高內涵無熒光標記活細胞的運動追蹤分析

摘要：細胞運動與多種細胞行為及疾病發生治療等息息相關，通過實時細胞追蹤和分析可為揭示細胞行為以及細胞運動的規律、以及疾病發生機制等提供實驗依據。當前細胞追蹤的常規實驗方法多是從群體層面上對細胞遷移進行間接分析，無法追蹤遷移過程中單個細胞的形態學以及運動動力學等參數的變化，尤其對于無熒光標記活細胞，常規明場或相差圖像的追蹤分析，存在圖像中背景與細胞間的對比度低、細胞邊界不連續等問題，難以實現細胞形態的準確識別和分辨以及自動追蹤分析。高內涵細胞成像系統設備結合了活細胞成像模塊和多參數的高內涵分析軟件，可實現無標記活細胞快速成像以及自動分割識別和追蹤分析。本文總結了高內涵成像系統的無標記細胞分析模塊在體外細胞運動追蹤實驗中的應用。

關鍵詞：高內涵成像分析；無標記活細胞；細胞追蹤

中圖分類號：Q334" " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.10.001

文章編號：1006-1959（2024）10-0001-05

Motion Tracking Analysis of High-content Non-fluorescent Labelling in Living Cells

LI Juan，ZHANG Xuan-hong，GUAN Yuan-jun，LIANG Cui-sha，WU Jue-heng

（Zhongshan School of Medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，Guangdong，China）

Abstract：Cell movement is closely related to a variety of cell behaviors and disease treatment. Real-time cell tracking and analysis can provide experimental basis for revealing cell behavior， cell movement rules， and disease mechanism. At present， the conventional experimental methods of cell tracking are mostly indirect analysis of cell migration from the group level， which cannot track the changes of parameters such as morphology and motion dynamics of single cells during migration. Especially for non-fluorescent labelling in living cells， the tracking analysis of conventional bright field or phase difference images has problems such as low contrast between the background and cells in the image and discontinuous cell boundaries. It is difficult to achieve accurate identification and resolution of cell morphology and automatic tracking analysis. The high-content imaging system equipment combines the live cell imaging module and multi-parameter high-content analysis software， which can realize fast imaging of unlabeled live cells and automatic segmentation， recognition and tracking analysis. This paper summarizes the application of the label-free cell analysis module of the high-content imaging system in in vitro cell movement tracking experiments.

Key words：High-content imaging analysis;Label-free living cells;Cell tracking

細胞運動（cell movement）是一種基本的細胞行為，是發育[1，2]、組織維持[3]、免疫[4，5]和組織再生[6，7]，以及病理等多種生理過程的基礎[8-10]。因此，實現對細胞運動行為的實時監測和分析，有利于了解其作用機理，協助藥物開發和疾病治療。傳統體外細胞運動檢測方法包括劃痕、Transwell培養小室、趨化載玻片等實驗。借助顯微鏡時間序列成像和和軟件分析，通過區分和跟蹤細胞，提取位置和形態等信息[11，12]。無熒光標記的活細胞追蹤一般采用相差（phase contrast）成像模式，能更清晰地顯示細胞形態。然而，相差圖像因細胞與背景對比度低，目前的分析軟件難以實現細胞的準確識別和分割[13]。因此，許多相關細胞追蹤實驗仍依賴于手動跟蹤。高內涵成像系統（high content imaging system）結合顯微成像及多參數定量圖像分析技術，可實現單細胞水平上的客觀多參數采集和數據分析。在細胞活性、細胞周期、毒性檢測等方面應用廣泛[14-16]，其數字相差成像（digital phase contrast， DPC）模塊通過明場圖像構建數字相差圖像，顯著改善信噪比，實現無熒光標記細胞的自動準確識別和追蹤，可分析得到實時追蹤的細胞數、面積以及熒光信號強度變化、紋理參數、細胞動力學特征等多種數據結果，降低了實驗復雜性和成本。本文將介紹高內涵成像系統的數字相差成像模塊在無熒光標記細胞的運動追蹤分析中的應用，旨在為細胞遷移等相關研究提供一種高效的實驗方法與技術手段。

1無熒光標記細胞追蹤常用實驗方法存在的問題

目前劃痕、Transwell培養小室、趨化載玻片等實驗方法應用廣泛，但在成像通量、數據客觀性，實時精確追蹤，自動定量分析等方面存在不足。

1.1實驗可重復性較差、采樣率低

劃痕實驗成本低，操作簡單。但很難保證劃痕的大小和寬度一致，影響實驗結果的可重復性和一致性。另外，劃痕還可能會影響劃痕邊界周圍細胞的活性和運動潛能，脫落的部分細胞可能會造成劃痕愈合的假象。其次，常規活細胞成像系統受限于相機成像速度，即使具備大圖拼接成像功能，也較難同時采集所有劃痕區域的圖像，一般會挑選較好的局部區域成像和追蹤，存在人為偏差。此外，超過24 h的監測不能排除細胞增殖對劃痕愈合的影響。

1.2無法考量運動速度

Transwell實驗是檢測懸浮細胞運動能力的經典方法，對于細胞的運動和遷移能力的評價主要依賴于對轉移至底膜外側細胞的甲紫染色和計數。該方法只適用于終點檢測，難以實時檢測細胞的運動變化。無法考察細胞的運動速度。

1.3無法自動識別分析

常規明場或相差圖像存在圖像中背景與細胞間的對比度低、細胞邊界不連續、以及環細胞偽影等問題，難以實現細胞自動分割識別和追蹤分析。活細胞追蹤通常采用熒光染色或熒光標記法，過程繁瑣，且存在熒光通道串色，以及熒光成像時的光毒性等問題。

1.4手動分析流程復雜、單細胞檢測通量低

劃痕實驗手動分析一般只能從群體層面上對細胞遷移進行間接融合度分析，無法觀察和分析每個細胞在遷移中的速度、軌跡，以及形態變化等；無法追蹤細胞是否增殖、細胞增殖對劃痕愈合的影響，以及劃痕前緣的細胞與其他細胞在遷移過程中的區別等等問題。手動單個細胞追蹤分析流程復雜，通量低，工作量大、耗時且存在誤差。

2高內涵細胞運動追蹤實驗成像方法

不同于細胞染色方法，基于圖像方式的細胞運動分析方式是近年來發展起來的技術，該方法無需染色，通過軟件算法對無標記活細胞的時間序列圖像精細分割，分離圈選細胞，對細胞進行定位，實現細胞實時追蹤[17]。高內涵細胞成像系統設備結合了活細胞工作站、硬件轉盤式共聚焦成像模塊和多參數的高內涵分析軟件，可實現無標記活細胞快速成像以及基于圖像方式的自動分割分析[18]，在無標記活細胞追蹤實驗中應用廣泛。其保留了活細胞工作站的優點，同時實現了高通量的實時檢測，對單個細胞和細胞群落的運動均可進行分析，借助于多重分析模塊，可對細胞運動時形態與微結構的變化的實時追蹤觀察，在活細胞狀態下對細胞運動的相關信息進行直觀而詳盡的分析。

2.1高內涵無標記活細胞趨化實驗分析

以趨化因子分析為例，使用搭載活細胞控件的高內涵成像分析系統（PE Operetta CLS）監測了500 nmol/L細胞松弛素D對HT-1080纖維肉瘤細胞遷移的影響。加入化合物后，微孔板放入預熱的Operetta系統上，孵育30 min。使用10×物鏡采集數字相襯圖像（圖1A），細胞識別（圖1B）。成像時間間隔6 min，總檢測和成像時長2.5 h。使用配套的Harmony軟件的追蹤模塊進行細胞的動力學特性和軌跡特性分析。對照組和處理組分別通過軟件圈選細胞和自動追蹤運動軌跡（圖1C、圖1D），對當前速度，均方位移，根據每孔細胞的平均值作圖（圖1E、圖F），并根據當前位置坐標追蹤單個細胞的實時軌跡（圖1G）。通過對細胞進行圈選分割和追蹤分析，可計算時間相關的動力學特性變化數據如當前速度、當前位置坐標等。除了每個時間點的參數，還可以計算整個追蹤軌跡的參數，如平均累計距離（accumulated distance）、平均位移（displacement）和平均速度（average speed）（表1）。分析數據顯示，細胞松弛素D明顯影響細胞的運動遷移能力。

2.2高內涵自動追蹤分析和常規手動分析的比較

對于無標記活細胞，常規明場或相差圖像難以實現細胞自動識別和追蹤分析，常使用手動追蹤方法分析，如結合使用Image J圖像處理軟件和ibidi公司的用于分析趨化或遷移數據的免費軟件ibidi chemotaxis and migration tool進行手動追蹤。為比較高內涵活細胞追蹤分析和常規手動分析，同樣使用500 nmol/L細胞松弛素D處理HT-1080纖維肉瘤細胞。導入采集的時間序列圖像到Image J軟件中，通過手動模式記錄細胞軌跡：選擇1個細胞，點擊細胞中心點，會顯示初始位置坐標，之后手動點擊選取每張時間序列圖像中的細胞中心點，會產生該細胞隨時間變化的坐標信息。按同樣的流程，兩組均統計50個細胞的軌跡，保存軌跡坐標值表格。再將數據導入ibidi chemotaxis and migration tool中進行數據統計分析和畫圖。分析可得到兩組細胞追蹤軌跡的平均累計距離、平均位移和平均速度（表2），以及兩組追蹤的細胞在每個時間點的位置坐標參數，并根據每個細胞的實時位置坐標繪制追蹤軌跡圖。

手動追蹤分析方法也可得到每條軌跡的累計距離、平均位移和速度參數，但無法直觀獲得每孔所有細胞群體和時間相關的動力學特性變化如當前速度等參數，以繪制速度隨時間變化的曲線。也不能得到評價趨化運動的均方位移的定量數據，只能通過追蹤的累計距離圖定性比較（圖2）。更無法獲得每個時間點的單個細胞的面積、圓度等形態學特性變化，細胞的熒光強度變化等信息。雖然兩種分析方法得到的數據數量級相當，但相對于自動追蹤分析，手動追蹤存在分析通量低、工作量大以及手動點選細胞中心點造成的誤差等問題。

3高內涵無標記活細胞追蹤方法的優勢

相對于傳統細胞運動檢測方法，高內涵成像系統可實時無標記的單細胞以及細胞群體的高速低毒性成像。自動追蹤分析功能在分析便捷度、分析通量、數據精準度以及參數種類方面都具有明顯的優勢。

3.1成像速度快，光毒性小

采用轉盤式多點同步掃描方式，采集速度快，降低了對樣品的光漂白和光損傷。數字相位成像使用紅光LED透射光源，光毒性低。可快速實現整孔或整板成像，采樣量大，所有樣品的成像分析條件完全相同，可很好地消除人為偏差，定量統計結果更客觀。

3.2高信噪比數字相差成像

數字相差景深包圍成像，使用在不同Z平面采集的兩幅明場圖像構建數字相位圖像。重建基于數學算法，該算法考慮了試樣折射率變化引起的光強分布變化率。生成的數字相位圖像與具有高信噪比的熒光標記細胞的形態圖像性質相當，適合單個細胞圖像分割。且已有相關實驗證明，數字相襯圖像上的單細胞檢測是可靠的，與基于熒光圖像的分割進行比較時，顯示出相似的結果。

3.3自動圖像分割分析

細胞分割（cell segmentation）是生物圖像分析中很重要的一步。也是細胞追蹤的第一步，分割結果的好壞直接決定了細胞追蹤的準確度。在控制細胞密度的前提下，無需“劃痕”處理，結合搭載的圖像分析軟件，高內涵成像系統可實現圖像自動分割識別。即可對細胞的運動學和分裂代次等參數進行分析，對感興趣的細胞群進行移動距離、速度、分裂、方向位移、分裂代次等多參數分析，從而對比不同處理組細胞的變化情況。

4討論

明場圖像由于背景的整體強度與細胞的強度大致相同，對于高度融合的單層、非常薄的樣品或超薄的細胞區域，明場圖像信噪比低，使得結構難以可視化[19]。雖然通過對明場圖像進行簡單的欠焦可以提高圖像對比度，然而使用這種方法的形態學細節，尤其是細胞的較薄區域的形態學信息，可能會丟失。此外通過欠焦提高對比度的明場圖像用于單細胞分割效果仍然不佳。

高內涵數字相差圖像采用基于明場圖像的計算方法來生成，算法根據兩個明場圖像之間光強分布的變化率，顯著提高信噪比，實現類似熒光圖像的分割和圈選效果[20]。取代細胞質染色進行細胞分割，為其他感興趣的標記釋放一個熒光通道。降低了實驗復雜性和成本。自動模塊化的分析可直觀快捷得到多種細胞水平參數，如數量、面積、圓度、形態變化、信號強度以及紋理參數、細胞動力學特征等。此外，因為明場圖像采集使用光毒性低的紅色LED光源，結合紋理識別和機器自學習等功能，除了運動追蹤分析，還適用于細胞增殖[21]、細胞表型分類[22]、化合物對細胞的毒性檢測[23，24]、菌落生長和分化[25]、腫瘤類器官藥物反應[26]、輻射誘導的細胞損傷表型分析[27]、斑馬魚胚胎發育[28]等多種檢測和應用。

雖然高內涵成像分析系統在無標記活細胞成像分析中應用廣泛，且具有居多優點。但在樣品準備和耗材選擇等方面需注意，對于活細胞運動追蹤，種板密度非常重要，細胞密度較高時，細胞黏連或成團，將影響自動分割識別的準確度。其次，自動高通量成像對于微孔板質量要求較高，孔板底部厚度不均易導致部分視野失焦，DPC數字相差成像效果不佳，影響后續細胞的分割圈選識別準確度。另外，由于DPC圖像是基于明場圖像構建，曝光設置應針對相機動態范圍內的亮場強度合理設置，明場圖像的過度曝光以及光強不足將導致全黑圖像或非常暗的DPC圖像。此外，由于光學現象，使用5×物鏡生成的DPC圖像的質量（對比度）與耗材類型相關。一般來說，384孔板的對比度較好，96孔板次之，而載玻片上的細胞對比度最差。除耗材影響，對于需低倍整孔成像的實驗，可靠的數字相差圖像重建，需注意圖像不能包含任何微孔板孔邊界。相位重建算法不補償邊界效應。

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收稿日期：2023-05-23；修回日期：2023-07-03

編輯/肖婷婷