miR-126對皮膚黑色素瘤C8161遷移、侵襲作用機制的研究

摘 要：本研究主要觀察微小RNA-126-3p（miR-126）的差異性表達對人皮膚黑色素瘤（CM）細胞株C8161的遷移、侵襲性的影響，并探究了Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號傳導與轉錄激活因子3（JAK2/STAT3）通路和上皮-間質轉化（EMT）過程在其中的角色。采用細胞轉染法實現miR-126的差異性表達，用JAK2/STAT3通路抑制劑AG490、激動劑Coumermycin A1處理miR-126差異表達的細胞，并將C8161細胞分為對照組（不做轉染，不做藥物處理）、陰性對照（NC）組（轉染模擬物對照，不做藥物處理）、miR-126組（轉染miR-126模擬物，不做藥物處理）、miR-126+通路抑制劑組（轉染miR-126模擬物后AG490處理）和miR-126+通路激動劑組（轉染miR-126模擬物后Coumermycin A1處理）。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-126的表達水平；利用蛋白免疫印跡法測定EMT關鍵蛋白和JAK2/STAT3通路蛋白的表達水平；利用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）、劃痕愈合試驗、Transwell小室聯合基質膠法分別檢測細胞的活力、遷移和侵襲能力。與NC組相比，miR-126模擬物轉染使miR-126的表達水平在miR-126組顯著提高（#Plt;0.05），與此同時，相對細胞活力、細胞遷移率和細胞侵襲數均顯著降低（#Plt;0.05）。此外，miR-126組的上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）高于NC組（#Plt;0.05），而波形蛋白（vimentin）、神經鈣黏蛋白（N-cadherin）、纖維連接蛋白（FN）、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達水平和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的比值均低于NC組（#Plt;0.05）。更重要的是，與NC組和miR-126組相比，JAK2和STAT3蛋白的表達水平的上述指標在miR-126+通路抑制劑組中的變化更顯著（#Plt;0.05和amp;Plt;0.05），而上述指標在miR-126+通路激活劑組中的變化趨勢減弱（#Plt;0.05和amp;Plt;0.05），其中細胞侵襲數和FN、JAK2、STAT3蛋白的表達水平在miR-126+通路激動劑組和NC組之間無顯著差異。過表達miR-126抑制人CM細胞的活力、遷移和侵襲能力，而該作用很可能是通過阻礙EMT進程、抑制JAK2/STAT3通路的活化來實現的。這些研究結果有助于為人CM的臨床治療提供新的理論依據，為其治療方法提供新的策略。

關鍵詞：皮膚黑色素瘤；微小RNA-126-3p；Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號傳導與轉錄激活因子3；遷移；侵襲

中圖分類號：R739.5 " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.02.009

A Study on the Mechanism of miR-126 on the Migration and Invasion of Cutaneous Melanoma C8161

ZHUO Xinxin， GU Lijuan*， ZHOU Xiaohan

（Department of Dermatology and Aesthetic Surgery the Fifth People’s Hospital of Huai’an， Huai’an 223300， China）

Abstract： This study focused on the effects of the differential expression of microRNA-126-3p （miR-126） on migration and invasion of human cutaneous melanoma （CM） cell line C8161， and the role of Janus tyrosine protein kinase 2/signaling and transcriptional activator 3 （JAK2/STAT3） pathway and epithelial-mesenchymal transition （EMT） process were investigated. Dysregulation of miR-126 was achieved by cell transfection， and miR-126-deregulated cells were treated with the JAK2/STAT3 pathway inhibitor AG490 or the agonist Coumermycin A1. Thus， C8161 cells were divided into 5 groups： control group （without transfection or drug treatment）， negative control （NC） group （with mimics control transfection， but no drug treatment）， miR-126 group （with miR-126 mimics transfection， but no drug treatment）， miR-126 + pathway inhibitor group （with miR-126 mimics transfection and AG490 treatment）， miR-126 + pathway agonist group （with miR-126 mimics transfection and Coumermycin A1 treatment）. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was used to detect the expression level of miR-126. The expression levels of EMT key proteins and JAK2/STAT3 pathway proteins were determined by Western blotting. Cell viability， migration and invasion abilities were determined by cell counting kit-8 （CCK-8）， scratch healing assay and Transwell chamber combined with matrix gel， respectively. Compared with the NC group， transfection with miR-126 mimics significantly increased the expression level of miR-126 in the miR-126 group （#Plt;0.05）， while the relative cell vitality， cell migration rate and cell invasion number significantly decreased （#Plt;0.05）， accompanied with higher protein level of E-cadherin （#Plt;0.05）， and lower protein levels of Vimentin， N-cadherin， fibronectin （FN）， JAK2， STAT3， p-JAK2， and p-STAT3， and as well as lower ratios of p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 （#Plt;0.05）. More importantly， compared with NC group and miR-126 group， the "above indicators of JAK2 and STAT3 protein levels were further changed in miR-126 + pathway inhibitor group （#Plt;0.05 and amp;Plt;0.05）， whereas all the above indexes were less changed in miR-126 + pathway activator group （#Plt;0.05 and amp;Plt;0.05）， and cell invasion number and FN， JAK2 and STAT3 protein levels in miR-126 + pathway activator group were little different from NC group without significance. Overexpression of miR-126 inhibits cell viability， migration and invasion of human CM cells presumably by blocking EMT process and inhibiting the activation of JAK2/STAT3 pathway. These results were helpful to provide a new theoretical basis for the clinical treatment of human CM and a new strategy for its treatment.

Key words： cutaneous melanoma; microRNA-126-3p; Janus tyrosine protein kinase 2/signal transduction and transcription activator 3; migration; invasion

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（2）： 167-175）

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類由18～25個核苷酸構成的內源性非編碼單鏈RNA分子，其異常表達是一種表觀遺傳機制，可在各種生理、病理環境下調控細胞的增殖、分化、轉移和凋亡等生命過程，對腫瘤的發生、發展起關鍵作用［1-2］。皮膚黑色素瘤（cutaneous melanoma，CM）是一種侵襲性強、異質性高、轉移傾向強的惡性腫瘤，其病死率占皮膚癌死亡總數的75%以上，晚期CM患者的5年生存率為23%［3］。據報道，多種miRNA在CM的發生、發展過程中差異性表達［4］。miRNA-126-3p（miR-126）與許多腫瘤關系密切，在肺癌、乳腺癌、白血病中的作用及機理已被多方報道［5-7］。在CM中，miR-126在腫瘤組織中低表達，是一種潛在的腫瘤抑制因子，與不良預后相關［8］。但是，該miRNA對CM細胞惡性表型的作用尚未被全面揭秘。

Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3（Janus protein tyrosine kinase 2/signal transduction and transcription activator 3，JAK2/STAT3）信號通路在腫瘤發生中起著關鍵作用，并被認為是CM的致病因子和治療靶點［9-10］。已有研究顯示，miR-126可通過抑制該通路，從而拮抗宮頸癌細胞的遷移和侵襲［11］，但是，尚沒有證據表明miR-126和JAK2/STAT3通路在CM發生、發展中的角色。綜上，本研究旨在檢測miR-126高表達對人CM細胞的遷移、侵襲及上皮-間質轉化（epithelial-interstitial transformation，EMT）過程的影響，并探討JAK2/STAT3信號通路在miR-126作用中的角色。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞

C8161細胞株來自于北納生物（北京，中國）。

1.1.2 藥品和試劑

miR-126模擬物、模擬物對照及miR-126引物購自上海艾博思生物科技有限公司（上海，中國）；Lipofectamine 3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；JAK2/STAT3通路抑制劑AG490［12］、激動劑Coumermycin A1［13］購自圣克魯斯生物技術（上海）有限公司；結晶紫染色液、組織細胞固定液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）消化液（0.25%）、青鏈霉素混合液（100×）均由北京索萊寶科技有限公司提供；RPMI-1640基礎培養基、優質胎牛血清由美國Gibco公司提供；細胞/組織總RNA提取試劑盒和miRNA加尾法逆轉錄試劑盒均來自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；2×SYBR Green Fast qPCR Mix來自于北京百邁客生物科技有限公司；細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自吉滿生物科技（上海）有限公司；放射免疫沉淀分析（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（強）購自上海碧云天生物技術有限公司；上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、神經鈣黏蛋白（N-cadherin）、纖維連接蛋白（fibrillonectin，FN）、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、β-actin等抗體均來自圣克魯斯生物技術（上海）有限公司；堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG（H+G）和羊抗兔IgG（H+G）來源于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.1.3 儀器

Unano-2000超微量分光光度計購自杭州優米儀器有限公司；ABI7500實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）儀來自于美國Applied Biosystems公司；iD3酶標儀來自于美國Molecular Devices公司；DM2000光學顯微鏡來自于德國徠卡顯微系統；OI1000凝膠成像系統來自于廣州廣儀儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養、轉染

C8161生長所需的完全培養基由RPMI-1640基礎培養基、10%優質胎牛血清和1×青鏈霉素混合液組成，其生長所在培養箱的條件是37℃、5% CO2、70%～80%濕度。細胞傳代的前提條件是細胞密度≥90%；細胞轉染的前提條件是細胞密度達到60%～70%，30 nmol/L miRNA模擬物在Lipofectamine 3000轉染試劑的幫助下進入細胞，且嚴格按照說明書的操作步驟進行轉染。

1.2.2 細胞分組和藥物處理

miR-126模擬物轉染的細胞，在24 h后更換為添加了10 μmol/L AG490或10 μmol/L Coumermycin A1的完全培養基，繼續培養24 h。所有的C8161細胞可分為5組：對照組（不做轉染，不做藥物處理）、陰性對照（NC）組（轉染模擬物對照，不做藥物處理）、miR-126組（轉染miR-126模擬物，不做藥物處理）、miR-126+通路抑制劑組（轉染miR-126模擬物后AG490處理）、miR-126+通路激動劑組（轉染miR-126模擬物后Coumermycin A1處理）。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-126的表達水平

對照組、NC組和miR-126組在轉染24 h后，用RNA提取試劑盒提取細胞中的RNA，并用超微量分光光度計測量RNA濃度。1 μg RNA在逆轉錄試劑盒的作用下進行逆轉錄反應，得到cDNA產物；100 ng cDNA在qPCR Mix和上、下游引物的作用下進行熒光定量。二步PCR反應程序如下：94℃ 2 min；40個循環的94℃ 30 s和65℃ 30 s；72℃ 2 min。以miR-191-5p為內參［14］，根據循環數（Ct）和2–ΔΔCt法計算miR-126的相對表達水平。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力

C8161細胞傳代并接種到96孔板中，每孔接種5 000個細胞，且各組設置5個重復孔。各組細胞在藥物處理24 h后，分別加入體積分數為10%的CCK-8試劑，并37℃孵育1 h。使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度（A），間接反映細胞活力。

相對細胞活力/%=［（A其他各組-A空白組）/（A對照組-

A空白組）］×100% " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " （1）

1.2.5 劃痕愈合法檢測細胞遷移

各組細胞在藥物處理24 h后，用20 μL無菌吸頭在細胞表面力道均勻地垂直畫一道線，并用PBS清洗掉脫落的細胞；剩余的貼壁細胞在無血清的完全培養基中繼續培養24 h。顯微鏡下（4×）采集0 h和24 h的劃痕圖，并用Image J1.8.0軟件分析劃痕面積（S），間接反映細胞的遷移性。

遷移率/%=［（S0 h-S24 h）/S0 h］×100% " " " " " "（2）

1.2.6 Transwell小室聯合基質膠法檢測細胞侵襲

取-20℃保存的基質膠置于4℃過夜融化，用無血清的完全培養基稀釋基質膠的質量濃度至1 mg/mL，每Transwell小室加入100 μL基質膠稀釋液，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育5 h，使其呈干膠狀。各組細胞在藥物干預24 h后，重懸在無血清的完全培養基中，并將約1×105個細胞接種到提前包被基質膠的Transwell小室的腔室中，在Transwell小室和24孔板之間的腔室中加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養基。細胞在37℃中繼續培養24 h，小室下表面的細胞與4%組織細胞固定液室溫孵育15 min，再與1%結晶紫染色液室溫孵育20 min。在顯微鏡下（20×）采集細胞圖，并用Image J1.8.0軟件分析紫色細胞個數（N），直接反映細胞的侵襲數（個）。

1.2.7 蛋白免疫印跡（WB）法檢測EMT和JAK2/STAT3通路相關蛋白的表達水平

各組細胞在藥物處理24 h后，用RIPA裂解液提取細胞中的蛋白質，并用超微量分光光度計測量蛋白質的濃度。50 μg蛋白樣品在80～120 V恒壓條件下用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后在300 mA恒流條件下用電泳將蛋白轉移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。聚偏二氟乙烯膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，之后膜載蛋白在室溫下進行一抗孵育2 h、二抗孵育2 h。抗體結合后的膜載蛋白在5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/硝基藍四唑（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium，BCIP/NBT）堿性磷酸酯酶顯色試劑盒作用下進行膜顯色，并用凝膠成像系統進行圖片采集。ImageJ1.8.0軟件用來分析蛋白灰度（G），間接反應蛋白的表達水平。

蛋白表達水平=G目的蛋白/Gβ-actin " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（3）1.3 統計學分析

所有試驗數據均符合正態分析，以平均數±標準差（x±s）表示。兩組間數據比較采用Dunnett’s t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，均在GraphPad Prism 8軟件上進行。Plt;0.05表示具有統計學差異，在圖上以#或amp;表示。

2 結果與分析

2.1 miR-126在C8161細胞中過表達

利用細胞瞬時轉染法，人為干預C8161細胞中miR-126的表達。由圖1可知，miR-126組中miR-126的表達水平約為對照組的3倍，且顯著高于NC組（#Plt;0.05），表明miR-126模擬物在C8161細胞中轉染成功。

2.2 miR-126高表達依賴于對JAK2/STAT3通路

活性的抑制作用削弱C8161的細胞活力

為了同時探究miR-126和JAK2/STAT3通路活化在人黑色素瘤細胞中的作用，用通路抑制劑、激動劑處理miR-126過表達的C8161細胞，并分析關鍵的細胞過程的變化。用CCK-8試驗檢測細胞活力。由圖2a可知：相對于對照組，NC組的細胞活力未受顯著影響；相對于NC組，miR-126組、miR-126+通路抑制劑組和miR-126+通路激動劑組的細胞活力均顯著降低（#Plt;0.05）；與miR-126組相比，miR-126+通路抑制劑組的細胞活力顯著降低（amp;Plt;0.05），miR-126+通路激動劑組的細胞活力顯著提高（amp;Plt;0.05）。

2.3 上調miR-126的表達抑制JAK2/STAT3通路

活性，降低C8161的細胞遷移能力

用劃痕愈合試驗法檢測各組細胞的遷移能力。由圖2b和圖2c可知，miR-126組、miR-126+通路抑制劑組和miR-126+通路激動劑組中24 h內的細胞遷移率均低于NC組（#Plt;0.05），miR-126+通路抑制劑組低于miR-126組（amp;Plt;0.05），miR-126+通路激動劑組則高于miR-126組（amp;Plt;0.05）。

2.4 上調miR-126的表達抑制JAK2/STAT3通路活性，降低C8161的細胞侵襲能力

用Transwell小室聯合基質膠法檢測各組細胞的侵襲能力，結果如圖3所示，細胞侵襲數在對照組和NC組中無顯著差異，但miR-126組、miR-126+通路抑制劑組的細胞侵襲數低于NC組（#Plt;0.05），miR-126+通路抑制劑組低于miR-126組（amp;Plt;0.05），miR-126+通路激動劑組高于miR-126組（amp;Plt;0.05）。

2.5 通過抑制JAK2/STAT3通路活性，miR-126高表達阻礙C8161的細胞EMT進程

用蛋白免疫印跡（Western blotting，WB）試驗檢測EMT關鍵蛋白在各組細胞中的表達情況。由圖4a和4b可知：與NC組相比，miR-126組、miR-126+通路抑制劑組E-cadherin蛋白的表達水平均上調（#Plt;0.05），miR-126+通路激動劑組E-cadherin蛋白的表達水平下調（#Plt;0.05），而miR-126組、miR-126+通路抑制劑組vimentin、N-cadherin的表達水平則均下調（#Plt;0.05），miR-126+通路激動劑組vimentin、N-cadherin的表達水平上調（#Plt;0.05）；miR-126組和miR-126+通路抑制劑組FN蛋白的表達水平顯著低于NC組（#Plt;0.05），miR-126+通路激動劑組和NC組FN蛋白表達水平無顯著變化。與miR-126組相比，miR-126+通路抑制劑組E-cadherin蛋白的表達水平上調（amp;Plt;0.05），miR-126+通路激動劑組E-cadherin蛋白的表達水平下調（amp;Plt;0.05），而vimentin、N-cadherin和FN蛋白的表達水平在miR-126+通路抑制劑組中下調（amp;Plt;0.05），在miR-126+通路激動劑組中上調（amp;Plt;0.05）。E-cadherin、vimentin、N-cadherin和FN蛋白的表達水平在對照組和NC組中無顯著差異。

2.6 過表達miR-126依賴于對JAK2/STAT3通路的抑制而下調通路蛋白的表達

JAK2/STAT3通路關鍵蛋白的表達也由WB試驗測定。由圖5a～5c可知：miR-126組、miR-126+通路抑制劑組的JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對于內參β-actin的表達水平和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均低于NC組（#Plt;0.05），而miR-126+通路激動劑組的p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達水平和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均高于NC組（#Plt;0.05）；與miR-126組相比，miR-126+通路抑制劑組的p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達水平和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值較低（amp;Plt;0.05），而miR-126+通路激動劑組的STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達水平和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值較高（amp;Plt;0.05）。

3 討論

miRNA主要是通過與靶基因mRNA 3'端非編碼區進行堿基配對，引起靶標mRNA降解或翻譯抑制，從而參與真核生物的生理、病理過程的。miR-126定位于第9號染色體，屬于保守型miRNA，與血管新生以及癌細胞的增殖、分化、轉移關系密切。Caporali等［15］與Lu等［16］的研究顯示，金屬肽酶結構域9（a distegrinin and a metalloprotease 9，ADAM9）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、CRK原癌基因均屬于miR-126負調控CM細胞惡性行為的靶基因。關于其靶基因與CM細胞遷移和侵襲的關系，均已有諸多報道。Pedini等［17］認為，恢復miR-126的表達可以減弱CM細胞的致瘤性，聯合用藥時也可增強藥物PIK-75和維莫非尼的抗腫瘤活性。本研究發現，相比對照組，miR-126組細胞的活力、遷移能力、侵襲能力以及vimentin、N-cadherin蛋白的表達水平下降，E-cadherin蛋白的表達水平升高，說明miR-126能夠抑制細胞的活力、遷移、侵襲及EMT過程。本文闡述的miR-126對CM C8161細胞株的增殖、侵襲、EMT的抑制作用與Lu等［16］在CM A375-S2細胞株中的結果一致。

Pedini等［17］報道，在CM中miR-126異常表達，但其具體作用機制并不完全明確，仍需要更加深入的研究。而有研究顯示，miR-126、PIK-75和維莫非尼均可抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase/protein kinase B，PI3K/AKT）和促分裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶（divisionogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulating kinase，MAPK/ERK）信號通路［17］。JAK2/STAT3信號通路與CM惡性生物性進程關系密切，生理狀態下，JAK2/STAT3大多處于非磷酸化水平，當機體受外界刺激時發生瞬時、快速的磷酸化轉化，繼而通過一系列進程，將膜外信號快速轉導至胞內，進而調控下游關鍵因子的表達［18］。本研究結果顯示，與miR-126組相比，miR-126+通路抑制劑組細胞的活力、遷移能力、侵襲能力以及vimentin、N-cadherin蛋白的表達水平進一步下降，E-cadherin蛋白的表達水平進一步升高。與AG490同時使用，對上述細胞行為可產生累加效應。過表達miR-126和AG490均對JAK2/STAT3通路有抑制作用。且研究結果還顯示，miR-126+通路激動劑組與miR-126+通路抑制劑組的趨勢相反，說明miR-126能夠通過JAK2/STAT3信號通路發揮對CM的調控作用。EMT是一種進化上保守的發育過程，與癌變有關，并可通過增強癌細胞的移動性、侵襲性和對凋亡刺激的抵抗力來賦予癌細胞轉移能力［19］，而癌癥細胞的轉移和耐藥性在侵襲生態位上相互合作和加強［20］。Caporali等［15］指出，miR-126在達拉非尼耐藥CM細胞（A375R和SK-Mel28R）中顯著低于母系細胞（A375和SK-Mel28），而miR-126-3p的替代性表達可抑制A375R和SK-Mel28R的增殖、細胞周期進程、侵襲性，并增加對達拉非尼的敏感性，且該作用至少可通過抑制MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路來實現。這些發現表明，JAK2/STAT3通路很可能是miR-126通過調控信號通路在CM中發揮腫瘤抑制活性的一種重要的分子機制。

近幾年來，miRNA在抗腫瘤治療中具有治療潛力，miRNA療法（恢復或抑制miRNA的表達和活性）具有很大的應用前景。但是，這些治療性miRNA本身具有生理缺點，如穩定性低、內吞作用低、免疫毒性低等，這些缺陷阻礙了其向癌癥治療的轉化［21］；隨著納米技術給藥系統的出現，miRNA或可更有效地靶向癌癥，從而改善療效，其中，基于miRNA的納米治療潛能已在葡萄膜黑色素瘤中受到極大的關注［22］，但是在CM中尚未可知。miR-126在臨床中也有與癌癥相關的報道，但在CM中還缺乏系統性的研究，尚需進一步探索。

綜上所述，本試驗發現，恢復miR-126的表達可顯著抑制CM細胞的體外遷移和侵襲能力，而這一作用很可能與EMT進程減緩、JAK2/STAT3信號通路抑制緊密相關。miRNA調控JAK2/STAT3信號通路在CM中的研究很少，本研究成果可以填補這一方面的空白。

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