腫瘤細(xì)胞胞外囊泡DNA特征分析

摘 要：從肺腺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離胞外囊泡（EVs），通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和透射電鏡（TEM）分析得到EVs的大小約為100 nm，并在樣品中檢測到EVs的特異性標(biāo)記TSG101。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，胞外囊泡DNA（evDNA）分子片段的大小在12 kb左右。根據(jù)evDNA測序數(shù)據(jù)選擇特定evDNA開展PCR試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)其有效檢測。對EVs進(jìn)行脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase I）或ATP依賴的DNA酶（PS酶）處理，證實(shí)evDNA以線性方式存在于囊泡外側(cè)。通過末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）向evDNA末端添加poly-dA，使用oligo-dT珠對其進(jìn)行捕獲，進(jìn)一步證明其線性表面分布。此外，建立TetO-DNA/TetR-GFP可視化系統(tǒng)，在熒光顯微鏡下觀察到TetR-GFP蛋白與EVs上TetO-DNA的結(jié)合。流式細(xì)胞術(shù)和PCR試驗(yàn)證實(shí)，可用TetR-GFP蛋白實(shí)現(xiàn)對攜帶TetO-DNA EVs的富集。本研究證實(shí)了evDNA以線性的形式分布在EVs表面，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：肺腺癌細(xì)胞；胞外囊泡；evDNA；Tet操縱基因-DNA；Tet阻遏蛋白-綠色熒光蛋白

中圖分類號：Q71 " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.02.007

Analysis of the Characteristics of Extracellular Vesicle DNA of Tumor Cells

CHEN Siyu1， "ZHANG Yunsheng2， PEI Chaozhu2， TAN Yongjun2*

（1. College of Life Science and Technology， Central South University of Forestry and Technology， Changsha 410000， China;

2. College of Biology， Hunan University， Changsha 410000， China）

Abstract： Extracellular vesicles （EVs） were isolated from the culture supernatant of lung adenocarcinoma A549 cells. The size of EVs was characterized as approximately 100 nm via DLS and TEM analysis， with the EV-specific marker TSG101 detected in the samples. The extracted EV DNA （evDNA） showed a predominantly～12 kb size distribution as assessed by agarose gel electrophoresis. Based on sequencing data， specific evDNA was selected for PCR detection. DNase I or PS nuclease treatment of the EVs confirmed that the evDNA existed on the outside of the vesicle in a linear manner， and poly-dA tails were added to evDNA by TdT enzyme treatment， allowing for their capture by oligo-dT beads and presenting further evidence of their linear surface distribution. Additionally， a TetO-DNA/TetR-GFP visualization system was established to confirm the presence of TetO-DNA in the EVs， which could be visualized by TetR-GFP proteins under fluorescent microscopy. Enrichment of EVs carrying the TetO-DNA was confirmed via flow cytometry and PCR experiments using TetR-GFP protein. These findings collectively suggest that evDNA is distributed linearly on the surface of EVs， providing a basis for further research into their biological functions.

Key words： lung adenocarcinoma cells; extracellular vesicles; evDNA; TetO-DNA; TetR-GFP

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（2）： 151-159）

胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細(xì)胞產(chǎn)生的異質(zhì)性的胞膜衍生結(jié)構(gòu)，廣泛存在于多細(xì)胞生命體體液中，充當(dāng)細(xì)胞間胞內(nèi)組分交換的載體，參與調(diào)控生命體的生理和病理過程［1］。根據(jù)其形成方式和尺寸大小，EVs可以分為微囊泡（microvesicle）和外泌體（exosome）［2］。其中，微囊泡（直徑為50～1 000 nm）由質(zhì)膜向細(xì)胞外空間出芽和分裂形成；外泌體（直徑為30～100 nm）由胞漿中多泡小體（multivesicle bodies，MVBs）與細(xì)胞膜融合后，多泡小體的腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）被釋放到細(xì)胞外所形成，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生EVs的主要方式，也是EVs研究的主要類型。

EVs所攜帶的物質(zhì)組分包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等［3］，可以發(fā)揮細(xì)胞間通信的重要作用［4］。目前，針對EVs被受體細(xì)胞吸收后發(fā)揮生物學(xué)功能的研究基本集中在其攜帶的RNA或蛋白質(zhì)組分上［5-6］。胞外囊泡DNA（extracellular vesicle DNA，evDNA）是EVs的重要組分之一。目前關(guān)于evDNA的研究主要集中在其作為潛在的疾病檢測標(biāo)志物應(yīng)用上，通常是從患者體液中收集EVs樣本，對其攜帶的DNA進(jìn)行測序分析，以實(shí)現(xiàn)對疾病進(jìn)程的診斷和監(jiān)測。例如，針對惡性腫瘤診斷，來源于胰腺癌患者體液的evDNA攜帶有KRAS基因高頻突變特征，可作為胰腺癌早期診斷的指標(biāo)［7］。

根據(jù)evDNA來源的不同，可將其分為ssDNA、dsDNA、mtDNA和病毒DNA［8］；根據(jù)EVs的類型不同，可將其分為微囊泡DNA和外泌體DNA。研究發(fā)現(xiàn)，evDNA存在于EVs的表面和內(nèi)腔中［9-11］，且不同類型的EVs中DNA的含量也不同，提示DNA裝載到EVs中具有選擇性［12］。DNA裝載到EVs中的機(jī)制包括死細(xì)胞的被動(dòng)分泌和活細(xì)胞的主動(dòng)釋放兩種方式。但目前對活細(xì)胞主動(dòng)分泌的原因知之甚少，對這一過程的生物學(xué)意義也不清楚，針對evDNA生物學(xué)功能開展的研究缺乏。

因此，本研究從肺腺癌腫瘤A549細(xì)胞培養(yǎng)液中提取EVs，分析evDNA測序結(jié)果，選擇特定的序列設(shè)計(jì)引物，試圖通過試驗(yàn)驗(yàn)證evDNA在腫瘤細(xì)胞EVs上存在的位置及存在形式，并建立構(gòu)建 TetR-GFP/TetO-DNA 可視化體系，以進(jìn)一步確定evDNA在EVs中的位置。

1 材料與方法

1.1 主要材料

杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）購于GIBCO公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于迪睿生物科技有限公司，基因組提取試劑盒購于北京擎科生物有限公司，肺腺癌A549細(xì)胞購自美國細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心（American type culture collection，ATCC），A549-TetO-evDNA細(xì)胞系來自湖南大學(xué)生物學(xué)院。引物［evDNA1（F：CCACTTTGATGGGTCTCGCT，R：TGTCTGGTGACCGTTGGTTC）；evDNA2（F：GATGGTGTGTGGCTGTAACAT，R：CTGTGGCCGTGTAAGGCTAT）；evDNA3（F：GGGATATGTGAAAACGCCCC，R：CTGCCTACAGGGAATTTCGA）；evDNA4（F：GTTTTCACAGCCACTGCAGG，R：ACTCCCGTCAGAGCAACATG）］訂購于北京擎科生物有限公司。TdT酶、DNase I、PS核酸酶、TSG101一抗購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞EVs的獲取及表征

大量培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，改用無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞上清進(jìn)行差速梯度離心，獲取腫瘤細(xì)胞分泌的EVs。動(dòng)態(tài)光色散（dynamic light scattering，DLS）儀測量EVs流體動(dòng)力學(xué)直徑及其分布。取10 μL乙酸鈾染色的EVs懸浮液滴吸附在碳涂層的300目銅網(wǎng)上5 min，然后用濾紙除去殘留的液體，干燥，再進(jìn)行透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察。取不同離心速度獲得的EVs，檢測EVs的標(biāo)記蛋白TSG101。

1.2.2 檢測腫瘤細(xì)胞EVs中DNA的存在

利用細(xì)胞基因組提取試劑盒獲取evDNA，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析DNA是否存在及其大小等情況。

1.2.3 確定腫瘤細(xì)胞evDNA的定位

在檢測之前，我們對evDNA進(jìn)行了測序，分析可能存在的DNA，并分別命名為evDNA1、evDNA2、evDNA3、evDNA4，根據(jù)其序列信息分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR，檢測其是否存在。利用DNase I處理EVs后再進(jìn)行檢測，進(jìn)而判定其DNA的定位。同時(shí)，利用PS核酸酶判斷evDNA是環(huán)狀DNA還是線性DNA。

1.2.4 evDNA陽性囊泡的富集及檢測

為了富集DNA陽性囊泡，利用TdT酶在DNA末端增加一段PloyA尾，再利用識別PloyA尾的珠子進(jìn)行富集，得到DNA陽性囊泡后提取DNA，再進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.2.5 TetR/O體系的構(gòu)建及TetR-GFP蛋白富集特定EVs

為了在細(xì)胞水平上檢測evDNA的存在，利用TetR/O體系進(jìn)行檢測。首先，構(gòu)建pET-15b-TetR-GFP原核表達(dá)載體和pLVX-IRES-TetR-GFP真核表達(dá)載體，并純化TetR-GFP蛋白；在體外、體內(nèi)驗(yàn)證TetR-GFP與TetO repeat DNA的特異性結(jié)合，驗(yàn)證體系的可靠性。接著，構(gòu)建A549-TetO-evDNA細(xì)胞系，通過TetR-GFP蛋白對TetO特定DNA片段的陽性EVs進(jìn)行富集，并設(shè)計(jì)兩對引物對evDNA進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 腫瘤細(xì)胞EVs的表征及DNA的檢測

為了確認(rèn)EVs是否攜帶DNA并分析evDNA的位置和結(jié)構(gòu)特征，首先需要獲取EVs。饑餓處理肺腺癌A549細(xì)胞后收集培養(yǎng)基上清，通過超速離心收集腫瘤細(xì)胞分泌的EVs。通過DLS分析EVs的粒徑分布，結(jié)果如圖1a所示，樣品粒徑大小主要分布在100.0 nm左右。然后，用TEM觀察EVs的形態(tài)及大小，結(jié)果顯示，所獲得樣品為大小在100.0 nm左右的球狀囊泡（圖1b）。最后，通過蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)狀況，使用Anti-TSG101抗體與膜一起孵育，確定TSG101蛋白是否存在于樣品中。如圖1c所示，當(dāng)離心力為100 000 g時(shí)，離心得到的EVs中可以明顯檢測到TSG101蛋白，表明收集到的產(chǎn)物是EVs。

超速離心獲取到EVs后，為了驗(yàn)證其中含有DNA，提取EVs的基因組，并通過瓊脂糖凝膠電泳確定其大小。結(jié)果如圖2a所示，表明提取的EVs中含有DNA，大小主要分布在12 kb左右。統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞分泌出的evDNA含量，結(jié)果如圖2b所示，每107個(gè)細(xì)胞分泌出的evDNA約有24～30 ng。

除了前面提到的A549細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)室還提取了宮頸癌細(xì)胞Hela和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的evDNA，測其濃度及尺寸，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤細(xì)胞來源的evDNA不具有明顯的差異性。

2.2 特定evDNA的檢測及evDNA的定位和結(jié)構(gòu)分析

從腫瘤細(xì)胞EVs的測序數(shù)據(jù)中選擇4條DNA進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用于檢測evDNA是否存在。DNase I是一種非特異性核酸內(nèi)切酶，其能消化單鏈或雙鏈DNA，消化模式如圖3a所示。為了驗(yàn)證evDNA在囊泡內(nèi)還是囊泡外，使用DNase I處理EVs，提取DNA后使用4對引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測，分析DNase I對evDNA片段的影響，結(jié)果如圖3b所示，表明evDNA存在于EVs的膜外側(cè)。

ATP依賴的DNA酶（PS核酸酶）在弱堿性pH值條件下能將線性雙鏈DNA消化成脫氧核苷酸，消化模式如圖4a所示。為了驗(yàn)證evDNA是直鏈DNA還是環(huán)狀DNA，用PS核酸酶處理EVs后提取DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測。結(jié)果如圖4b所示，PS核酸酶處理后的evDNA含量明顯下降，說明evDNA能被PS核酸酶降解，evDNA的結(jié)構(gòu)是線性的。

有研究發(fā)現(xiàn)，TdT末端轉(zhuǎn)移酶能促進(jìn)evDNA從3'-OH端開始延伸，從而實(shí)現(xiàn)對EVs的富集（圖5a）［13］。因此，為了捕獲暴露在外邊的evDNA，本文利用TdT酶在evDNA的末端添加了一個(gè)PloyA尾巴，利用Oligo dT標(biāo)記的珠子對其進(jìn)行捕獲，再提取DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測（圖5b）。結(jié)果表明，通過這個(gè)方法可以成功捕獲evDNA，也進(jìn)一步證明了evDNA在囊泡外側(cè)。

2.3 TetO-DNA/TetR-GFP體系的構(gòu)建及驗(yàn)證

通過構(gòu)建TetO-DNA/TetR-GFP體系可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞水平上檢測到囊泡中DNA的存在。首先，構(gòu)建pET-15b-TetR-GFP原核表達(dá)載體，質(zhì)粒圖譜如圖6a所示。菌落PCR鑒定結(jié)果表明，載體構(gòu)建成功（圖6b）。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，通過His-tag純化出TetR-GFP原核蛋白，結(jié)果如圖6c所示。

然后，為了證實(shí)TetR-GFP蛋白與TetO-DNA的結(jié)合，先利用Dot blot來體外驗(yàn)證，熒光成像結(jié)果如圖7a所示，表明TetR-GFP蛋白有效結(jié)合在TetO-DNA上。利用磁珠捕獲DNA及其結(jié)合蛋白后進(jìn)行針對GFP蛋白的Western blotting試驗(yàn)，結(jié)果如圖7b所示，再次表明TetO-DNA可被TetR-GFP蛋白結(jié)合。

最后，為了在細(xì)胞層面也驗(yàn)證TetR-GFP蛋白與TetO-DNA的有效結(jié)合，我們構(gòu)建了一個(gè)pLVX-IRES-TetR-GFP真核表達(dá)載體，質(zhì)粒圖譜如圖8a所示。菌落PCR鑒定（圖8b）和測序結(jié)果（圖8c）表明載體構(gòu)建成功。pLVX-IRES-TetR-GFP真核表達(dá)載體與TetO repeat DNA共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，結(jié)果如圖7c所示，表明TetR-GFP熒光蛋白能夠在體內(nèi)與TetO repeat DNA結(jié)合，說明成功構(gòu)建了TetR-GFP/TetO-DNA這套體系，可用于可視化evDNA。

2.4 TetR-GFP蛋白富集TetO陽性EVs的驗(yàn)證

為了實(shí)現(xiàn)直接可視化evDNA，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了A549-TetO-evDNA細(xì)胞系。先收集細(xì)胞系A(chǔ)549-TetO-evDNA的EVs與TetR-GFP蛋白進(jìn)行孵育，在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)EVs出現(xiàn)綠色熒光（圖9a），表明TetR-GFP/TetO-DNA體系成功點(diǎn)亮了evDNA。接著，使用TetR-GFP蛋白孵育含有TetO repeat DNA的EVs，通過流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，TetO repeat DNA陽性的EVs約為總量的12.8%（圖9b）。這同時(shí)證明了該特定evDNA在囊泡的外側(cè)。

Yokoi等［14］已經(jīng)證實(shí)了特定染色質(zhì)裝載入EVs的機(jī)制，且在特定染色質(zhì)產(chǎn)生的染色體位置上插入了TetO repeat序列，構(gòu)建了細(xì)胞系A(chǔ)549-TetO-evDNA。為了驗(yàn)證通過TetR-GFP蛋白富集到的TetO陽性EVs中特定片段DNA的存在，本文根據(jù)TetO DNA序列設(shè)計(jì)兩對引物，提取細(xì)胞系A(chǔ)549-TetO-evDNA的EVs，純化出DNA后與TetR-GFP蛋白孵育，使用兩對引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖10a所示，說明TetR-GFP蛋白能捕獲EVs中特定DNA片段。用TetR-GFP蛋白孵育EVs后，提取DNA后進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖10b所示。從結(jié)果可以看出，囊泡能被TetR-GFP蛋白捕獲，且在外側(cè)與TetO陽性EVs中特定片段DNA相結(jié)合，進(jìn)一步表明了富集成功。

3 討論

evDNA片段的大小從100 bp到20 kb不等，然而，我們對外泌體DNA的產(chǎn)生機(jī)制知之甚少。其中，可能的機(jī)制之一是胞質(zhì)DNA參與這些囊泡的產(chǎn)生而被轉(zhuǎn)載進(jìn)去。錯(cuò)誤修復(fù)或未修復(fù)的DNA斷裂引起的染色體碎片和染色體異常分離等原因造成的具有細(xì)胞核膜包裹的微核（micronuclei，MN）可能是外泌體DNA來源的另一種機(jī)制［15-17］。微核在胞質(zhì)中塌陷釋放DNA，隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到MVBs中，并最終裝載到外泌體中；微核中的DNA還能夠被類似凋亡樣機(jī)制降解或者直接排出細(xì)胞，最終裝載到EVs中［18］。與此同時(shí)，還有的研究認(rèn)為，DNA以及它結(jié)合的組蛋白等是由自噬內(nèi)涵體（amphisomes）介導(dǎo)分泌的。其中，自噬內(nèi)涵體是自噬小體與晚期內(nèi)體（late endosomes）融合后形成的［3］。

目前，大多數(shù)研究只關(guān)注EVs的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA組分。因此，我們收集腫瘤細(xì)胞分泌的EVs，確認(rèn)并提取evDNA，后續(xù)加以試驗(yàn)驗(yàn)證evDNA以線性的方式存在于囊泡外表面上，并且可以通過evDNA富集攜帶DNA的陽性囊泡。在許多病理狀態(tài)中，evDNA都展現(xiàn)出功能潛力，包括惡性腫瘤和自身免疫性疾病。肺癌患者血漿來源的evDNA攜帶的EGFR-T790M突變對于非小細(xì)胞肺癌診斷具有臨床價(jià)值［19］；又如針對產(chǎn)前診斷，孕婦血漿來源的evDNA已顯示出重要的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷價(jià)值［20］。因此，游離DNA在液體活檢應(yīng)用中的有效性說明了evDNA作為新型疾病生物標(biāo)志物可能發(fā)揮了作用。雖然DNA與幾乎所有的EVs類型相關(guān)，但是對EVs所攜帶的DNA（evDNA）的功能和臨床價(jià)值研究較少，仍有待進(jìn)一步闡明。

目前，我們對EVs膜結(jié)構(gòu)的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，這些囊泡被釋放到細(xì)胞外環(huán)境（如血漿或細(xì)胞培養(yǎng)基）中不會(huì)立刻被周圍細(xì)胞所吞噬，因此，通過這些囊泡可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程信號交流。研究并理解這些EVs結(jié)構(gòu)，可挑戰(zhàn)當(dāng)前對于細(xì)胞間信號溝通的傳統(tǒng)觀念，也會(huì)為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如診斷和治療方面，開創(chuàng)新的契機(jī)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ VAN NIEL G， D’ANGELO G， RAPOSO G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2018， 19（4）： 213-228.

［2］ THERY C， WITWER K W， AIKAWA E， et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 （MISEV2018）： a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines［J］. Journal of Extracellular Vesicles， 2018， 7（1）： 1535750.

［3］ JEPPESEN D K， FENIX A M， FRANKLIN J L， et al. Reassessment of exosome composition［J］. Cell， 2019， 177（2）： 428-445.e18.

［4］ TENG F， FUSSENEGGER M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering［J］. Advanced Science， 2020， 8（1）： 2003505.

［5］ O’BRIEN K， BREYNE K， UGHETTO S， et al. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2020， 21（10）： 585-606.

［6］ YANG Y， HONG Y， CHO E， et al. Extracellular vesicles as a platform for membrane-associated therapeutic protein delivery［J］. Journal of Extracellular Vesicles， 2018， 7（1）： 1440131.

［7］ ALLENSON K， CASTILLO J， SAN LUCAS F A， et al. High prevalence of mutant KRAS in circulating exosome-derived DNA from early-stage pancreatic cancer patients［J］. Annals of Oncology， 2017， 28（4）： 741-747.

［8］ ELZANOWSKA J， SEMIRA C， COSTA-SILVA B. DNA in extracellular vesicles： biological and clinical aspects［J］. Molecular Oncology， 2020，15（6）： 1701-1714.

［9］ THAKUR B K， ZHANG H， BECKER A， et al. Double-stranded DNA in exosomes： a novel biomarker in cancer detection［J］. Cell Research， 2014， 24（6）： 766-769.

［10］ NEMETH A， ORGOVAN N， SODAR B W， et al. Antibiotic-induced release of small extracellular vesicles （exosomes） with surface-associated DNA［J］. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 8202.

［11］ VAGNER T， SPINELLI C， MINCIACCHI V R， et al. Large extracellular vesicles carry most of the tumour DNA circulating in prostate cancer patient plasma［J］. Journal of Extracellular Vesicles， 2018， 7（1）： 1505403.

［12］ LáZARO-IBá?EZ E， SANZ-GARCIA A， VISAKORPI T， et al. Different gDNA content in the subpopulations of prostate cancer extracellular vesicles： apoptotic bodies， microvesicles， and exosomes［J］. Prostate， 2014， 74（14）： 1379-1390.

［13］ KISURINA-EVGENIEVA O P， SUTIAGINA O I， ONISHCHENKO G E. Biogenesis of micronuclei［J］. Biochemistry （Mosc）， 2016， 81（5）： 453-464.

［14］ YOKOI A， VILLAR-PRADOS A， OLIPHINT P A， et al. Mechanisms of nuclear content loading to exosomes［J］. Science Advances， 2019， 5（11）： eaax8849.

［15］ FENECH M， KIRSCH-VOLDERS M， NATARAJAN A T， et al. Molecular mechanisms of micronucleus， nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells［J］. Mutagenesis， 2011， 26（1）： 125-132.

［16］ TERRADAS M， MARTíN M， TUSELL L， et al. Genetic activities in micronuclei： is the DNA entrapped in micronuclei lost for the cell？［J］. Mutation Research， 2010， 705（1）： 60-67.

［17］ CASTELLANOS-RIZALDOS E， GRIMM D G， TADIGOTLA V， et al. Exosome-based detection of EGFR T790M in plasma from non-small cell lung cancer patients［J］. Clinical Cancer Research， 2018， 24（12）： 2944-2950.

［18］ LIAO G J， GRONOWSKI A M， ZHAO Z. Non-invasive prenatal testing using cell-free fetal DNA in maternal circulation［J］. Clinica Chimica Acta， 2014， 428： 44-50.