑制作用，其在3.91 μg/mL的低質量濃度時仍能抑制CV-A10病毒血清的中和作用；P15的中和抑制作用較弱，其在稀釋質量濃度低于31.25 μg/mL時中和抑制作用消失；P17、P33在各稀釋質量濃度中均未見有中和抑制作用（表2）。

2.3 候選中和表位抗體的中和能力

用上述具有高中和抑制作用的P1和P6肽免疫小鼠制備相應的抗體，以微量中和試驗檢測P1抗體、P6抗體的中和效價。試驗結果顯示，P1抗體的幾何平均中和效價為1：2，與陰性對照組無顯著性差異，表明P1抗體沒有中和CV-A10的能力，P1為非中和表位；P6抗體的幾何平均中和效價為1：8.97（gt;1：8），與陰性對照組相比具有顯著性差異（Plt;0.01），表明P6抗體具有中和CV-A10的能力，P6為中和表位（圖2）。

2.4 表位P6的氨基酸序列保守性

利用SDT軟件進行分析，根據核苷酸序列一致性大于85%的分型標準，CV-A10可劃分為A～G共 7個基因型。本研究所用的CV-A10 P148分離株屬于C基因型（圖3）。利用Clustal X2軟件對CV-A10各基因型分離株的氨基酸序列進行比對分析，比對結果顯示，線性中和表位P6在CV-A10的各基因型內具有高度保守性，僅與B基因型CV-A10中的一株代表株發生一個R43C突變（圖4）。

3 討論

表位疫苗因具有特異性強、安全性高、易更新、低成本等特點，已成為未來疫苗發展的新方向。中和表位的篩選鑒定是表位疫苗研發的重要一環，其中重疊肽法篩選中和表位是通過連續合成目標病原體的重疊氨基酸多肽片段，并以抗體結合試驗、微量中和試驗來確定的。與晶體衍射法［19］、丙氨酸掃描法［20］、生物信息學預測方法［21-22］等相比，重疊肽法更為高效、經濟且易操作，已在流感病毒［23］、人類免疫缺陷病毒［24］、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2［25］等病毒疫苗的研發中廣泛應用。

本研究選擇相鄰肽段重疊8個氨基酸的重疊肽法，合成了39條覆蓋CV-A10全長 VP1區的15個氨基酸單位長度的候選表位肽段（P1～P39）。利用抗原表位的免疫原性及免疫反應性，以間接ELISA和微量中和抑制試驗對篩選的候選表位進行驗證，結果發現，有5條候選表位肽段（P1、P6、P15、P17、P33）與CV-A10病毒血清結合呈現高反應性，其中P1和P6具有較高的中和抑制能力，即在3.91 μg/mL的低質量濃度時，其仍可抑制CV-A10病毒血清的中和作用，表明P1和P6為潛在的中和表位。由于表位疫苗主要通過免疫機體產生相應中和抗體來阻斷病毒的感染以達到保護效果，所以，為了進一步明確P1、P6是否能夠誘導機體產生功能性中和抗體，本研究利用P1、P6免疫血清進行了微量中和試驗。試驗結果顯示，P1抗體和P6抗體的幾何平均中和效價分別為1：2和1：8.97（gt;1：8），且P6抗體組與陰性對照組相比具有顯著性差異（Plt;0.01），表明僅P6為CV-A10的線性中和表位。

由于CV-A10為無包膜的單股正鏈RNA病毒，其在傳播過程中很容易發生適應性變異。故而為了檢驗鑒定到的中和表位P6是否在CV-A10型內具有保守性，本研究首先以VP1序列核苷酸一致性大于85%的分型標準將CV-A10劃分為了A～G 共7個基因型，其分型結果與既往研究相符［26-28］。根據分型結果，本研究所用的CV-A10 P148分離株屬于C基因型，而我國CV-A10分離株也主要位于C基因型組內，提示CV-A10 P148分離株具有我國流行的CV-A10代表性。將P6與CV-A10各基因型分離株進行氨基酸序列比對，結果顯示，P6在CV-A10型內具有高度保守性，僅與B基因型CV-A10中的一株代表株出現一個氨基酸差異。因此，P6為CV-A10的廣譜性中和表位。

本研究中制備的P6抗體雖具有中和保護作用，但其中和效價較低，可能是因為單個線性表位多肽刺激機體產生的免疫應答效應有限［29］。因此，通過使用重復的串聯表位［30-31］、改善抗原呈遞方式［31-32］以及更換強免疫刺激佐劑［31，33］等方法有望提高P6表位的免疫原性。另外，線性表位是由一段序列相鄰的氨基酸組成的，關鍵氨基酸殘基的缺失可影響表位功能，故而本研究重疊肽法中單位肽段長度及重疊氨基酸數目的選擇可能使得一些表位被遺漏。盡管如此，本研究鑒定到的中和表位P6，其作為靶點制備的疫苗，具有抵抗CV-A10各基因型毒株感染的潛能，可以用于CV-A10表位疫苗的研發。

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