銀杏內(nèi)酯B調(diào)控JAK2/STAT3信號通路對食管癌細胞增殖及凋亡的影響

摘 要：為研究銀杏內(nèi)酯B對食管癌細胞增殖和凋亡的作用及相關(guān)機制，采用體外培養(yǎng)人食管癌OE19細胞，將其分為對照組（不做干預(yù)）、低/中/高劑量試驗組（分別加入6.25、12.50、25.00 μmol/L銀杏內(nèi)酯B）、銀杏內(nèi)酯B組（12.50 μmol/L銀杏內(nèi)酯B）、陽性藥物組（4 mg/L順鉑）、抑制劑組［12.50 μmol/L銀杏內(nèi)酯B+10.00 μmol/L Janus激酶2/轉(zhuǎn)錄激活因子3（JAK2/STAT3）通路抑制劑AG490］、激活劑組（12.50 μmol/L銀杏內(nèi)酯B+0.50 μmol/L JAK2/STAT3通路激活劑Colivelin），干預(yù)24 h后，采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）法、Hoechst 33258染色法、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡（WB）法檢測細胞的活力、增殖率、凋亡率及相關(guān)因子的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，中/高劑量試驗組與陽性藥物組的細胞活力降低（Plt;0.05），因此，本研究選擇有顯著差異且較低濃度的12.50 μmol/L銀杏內(nèi)酯B作為銀杏內(nèi)酯B組進行后續(xù)試驗。與對照組相比，銀杏內(nèi)酯B組和陽性藥物組細胞的增殖率、Cyclin D1的mRNA和蛋白質(zhì)、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達水平降低，凋亡率、Caspase-3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平升高（Plt;0.05）。與銀杏內(nèi)酯B組相比，抑制劑組各指標(biāo)變化進一步增強（Plt;0.05），激活劑組則顯著逆轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)的變化（Plt;0.05）。銀杏內(nèi)酯B能夠通過下調(diào)JAK2/STAT3信號通路抑制OE19細胞的增殖，促進食管癌細胞凋亡。本研究揭示了銀杏內(nèi)酯B新抗癌機制，為食管癌的研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：食管癌；銀杏內(nèi)酯B；Janus激酶2/轉(zhuǎn)錄激活因子3；增殖；凋亡

中圖分類號：R318.14 " " " " " " " " " " " " " 文獻標(biāo)志碼：A " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.02.011

Effects of Ginkgolide B on Proliferation and Apoptosis of Esophageal Cancer Cells by Regulating JAK2/STAT3 Signaling Pathway

YIN Xing， HOU Yongchao*， YANG Lijiao， ZHANG Meng

（Department of Oncology， Handan First Hospital， Handan 056002， China）

Abstract： To investigate the effects of ginkgolide B on the proliferation and apoptosis of esophageal cancer cells and the related mechanisms. Human esophageal cancer OE19 cells were cultured in vitro. They were divided into control group （no intervention）， low/medium/high dose test group （adding 6.25， 12.50 and 25.00 μmol/L ginkgolide B， respectively）， ginkgolide B group （12.50 μmol/L ginkgolide B）， positive drug group （4 mg/L cisplatin） and inhibitor group ［12.50 μmol/L ginkgolide B+10.00 μmol/L janus kinase 2/transcriptional activator 3 （JAK2/STAT3） pathway inhibitor AG490］ and activator group （12.50 μmol/L ginkgolide B+0.50 μmol/L JAK2/STAT3 pathway activator Colivelin）， 24 h after intervention， cell count kit 8 （CCK-8）， 5-acetyl-2' deoxyuridine （EdU） method， Hoechst 33258 staining， real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and protein immunoblot （WB） were used to detect cell viability， proliferation rate， apoptosis rate and expression levels of related factors. The results show that： compared with the control group， the cell viability of the medium/high dose test group and positive drug group was decreased （Plt;0.05）， therefore， in this study， 12.50 μmol/L ginkgolide B group with significant difference and lower concentration was selected as ginkgolide B group for follow-up tests. Compared with the control group， the cell proliferation rate， Cyclin D1 mRNA and protein expression levels， p-JAK2 and p-STAT3 protein expression levels of ginkgolide B group and positive drug group were decreased， while the apoptosis rate and Caspase-3 mRNA and protein expression levels were increased （Plt;0.05）. Compared with the ginkgolide B group， the changes of all indexes in inhibitor group were further enhanced （Plt;0.05）. while those in activator group were significantly reversed （Plt;0.05）. Ginkgolide B can inhibit the proliferation of OE19 cells and promote apoptosis of esophageal cancer cells by down-regulating JAK2/STAT3 signaling pathway. This study revealed a new anticancer mechanism of ginkgolide B and provided a theoretical basis for the study of esophageal cancer.

Key words： esophageal cancer; ginkgolide B; janus kinase 2/transcriptional activator 3; proliferation; apoptosis

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（2）： 185-192）

食管癌（esophageal cancer）屬于常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有死亡率高、預(yù)后差等特點［1］。目前多用放化療對食管癌進行治療，但其對放療不敏感，部分化療藥物易使患者機體產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，降低了患者的生活質(zhì)量［2］。因此，探究有效藥物治療食管癌意義重大。中醫(yī)藥治療惡性疾病已有千年歷史。食管癌屬中醫(yī)學(xué)“噎膈”范疇，是“風(fēng)、癆、臌、膈”四大頑癥之一，常采用放化療結(jié)合中醫(yī)藥辨證論治［3］。銀杏內(nèi)酯B是提取自中藥銀杏葉的二萜類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗休克和抗腫瘤等藥理作用［4］。Kawasaki等［5］的研究表明，銀杏內(nèi)酯B能增強口腔癌的化學(xué)敏感性與細胞凋亡，除此之外，還能抑制肺癌細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡［6］。Janus激酶2/轉(zhuǎn)錄激活因子3（janus kinase 2/transcriptional activator 3，JAK2/STAT3）通路參與腫瘤的分化、增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為［7］。前人已證實，JAK2/STAT3信號通路與食管癌細胞的增殖有關(guān)［8］。且有研究表明，銀杏內(nèi)酯B能夠通過STAT3通路調(diào)控肺癌細胞的惡性生物學(xué)行為［9］。但銀杏內(nèi)酯B是否能夠通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路影響食管癌的增殖、凋亡尚未可知。基于此，本研究探討了銀杏內(nèi)酯B干預(yù)對食管癌細胞增殖、凋亡的影響以及對JAK2/STAT3信號通路的調(diào)控機制，為研究食管癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人食管癌OE19細胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。主要試劑有順鉑（上海吉至生化科技有限公司，Pt≥64.5%）、銀杏內(nèi)酯B（上海吉至生化科技有限公司，純度≥98%）、JAK2/STAT3通路激活劑Colivelin（源葉-上海，純度≥98%）、JAK2/STAT3通路抑制劑AG490（上海吉至生化科技有限公司，純度≥99%）、胎牛血清（索萊寶-北京）、細胞計數(shù)試劑盒-8（cell count kit-8，CCK-8）（翌圣-上海）、RPMI-1640培養(yǎng)基（北納創(chuàng)聯(lián)-北京）、5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-acetyl-2' deoxyuridine，EdU）細胞增殖檢測試劑盒（優(yōu)逸蘭迪-蘇州）、Hoechst 33258染色試劑盒（百奧萊博-北京）、RNA抽提試劑盒與引物（生工-上海）、鼠抗人［半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartate protease-3，Caspase-3）、細胞周期素D1（Cyclin D1）、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2及β-actin］一抗與辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）二抗（山羊抗鼠IgG）（三鷹-武漢）。主要儀器有3H16RI型低溫高速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）、IMARK型酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）、WMF-3690型倒置熒光顯微鏡（上海豫光儀器有限公司）、DYCZ-24KF型四板垂直蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 人食管癌OE19細胞培養(yǎng)

將食管癌OE19細胞置于含1%青-鏈霉素、10%胎牛血清RPMI-1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，貼壁（80%～90%）后傳代，第3代（對數(shù)期生長期）用于試驗，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。

1.2.2 分組及給藥

預(yù)試驗確定銀杏內(nèi)酯B的最適作用濃度。試驗分為對照組、低/中/高劑量試驗組和陽性藥物組。對照組不做干預(yù)，低/中/高劑量試驗組分別加入6.25、12.50、25.00 μmol/L銀杏內(nèi)酯B干預(yù)，陽性藥物組加入4 mg/L順鉑干預(yù)，各組設(shè)置3個復(fù)孔，分別干預(yù)24 h，在37℃、5% CO2的條件下進行培養(yǎng)。

隨后進行抑制、激活試驗。試驗分為對照組、銀杏內(nèi)酯B組、陽性藥物組、抑制劑組和激活劑組。對照組不做干預(yù)，銀杏內(nèi)酯B組加入12.50 μmol/L銀杏內(nèi)酯B干預(yù)，陽性藥物組加入4 mg/L順鉑干預(yù)，抑制劑組分別加入12.50 μmol/L銀杏內(nèi)酯B和10.00 μmol/L AG490［10］干預(yù)，激活劑組分別加入12.50 μmol/L 銀杏內(nèi)酯B和0.50 μmol/L Colivelin［11］干預(yù)。各組分別干預(yù)24 h，每組設(shè)置3個復(fù)孔，后置于37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法檢測OE19細胞的活力

收集各組干預(yù)后的細胞，接種于96孔板（每毫升2×105個細胞，每孔100 μL）中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀測定其吸光度（optical density，OD）值（450 nm），重復(fù)檢測3次。細胞活力為各孔OD值和空白組OD值的差值與對照組OD和空白組OD值的差值的百分比。

1.2.4 EdU法測定OE19細胞的增殖率

收集各組干預(yù)后的細胞，參照EdU試劑盒進行操作，檢測細胞的增殖率。用熒光顯微鏡拍照，并用ImageJ 1.8軟件處理圖片。細胞增殖率為紅色細胞數(shù)占藍色細胞數(shù)（即總細胞）的比值。

1.2.5 Hoechst 33258染色法測定OE19細胞的凋亡率

用磷酸鹽緩沖液洗滌各組細胞2次，用4%多聚甲醛固定10 min。洗滌后，用5 mg/L Hoechst 33258染色10 min，然后洗滌、封固，用熒光顯微鏡觀察并拍照。凋亡細胞染色不均、濃染，核體積濃縮變小，呈亮藍色熒光。細胞凋亡率為藍色細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法測定OE19細胞中增殖與凋亡相關(guān)因子mRNA的相對表達量

收集各組干預(yù)后的細胞，參照RNA抽提試劑盒進行操作，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行定量檢測。每個樣品重復(fù)3次。內(nèi)參基因為GAPDH基因，目的基因相對表達量的計算方法為2-ΔΔCt法。引物序列見表1。

1.2.7 蛋白免疫印跡（WB）法檢測OE19細胞中相關(guān)蛋白的表達水平

取干預(yù)24 h的細胞提取蛋白質(zhì)，進行定量后上樣，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉2 h；參照抗體說明書加一抗（Caspase-3、Cyclin D1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及β-actin）后過夜（4℃孵育），洗滌后加二抗（山羊抗鼠IgG），孵育2 h，洗滌3次后顯影（顯影液），用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄。蛋白質(zhì)的相對表達量為目的蛋白的蛋白灰度值（G）與內(nèi)參蛋白的G的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較分析方法為單因素方差分析，符合正態(tài)分布且方差齊時，兩組間比較用Dunnett’s t檢驗；不符合正態(tài)分布時，采用秩和檢驗，使用GraphPad Prism 8軟件進行作圖，Plt;0.05即差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏內(nèi)酯B對OE19細胞活力的影響

干預(yù)24 h后，中/高劑量試驗組與陽性藥物組細胞的活力較對照組降低（Plt;0.05），低劑量試驗組細胞的活力降低無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。因此，本研究選擇有顯著差異且較低濃度的12.50 μmol/L銀杏內(nèi)酯B作為銀杏內(nèi)酯B組進行后續(xù)試驗（圖1）。

2.2 銀杏內(nèi)酯B通過JAK2/STAT3信號通路對OE19細胞增殖率的影響

干預(yù)24 h后，與對照組相比，銀杏內(nèi)酯B組和陽性藥物組細胞的增殖率下降（Plt;0.05）。抑制劑組細胞的增殖率較銀杏內(nèi)酯B組進一步下降（Plt;0.05），激活劑組細胞的增殖率上升（Plt;0.05）（圖2）。

2.3 銀杏內(nèi)酯B通過JAK2/STAT3通路對OE19細胞凋亡的影響

干預(yù)24 h后，銀杏內(nèi)酯B組和陽性藥物組細胞的凋亡率較對照組升高（Plt;0.05）。抑制劑組細胞的凋亡率較銀杏內(nèi)酯B組進一步升高（Plt;0.05），激活劑組細胞的凋亡率降低（Plt;0.05）（圖3）。

2.4 銀杏內(nèi)酯B通過JAK2/STAT3通路對OE19細胞增殖與凋亡相關(guān)因子的影響

干預(yù)24 h后，與對照組相比，銀杏內(nèi)酯B組和陽性藥物組Caspase-3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達升高（Plt;0.05），Cyclin D1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達降低（Plt;0.05）。與銀杏內(nèi)酯B組相比，抑制劑組細胞Caspase-3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達進一步升高（Plt;0.05），而Cyclin D1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達進一步降低（Plt;0.05），激活劑組細胞Caspase-3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達降低（Plt;0.05），Cyclin D1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達升高（Plt;0.05）（圖4）。

2.5 銀杏內(nèi)酯B抑制OE19細胞JAK2/STAT3信號通路活化

與對照組相比，銀杏內(nèi)酯B組和陽性藥物組p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達降低（Plt;0.05）。與銀杏內(nèi)酯B組相比，抑制劑組p-JAK2及p-STAT3蛋白的表達進一步降低（Plt;0.05），激活劑組p-JAK2及p-STAT3蛋白的表達升高（Plt;0.05）。在各組中，JAK2、STAT3蛋白的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）（圖5）。

3 討論

食管癌作為常見的消化道惡性腫瘤，早期患者主要采用手術(shù)治療，中晚期多為放化療，但毒副作用較大，會加重患者的痛苦。中醫(yī)藥治療腫瘤歷史悠久，且中藥對于食管癌的治療也多有報道，關(guān)于其論述有“食飲不下，膈塞不通，邪在胃脘”“膈塞閉絕，上下不通，則暴憂之病也”等。前人認為，導(dǎo)致食管癌的直接病因是外邪直中，食管反復(fù)損傷，治療上主張不僅要辨證論治、病癥結(jié)合，而且還要采取分期辨證，整體和局部治療相結(jié)合的方法［12-13］。銀杏內(nèi)酯B是從中藥銀杏葉中提取的具有較強藥用的活性成分。多項研究表明，銀杏內(nèi)酯B對腫瘤細胞具有抑制作用。如在肺癌中，Wang等［14］的研究表明，銀杏內(nèi)酯B具有抑制細胞增殖的作用；在胰腺癌中，Lou等［15］指出，銀杏內(nèi)酯B能夠抑制細胞的生長與增殖，并誘導(dǎo)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的銀杏內(nèi)酯B降低了人食管癌OE19細胞的活力，其中以中、高劑量的銀杏內(nèi)酯B最為明顯，陽性藥物順鉑［16］也有相同的作用，提示銀杏內(nèi)酯B可以抑制食管癌細胞的生長，有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。腫瘤細胞的典型特征包括異常增殖，增殖過程的標(biāo)志蛋白Cyclin D1高表達能夠促進腫瘤細胞的生長與增殖［17］。細胞凋亡屬于程序性細胞死亡，作為執(zhí)行細胞凋亡的關(guān)鍵因子Caspase-3，對其活性調(diào)節(jié)能夠起到調(diào)控凋亡的作用［18］。在李雅靜等［6］的研究中，銀杏內(nèi)酯B能夠?qū)Ψ伟┘毎脑鲋称鸬揭欢ǖ囊种谱饔茫⒖烧T導(dǎo)細胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B和順鉑處理后，OE19細胞中增殖率、Cyclin D1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達降低，凋亡率、Caspase-3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達升高，提示銀杏內(nèi)酯B能夠抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。

近年來，多項研究表明，JAK2/STAT3信號通路參與細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)行為，在多種惡性腫瘤中均發(fā)生異常激活。如在胰腺癌中，F(xiàn)an等［19］的報道指出，中藥西洋參根提取物人參二醇能夠通過JAK2/STAT3信號通路抑制細胞系PANC-1和Patu8988的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡；靳彩玲等［9］的研究表明，銀杏內(nèi)酯B能夠通過調(diào)控STAT3通路抑制肺癌細胞的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡。JAK2/STAT3信號通路也與食管癌的生物學(xué)進程密切相關(guān)。Yang等［20］的研究顯示，脫氫木香內(nèi)酯處理后，細胞發(fā)生凋亡及細胞周期停滯，p-JAK2與p-STAT3的表達水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B和順鉑處理后，p-JAK2與p-STAT3蛋白的表達降低，加入JAK2/STAT3信號通路抑制劑處理后，p-JAK2與p-STAT3蛋白的表達進一步降低，且細胞的增殖率、Cyclin D1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達降低，凋亡率、Caspase-3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達升高，而在加入JAK2/STAT3信號通路激活劑后出現(xiàn)相反的趨勢，提示銀杏內(nèi)酯B能夠通過下調(diào)JAK2/STAT3信號通路抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B能夠通過下調(diào)JAK2/STAT3信號通路抑制OE19細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究揭示了銀杏內(nèi)酯B新抗癌機制，為食管癌的研究提供了理論依據(jù)。但人食管癌OE19細胞增殖和凋亡的其他機制目前還未完全闡明，需進一步深入研究。

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