基于高尿酸誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞模型探討ZAG與 ERK1/2和p38信號通路的交互作用

摘 要：為探索高尿酸環(huán)境誘導(dǎo)下的大鼠腎細(xì)胞（NRK-52E）中鋅α2糖蛋白（ZAG）與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和p38形成反饋通路調(diào)控腎細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的機(jī)制，將NRK-52E分為正常培養(yǎng)組（N組）和高尿酸培養(yǎng)組（H組）（20 mg/dL的尿酸刺激48 h），每組中的細(xì)胞都分別進(jìn)行ZAG的過表達(dá)轉(zhuǎn)染和敲低，觀察細(xì)胞中ZAG的表達(dá)水平與ERK1/2和p38信號通路的交互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相較于N組，高尿酸環(huán)境下的NRK-52E中EMT相關(guān)分子的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)均上調(diào)（Plt;0.05）；在高尿酸環(huán)境培養(yǎng)下，上調(diào)ZAG會減少NRK-52E在該通路中絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）、ERK1/2、p38、活化轉(zhuǎn)錄因子2（ATF2）及蛋白激酶B（PKB或Akt）mRNA的表達(dá)量（Plt;0.01），而ZAG的下調(diào)則會增加（Plt;0.05）。在蛋白層面上，相較于未轉(zhuǎn)染組，ZAG上調(diào)組的MAPKK、p38和Akt的表達(dá)量減少（Plt;0.05、Plt;0.01、Plt;0.001）；ZAG下調(diào)組的ERK1/2、p38和Akt的表達(dá)量增加（Plt;0.001、Plt;0.05、Plt;0.01）。結(jié)果表明：ZAG的轉(zhuǎn)染上調(diào)會減少NRK-52E中與EMT相關(guān)的標(biāo)志物波形蛋白（vimentin）和層黏連蛋白（laminin）mRNA的表達(dá)量；調(diào)控ZAG在NRK-52E中的表達(dá)量可以在ERK1/2和p38信號通路中起到積極作用，進(jìn)而抑制腎細(xì)胞EMT。該研究為臨床治療高尿酸血癥腎?。℉N）提供了試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：腎纖維化；上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；尿酸性腎病；高尿酸；鋅α2糖蛋白

中圖分類號：R361 " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.02.010

Investigation of the Interaction of ZAG with ERK1/2 and p38 Signaling Pathways Based on the NRK-52E Cell Model Induced by High Uric Acid

CHEN Bingyuan， YANG Jie， FAN Kaixuan， CHEN Bingpu*

（School of Basic Medical Sciences， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， China）

Abstract： The aim of this paper is to explore the mechanism of zinc-α2-glycoprotein （ZAG） forming a feedback pathway with extracellular signal- regulated kinase 1/2 （ERK1/2） and p38 to regulate epithelial mesenchymal transition （EMT） in rat renal epithelial cells （NRK-52E） induced by high uric acid environment， we divided NRK-52E into normal control group and high uric acid-induced group which was stimulated by 20 mg/dL uric acid for 48 h， and the cells in each group were transfected with overexpression of ZAG and knocked down respectively， to observe the interactions between ZAG expression level and ERK1/2 and p38 signaling pathways in the cells. The results revealed that the mRNA and protein expression of EMT-related molecules were elevated in rat kidney cells under high uric acid environment compared with the normal culture group （Plt;0.05）; up-regulation of ZAG decreased the expression of mitogen-activated protein kinase kinase （MAPKK）， ERK1/2， p38， activated transcription factor-2 （ATF2） and protein kinase B （PKB or Akt） mRNA in this pathway in rat kidney epithelial cells under high uric acid environment culture （Plt;0.01）， while the downregulation of ZAG increased （Plt;0.05）. At the protein level， the expression of MAPKK， p38 and Akt decreased in the ZAG up-regulated group compared to the untransfected group （Plt;0.05， Plt;0.01， Plt;0.001）; and the expression of ERK1/2， p38 and Akt was elevated in the ZAG down-regulated group （Plt;0.001， Plt;0.05， Plt;0.01）. The results suggest that transfection up-regulation of ZAG decreases the expression of laminin and vimentin mRNA， the marker genes related to EMT in NRK-52E; regulation of ZAG expression in NRK-52E can play a positive role in ERK1/2 and p38 signaling pathways， and thus inhibit renal cell EMT. This study provides an experimental basis for clinical treatment of hyperuricemic nephropathy （HN）.

Key words： nephrofibrotic： epithelial mesenchymal transformation of urine; uric acid nephropathy; hyperuricemia; zinc-α2-glycoprotein

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（2）： 176-184）

高尿酸血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。有研究表明，尿酸在慢性腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［1］。尿酸在腎臟的累積會造成腎實(shí)質(zhì)的損害，最終導(dǎo)致腎上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）。波形蛋白（vimentin）和層黏連蛋白（laminin）是EMT的重要標(biāo)志物［2］。腎臟是高尿酸血癥最易損害的靶器官之一，高尿酸血癥腎病（hyperuricemic nephropathy，HN）已成為嚴(yán)重危害人類健康的常見病，且高尿酸血癥發(fā)病有越來越年輕化的趨勢。Rodenbach等［3］的研究表明，高尿酸血癥是5年內(nèi)600多個(gè)兒童和青少年隊(duì)列中慢性腎臟疾病飛速進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，有學(xué)者認(rèn)為，小兒和青少年高尿酸血癥患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加［4］。高尿酸血癥是腎病最重要的生化基礎(chǔ)和最直接病因，高尿酸血癥晚期的特征性病理變化為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，但病理生理的調(diào)控機(jī)制還不太清楚。近年的研究發(fā)現(xiàn)，鋅α2糖蛋白（zinc-α2-glycoprotein，ZAG）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal- regulated kinase 1/2，ERK1/2）和p38在高尿酸血癥性腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，調(diào)控這些因子可能是治療HN的發(fā)展方向［5-7］。

NRK-52E是一種表現(xiàn)出上皮形態(tài)的細(xì)胞系，從大鼠腎臟中分離出來，并廣泛用于研究大鼠腎細(xì)胞增殖活化以及轉(zhuǎn)染模型等相關(guān)試驗(yàn)［8-9］。本試驗(yàn)通過探討高尿酸環(huán)境干預(yù)下的NRK-52E中ZAG蛋白的表達(dá)變化與EMT的進(jìn)展情況，并以ERK1/2和p38信號通路及其交互作用為闡明作用機(jī)制的切入點(diǎn)，為臨床治療HN提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

NRK-52E（大鼠腎細(xì)胞，批號：1DBBU6SK8D）由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。尿酸（C5H4N4O3，批號：C13859983）由上海麥克林生化科技有限公司提供；南美胎牛血清（批號：12B052）由中國依科賽生物科技有限公司提供；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（批號：8122609）由賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司提供；最低必須培養(yǎng)基（minimal essential medium，MEM）減血清型（批號：2427634）由美國賽默飛公司提供；ZAG過表達(dá)質(zhì)粒r-Azgp1（項(xiàng)目編號：HH20221115AXWFZ-PC01）由漢恒生物科技有限公司提供；ZAG敲低rno-Azgp1-siRNA（項(xiàng)目編號：HH20221114AXWFZ-SI01）由漢恒生物科技有限公司提供；Lipofectamine3000 Transfection Kit轉(zhuǎn)染試劑（批號：CN2463613）由美國賽默飛公司提供；核酸提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，批號：AM31529A）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time批號：AM82910A）、qPCR試劑盒（TB Green? Premix Ex Taq? II Tli RNaseH Plus，批號：AM21138A）由日本塔克拉公司提供；ZAG、vimentin、laminin、絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK）、ERK1/2、p38、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB或Akt）、活化轉(zhuǎn)錄因子2（activated transcription factor-2，ATF2）、GAPDH引物由武漢金開瑞生物工程有限公司提供；兔抗鼠ZAG、vimentin、laminin、MAPKK、ERK1/2、p38、Akt、ATF2、GAPDH抗體、羊抗兔熒光二抗由武漢愛博泰克生物科技有限公司提供。試驗(yàn)儀器包括：CO2培養(yǎng)箱（FORMA STERI-CYCLE i160）、超凈工作臺（Thermo Fish 1300 SERIES A2）、光學(xué)顯微鏡（Leica Microsystems CMS GmbH）、倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX73+DP80）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche LightCycler 96）、多功能酶標(biāo)儀（TriStar LB 941）、免疫印跡顯影儀（Tanon-5200 multi）、低溫離心機(jī)（DWB D2024R）。

1.2 NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)與分組

細(xì)胞置于含5%胎牛血清、1%青霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每24～36 h換液１次，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%后棄掉培養(yǎng)液；用5 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗2次，去除殘留培養(yǎng)基，隨后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化；在顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞收縮變圓后，立即加入5 mL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，將培養(yǎng)瓶內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中；1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入15 mL完全培養(yǎng)基并吹打混勻，按照1：3傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

此時(shí)，加入MEM減血清培養(yǎng)基使細(xì)胞同步處于G0期。取培養(yǎng)后同步處于G0期的NRK-52E細(xì)胞，參考曾宇鵬等［10］的高尿酸造模方式按培養(yǎng)條件的不同分為6組：1）正常培養(yǎng)組（N組），即僅使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。2）正常培養(yǎng)ZAG上調(diào)組（N-ZAG+組），使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)下行ZAG過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染試驗(yàn)操作：取對數(shù)生長期的NRK-52E細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后種于六孔板內(nèi)，使次日細(xì)胞匯合率達(dá)60%；轉(zhuǎn)染前2 h更換培養(yǎng)基為減血清無雙抗MEM培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染復(fù)合物體系配置為200 μL MEM+5 μg過表達(dá)質(zhì)粒+5 μL Lipo3000；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中；放入培養(yǎng)箱中孵育過夜，更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基；48 h后收集細(xì)胞樣品）。3）正常培養(yǎng)ZAG下調(diào)組（N-ZAG-組），使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)下行ZAG敲低siRNA轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染試驗(yàn)操作：取對數(shù)生長期的NRK-52E細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后種于六孔板內(nèi)，使次日細(xì)胞匯合率達(dá)30%；轉(zhuǎn)染前2 h更換培養(yǎng)基為減血清無雙抗MEM培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染復(fù)合物體系配置為200 μL MEM+9 μL rno-Azgp1-siRNA+9 μL Lipo3000；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中；放入培養(yǎng)箱中孵育8 h后更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基；48 h后收集細(xì)胞樣品）。4）高尿酸培養(yǎng)組（H組），使用高尿酸培養(yǎng)基（在完全培養(yǎng)基中加入20 mg/dL尿酸）培養(yǎng)。5）高尿酸培養(yǎng)ZAG上調(diào)組（H-ZAG+組），使用高尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)下行ZAG過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染試驗(yàn)操作：取對數(shù)生長期的NRK-52E細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后種于六孔板內(nèi)，使次日細(xì)胞匯合率達(dá)60%；轉(zhuǎn)染前2 h更換培養(yǎng)基為減血清無雙抗MEM培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染復(fù)合物體系配置為200 μL MEM+5 μg過表達(dá)質(zhì)粒+5 μL Lipo3000；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中；放入培養(yǎng)箱中孵育過夜，更換培養(yǎng)基為高尿酸培養(yǎng)基；48 h后收集細(xì)胞樣品）。6）高尿酸培養(yǎng)ZAG下調(diào)組（H-ZAG-組），使用高尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)下行ZAG敲低siRNA轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染試驗(yàn)操作：取對數(shù)生長期的NRK-52E細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后種于六孔板內(nèi)，使次日細(xì)胞匯合率達(dá)30%；轉(zhuǎn)染前2 h更換培養(yǎng)基為減血清無雙抗MEM培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染復(fù)合物體系配置為200 μL MEM+9 μL rno-Azgp1-siRNA+9 μL Lipo3000；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中；放入培養(yǎng)箱中孵育8 h后更換培養(yǎng)基為高尿酸培養(yǎng)基；48 h后收集細(xì)胞樣品）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)造模效果檢測

1.3.1 NRK-52E細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%欲進(jìn)行傳代時(shí)，使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.3.2 NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果檢測

各組轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后分別使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測ZAG mRNA的表達(dá)水平，使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 NRK-52E細(xì)胞的mRNA抽提及cDNA的制備

使用核酸提取試劑盒分別提取上述各組的mRNA，測定每個(gè)樣品中總mRNA的濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3.4 RT-qPCR擴(kuò)增相關(guān)基因

引物序列見表1。采用GAPDH作為內(nèi)參，RT-qPCR反應(yīng)體系如下：2.0 μL cDNA模板、10.0 μL SYBR Green PCR Mastermix試劑、0.8 μL正向引物、0.8 μL反向引物、0.4 μL ROX Reference Dye、6.0 μL無酶無菌水。反應(yīng)采用兩步法，擴(kuò)增參數(shù)如下：預(yù)變性，95℃ 30 s；PCR反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)的95℃ 5 s和60℃ 30 s，得出各反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和Ct值。采用相對定量2–ΔΔCt法比較各基因的表達(dá)差異。

1.3.5 NRK-52E細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取、蛋白質(zhì)電泳前處理和Western blot法檢測

將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上，每皿加入適量放射免疫沉淀法裂解緩沖液（radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA）+苯甲磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）+磷酸酶抑制劑，冰上裂解30 min后用細(xì)胞刮刀充分刮取細(xì)胞，收集液體至EP管中， 4℃下13 000 r/min離心10 min，收集上清于新EP管中。用BCA法測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度后，加入Loading Buffer上樣緩沖液，煮沸變性，并做蛋白濃度歸一化處理，將各組蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度調(diào)整為3 μg/μL。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上分離每個(gè)等量蛋白質(zhì)的樣品并電流轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。在室溫下，將膜置于脫脂牛奶中封閉2 h后，在4℃下過夜孵育一抗（ZAG、vimentin、laminin、MAPKK、ERK1/2、p38、Akt、ATF2、GAPDH），在含有0.05% Tween 20的Tris緩沖鹽水中洗滌3次后（每次洗滌10 min），在室溫下孵育二抗1 h。最后使用發(fā)光液曝光顯影儀顯影，并使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用GraphPad Prism9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，對不同組別數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)比較，得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NRK-52E的轉(zhuǎn)染效果檢測

用目的質(zhì)?？墒筃RK-52E中的ZAG過表達(dá)，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下表達(dá)綠色熒光；siRNA把小分子RNA遞入胞質(zhì)內(nèi)，可以起到沉默目的基因的作用，沉默成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下表達(dá)紅色熒光。使用倒置熒光顯微鏡觀察目的質(zhì)粒和siRNA在細(xì)胞中的表達(dá)情況。并運(yùn)用RT-qPCR檢測各組NRK-52E中ZAG mRNA的表達(dá)水平：在N-ZAG+組中ZAG的表達(dá)量增加了502.13%（Plt;0.001），下調(diào)組中ZAG的表達(dá)量減少了84.81%（Plt;0.05）；高尿酸環(huán)境下培養(yǎng)的NRK-52E上調(diào)組中ZAG的表達(dá)量增加了104.61%（Plt;0.05），下調(diào)組中ZAG的表達(dá)量減少了86.27%（Plt;0.005）（圖1）。

2.2 高尿酸干預(yù)對NRK-52E中ZAG mRNA和

蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

與N組相比，高尿酸環(huán)境下培養(yǎng)的NRK-52E中ZAG mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯增加（Plt;0.01；Plt;0.001）（圖2）。這在Larco等［8］的試驗(yàn)中也有體現(xiàn)。

2.3 高尿酸干預(yù)和ZAG轉(zhuǎn)染對NRK-52E中EMT標(biāo)志物相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響。

如圖3所示，試驗(yàn)結(jié)果表明，ZAG的上下調(diào)對在正常環(huán)境下培養(yǎng)的NRK-52E中EMT標(biāo)志物相關(guān)蛋白laminin和vimentin的mRNA上的改變不具有顯著作用（Pgt;0.05）。在高尿酸環(huán)境培養(yǎng)下的細(xì)胞中，ZAG的轉(zhuǎn)染上調(diào)會減少NRK-52E中EMT標(biāo)志物相關(guān)蛋白laminin mRNA的表達(dá)量，而沉默ZAG則會增加laminin和vimentin mRNA的表達(dá)量（Plt;0.001）。

在蛋白層面上，沉默ZAG可使正常環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞中l(wèi)aminin和vimentin蛋白的表達(dá)上調(diào)（Plt;0.05，Plt;0.01），而上調(diào)ZAG則無顯著影響（Pgt;0.05）；在高尿酸環(huán)境下，ZAG的轉(zhuǎn)染上調(diào)會減少NRK-52E中l(wèi)aminin和vimentin蛋白的表達(dá)量（Plt;0.05），ZAG的下調(diào)則會增加NRK-52E中l(wèi)aminin和vimentin 蛋白的表達(dá)量（Plt;0.01，Plt;0.05）。

有文獻(xiàn)提到，調(diào)控相關(guān)基因后，EMT標(biāo)志物相關(guān)蛋白（如vimentin）的表達(dá)會在高尿酸腎病的情況下更加顯著［12］。我們在試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，正常環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞，三個(gè)組間缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明，ZAG的轉(zhuǎn)染或抑制在高尿酸環(huán)境下會對EMT相關(guān)標(biāo)志物起到更明顯的作用。

2.4 高尿酸干預(yù)和ZAG轉(zhuǎn)染對MAPKK通路中ERK1/2、p38、Akt、ATF2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

在高尿酸環(huán)境培養(yǎng)下，ZAG的上調(diào)會減少NRK-52E在該通路中MAPKK、ERK1/2、p38、ATF2及Akt mRNA的表達(dá)量（Plt;0.01），而ZAG的下調(diào)則會增加它們的表達(dá)量（Plt;0.05）。這在正常環(huán)境培養(yǎng)下的細(xì)胞中不具有顯著差異（Pgt;0.05），僅當(dāng)ZAG下調(diào)時(shí)會導(dǎo)致細(xì)胞中Akt mRNA表達(dá)量的增加（Plt;0.05）（圖4）。

在蛋白層面上，相較于未轉(zhuǎn)染的H組，H-ZAG+組的MAPKK、p38和Akt的表達(dá)量減少（Plt;0.05、Plt;0.01、Plt;0.001）；ERK1/2和ATF2蛋白表達(dá)量的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），H-ZAG-組的ERK1/2、p38和Akt的表達(dá)量增加（Plt;0.001、Plt;0.05、Plt;0.01）；MAPKK和ATF2蛋白表達(dá)量的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

在正常環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞，三個(gè)組間缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明，ZAG的轉(zhuǎn)染或抑制在高尿酸環(huán)境下會對大鼠腎細(xì)胞MAPKK通路中ERK1/2、p38、ATF2及Akt mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)起到更明顯的作用。這從另一方面驗(yàn)證了該造模環(huán)境的顯著性。

3 討論

本試驗(yàn)基于高尿酸誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞模型探討了通過調(diào)整ZAG在該細(xì)胞中的表達(dá)量后細(xì)胞中EMT標(biāo)志分子及ERK1/2和p38信號通路相關(guān)蛋白的分子變化。試驗(yàn)結(jié)果表明：在高尿酸干預(yù)后NRK-52E中ZAG mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯增加（Plt;0.01；Plt;0.001）；經(jīng)ZAG轉(zhuǎn)染上調(diào)的NRK-52E中EMT標(biāo)志物相關(guān)蛋白laminin和vimentin mRNA的表達(dá)量減少，這在高尿酸環(huán)境培養(yǎng)下的細(xì)胞中表現(xiàn)更加顯著（Plt;0.05），而在正常環(huán)境條件培養(yǎng)下的細(xì)胞中差異不顯著（Pgt;0.05），而ZAG的下調(diào)則會增加它們的表達(dá)量，這在兩種環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞中均有體現(xiàn)。在蛋白層面上，ZAG的上下調(diào)對于正常環(huán)境下培養(yǎng)的NRK-52E中l(wèi)aminin和vimentin蛋白的表達(dá)量影響差異不顯著（Pgt;0.05），而在高尿酸環(huán)境下上調(diào)ZAG會減少NRK-52E中l(wèi)aminin蛋白的表達(dá)量（Plt;0.05），下調(diào)ZAG會增加NRK-52E中l(wèi)aminin和vimentin蛋白的表達(dá)量（Plt;0.0001）；在高尿酸環(huán)境培養(yǎng)下的NRK-52E中，上調(diào)ZAG會減少NRK-52E在該通路中MAPKK、ERK1/2、p38、ATF2及Akt mRNA的表達(dá)量（Plt;0.01），而ZAG的下調(diào)則會增加它們的表達(dá)量（Plt;0.05），這在正常環(huán)境培養(yǎng)下的細(xì)胞中不具有顯著差異（Pgt;0.05）。在蛋白層面上，高尿酸環(huán)境培養(yǎng)下上調(diào)ZAG，會使得MAPKK、p38和Akt表達(dá)量減少（Plt;0.05、Plt;0.01、Plt;0.001）；ERK1/2和ATF2蛋白表達(dá)量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），下調(diào)ZAG時(shí)ERK1/2、p38和Akt表達(dá)量增加（Plt;0.001、Plt;0.05、Plt;0.01）；MAPKK和ATF2蛋白表達(dá)量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

課題組先前的試驗(yàn)表明，高尿酸血癥組小鼠血清ZAG濃度升高，血清尿酸值與ZAG呈正相關(guān)［11］，這與我們的結(jié)論相吻合。有研究指出，vimentin、laminin的表達(dá)上調(diào)代表EMT進(jìn)展活躍［2］。Tao等［12］的研究顯示，高尿酸血癥損傷誘導(dǎo)了EMT，其特征在于HN大鼠模型中E-鈣黏蛋白的下調(diào)以及vimentin的上調(diào)。本試驗(yàn)中，相較于N組，高尿酸環(huán)境下的大鼠腎細(xì)胞中EMT相關(guān)分子的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)均上調(diào)（Plt;0.05），這與上述試驗(yàn)結(jié)果相符。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，正常環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞在影響EMT的標(biāo)記分子表達(dá)方面組間缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明，ZAG的轉(zhuǎn)染或沉默在處于高尿酸環(huán)境下會對EMT相關(guān)標(biāo)志物起到更明顯的作用。這在Tao等［12］的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，或許是因?yàn)樵诟吣蛩岘h(huán)境下激活了細(xì)胞中相關(guān)的炎癥通路，細(xì)胞氧化應(yīng)激更加劇烈，ZAG的上下調(diào)便在影響EMT的標(biāo)記分子表達(dá)方面更具明顯的作用。

ZAG作為一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，在臨床病理研究中表現(xiàn)為與腎小管間質(zhì)損害程度強(qiáng)相關(guān)，并被認(rèn)為是評估腎間質(zhì)纖維化程度的生物學(xué)指標(biāo)［13］。Pelletier等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，患有慢性腎臟疾病的人在白色脂肪組織中ZAG的合成顯著增加。本試驗(yàn)中，高尿酸環(huán)境下誘導(dǎo)生長的大鼠腎細(xì)胞中ZAG的含量也顯著增加。

MAPK是一類細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一族連接細(xì)胞膜表面受體與決定性基因表達(dá)之間的重要信號調(diào)節(jié)酶。細(xì)胞利用該系統(tǒng)將細(xì)胞外刺激信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。ERK1/2和p38同屬M(fèi)APK類激酶，研究表明，ERK1/2和p38信號通路在損傷修復(fù)中起著關(guān)鍵的作用［15-16］。

有研究發(fā)現(xiàn)，尿酸通過激活蛋白激酶C/絲裂 原激活蛋白激酶/胞漿型磷脂酶A2（protein kinase C/mitogen-activated protein kinase/cytoplasmic phospholipase A2，PKC/MAPK/cPLA2）通路刺激血管平滑肌增生，損傷內(nèi)皮功能［17］。尿酸首先通過血管平滑肌細(xì)胞上的陰離子通道進(jìn)入細(xì)胞，激活血管平滑肌細(xì)胞的激活蛋-1（activated protein 1，AP-1）和 PKC，隨后激活MAPK的信號分子p38和ERK1/2；尿酸還會刺激腎小球系膜細(xì)胞，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，促進(jìn)ERK1/2磷酸化，使脯氨酸相鄰的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，通過該方式再次激活MAPK的信號分子p38和ERK1/2，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的C-反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）的mRNA及蛋白質(zhì)分泌增加，且CRP能減少一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成，并促進(jìn)黏附分子和細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移［18］；有研究指出，p38可以激活ERK1/2信號通路中的ERK1/2及下游的Akt，而ERK1/2則能激活p38下游的多種轉(zhuǎn)錄因子（如ATF2），共同調(diào)控著損傷修復(fù)的生理過程［19-20］。以上文獻(xiàn)提示，ERK1/2抑制減弱了HN大鼠模型中的腎臟EMT，而我們則通過試驗(yàn)證實(shí)了ZAG的上調(diào)可以在ERK1/2和p38信號通路中起到重要的調(diào)控作用。然而，調(diào)控ZAG表達(dá)量在活體動物中是否可以抑制腎細(xì)胞EMT的具體表現(xiàn)仍不清楚，需要后續(xù)更多的深入研究。

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