載拉帕替尼靶向超聲微泡聯合高強度聚焦超聲對HER-2陽性人乳腺癌SK-BR-3細胞作用的實驗研究

摘要：目的" 探討攜HER-2抗體載拉帕替尼新型靶向納米超聲微泡聯合高強度聚焦超聲（HIFU）對人乳腺癌SK-BR-3細胞的生物學作用。方法" 采用機械振蕩法制備攜HER-2抗體載拉帕替尼新型靶向納米超聲微泡體外培養HER-2（+）人乳腺癌SK-BR-3細胞珠，分為4組。HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡為A組、單純載拉帕替尼超聲微泡+HER-2抗體為B組、攜HER-2抗體空白超聲微泡為C組、空白超聲微泡為D組。載拉帕替尼靶向納米超聲微泡與細胞聯合培養，聯合HIFU作用，采用流式細胞技術、CCK-8實驗、western blot實驗在不同時間點觀察載拉帕替尼靶向納米超聲微泡聯合HIFU對SK-BR-3細胞生物學效應。結果" 本實驗所制備的攜HER-2抗體載拉帕替尼新型靶向納米超聲微泡的平均粒徑為（204.80±116.30）nm，Zeta電位為（-5.42±4.11）mV，包封率為（35.20±1.58）%。體外細胞尋靶實驗結果顯示，攜HER-2抗體載拉帕替尼新型靶向納米超聲微泡聯合HIFU作用與SK-BR-3細胞的結合能力高于其他三組（P＜0.05）；流式細胞結果顯示A組能有效促進SK-BR-3細胞凋亡，CCK-8實驗結果顯示A組能明顯抑制SK-BR-3細胞增殖，同時A組細胞凋亡相關蛋白Bcl-2表達升高，侵襲相關蛋白MMP-2表達降低（P＜0.05）。結論" 攜HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡聯合HIFU消融作用能有效地將拉帕替尼遞送入SK-BR-3細胞，并能有效抑制SK-BR-3細胞的生長，促進其凋亡。

關鍵詞：超聲微泡；高強度聚焦超聲；拉帕替尼；乳腺癌

中圖分類號：R9737.9" " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.10.015

文章編號：1006-1959（2024）10-0076-07

Experimental Study on the Effect of Lapatinib-loaded Targeted Ultrasound Microbubbles Combined with High-intensity Focused Ultrasound on HER-2 Positive Human Breast Cancer SK-BR-3 Cells

SONG Zhao-jun，LUO Juan，ZHENG Jia-zhuang，WANG Fan-dong，CHEN Yu，LIU Yuan-bin

（Spine Surgery Department of Suining Central Hospital，Suining 629000，Sichuan，China）

Abstract：Objective" To explore the effect of lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles combined with high-intensity focused ultrasound（HIFU） on HER-2 positive human breast cancer SK-BR-3 cells.Methods" The HER-2 （+） human breast cancer SK-BR-3 cell beads were cultured in vitro by using a novel targeted ultrasound microbubbles carrying HER-2 antibody and lapatinib-loaded by mechanical oscillation method， which were divided into 4 groups. HER-2 antibody and lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles were group A， simple lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles+HER-2 antibody were group B， HER-2 antibody and blank-loaded ultrasound microbubbles were group C， and blank ultrasound microbubbles were group D. Lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles were co-cultured with cells and combined with HIFU.Flow cytometry， CCK-8 assay and western blot assay were used to observe the biological effects of Lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles combined with HIFU on SK-BR-3 cells at different time points.Results" The mean diameter of the lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles was（204.8±116.3）nm， the Zeta potential was （-5.42±4.11）mV， and the encapsulation efficiency was （35.20±1.58）%. The results of in vitro cell targeting experiments showed that the binding ability of the lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles with HER-2 antibody and HIFU to SK-BR-3 cells was higher than that of the other three groups （Plt;0.05）. The results of flow cytometry showed that group A could effectively promote the apoptosis of SK-BR-3 cells. The results of CCK-8 assay showed that group A could significantly inhibit the proliferation of SK-BR-3 cells. At the same time， the expression of apoptosis-related protein Bcl-2 increased and the expression of invasion-related protein MMP-2 decreased in group A （Plt;0.05）.Conclusion" Lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles with HER-2 antibody and HIFU can effectively deliver lapatinib to SK-BR-3 cells， effectively inhibit the growth of SK-BR-3 cells， and promote their apoptosis. Lapatinib-loaded targeted ultrasound microbubbles combined with HIFU ablation will provide a new and safe method for the treatment of breast cancer and its metastasis.

Key words：Ultrasonic microbubbles;High-intensity focused ultrasound;Rapatinib;Breast cancer

乳腺癌（breast cancer）是女性最為常見的惡性腫瘤，也是癌癥中導致女性死亡的首要病因[1]。隨著對乳腺癌研究的深入，有學者[2]在2011年就根據乳腺癌的分子病理學特征對其進行了全新的分型，其中雌激素受體（estrogen receptor， ER）和孕激素受體（progestrone receptor， PR）陰性，人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2， HER-2）陽性的HER-2型轉移最為常見。HER-2分子是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。HER-2原癌基因通過調節PI3K-Akt通路、Ras-Raf-Mek-MAPK通路等使細胞增殖周期縮短及抗凋亡，從而增加腫瘤惡性程度。HER-2還能與腫瘤細胞內的環氧合酶COX-2基因的啟動子結合，上調COX-2的表達，從而促進腫瘤的生長與增殖[3]。此外，HER-2過表達還可抑制細胞黏附蛋白的合成，從而更有利于腫瘤細胞的遷徙[4，5]。目前，針對HER-2蛋白為靶點的抗腫瘤藥物已經應用于臨床。其中，拉帕替尼是一種新型HER-2受體阻斷藥，是能夠可逆性阻斷表皮生長因子和酪氨酸激酶雙受體的阻斷劑[6]。同時，拉帕替尼具有可口服、易進入細胞內發揮藥理作用，同時拮抗EGFR和HER-2兩種受體的信號通路、易透過血腦屏障治療乳腺癌腦轉移的獨特優勢。另外，拉帕替尼對曲諾珠單抗治療失敗的進展期資料患者依然有效[7]。近年來，超聲靶向微泡破裂技術在分子生物學領域迅速發展，其原理主要是體外藥物與微泡結合，然后通過超聲介導在靶細胞或組織中，由微泡靶向傳輸藥物，超聲波的空化效應可以導致組織細胞膜通透性增高，而微泡又能降低超聲波的空化閾值，從而增強空化效應，使局部毛細血管破裂，鄰近織細胞間隙增寬，從而藥物更容易進入組織細胞內而提高局部組織及細胞，達到靶向治療疾病的目的[8-11]。目前，超聲靶向微泡破裂技術在肺癌、腎癌、前列腺癌及胃癌等[12-15]實驗中均表現出安全和高靶向治療的優點。近年來，應用微泡造影劑對乳腺癌進行靶向治療成為超聲分子影像學研究的重點領域，在早期腫瘤檢測和治療中具有良好的應用前景[16]。本實驗旨在研究一種高效載拉帕替尼藥物遞送系統，使其能在HER-2型乳腺癌局部富集、釋放，從而達到靶向及抑制腫瘤細胞生長的效果。

1材料與方法

1.1主要試劑

二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、全氟丙烷（C3F8）、聚乙二醇-4000（PEG）、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（DSPE-PEG2000-COOH）、綠色熒光生物素化二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（DSPE-PEG2000-COOH-Biotin）、親和素、氯仿、甘油；人乳腺癌SK-BR-3細胞。

1.2實驗儀器

精密移液器、普通光學顯微鏡（OlympusCKX41，加拿大）、透射電鏡（S3400N，日本）、激光粒徑分析系統（Zeta SIZER，Malvern，美國）、紫外分光光度儀（Thermo NanoDrop 2000）、超聲基因轉染儀（UTG 1025，中國）、恒溫震蕩儀、流式細胞儀、細胞培養箱等。

1.3攜帶HER-2抗體載拉帕替尼新型靶向納米超聲微泡的制備

采用機械振蕩法空白超聲微泡，DSPC、DPPE、PEG4000、DSPE-PEG2000-COOH按15∶5∶6.3∶2.2的體積比加入氯仿中，60 ℃磁力攪拌2 h，然后真空凍干；加入溶媒液（由50%葡萄糖、丙二醇、甘油和精蛋白按體積比為7.3∶0.9∶0.9∶0.9組成），室溫120 r/min攪拌3 h，充入C3F8，超聲處理（100 W，30 s）即得。制備的空白微泡經鈷-60射線輻照消毒后，加入不同質量（分別為5、10、20、50、100 mg）的拉帕替尼，各組置于搖床在室溫下低速震蕩、共孵育30 min，獲得載拉帕替尼超聲微泡。將原料中的DSPE-PEG2000-COOH替換成DSPE-PEG2000-COOH-Biotin，余操作過程相同，制得綠色熒光生物素化載拉帕替尼超聲微泡。制備的綠色熒光生物素化超聲微泡經過量親和素、生物素化HER-2抗體反應處理后制得生物素化攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡。

1.4攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡理化性質檢測

采用光學顯微鏡及掃描電鏡觀察攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡表觀形態，采用激光粒徑分析系統檢測超聲微泡的粒徑大小及Zeta電位。

1.5攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡包封率檢測及量效關系

采用高效液相色譜法測定超聲微泡的包封率，繪制標準曲線。

1.6體外超聲輻照下攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡藥物釋放

制備無菌透析袋，10 cm/個；10 mg攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡溶于5 ml無菌雙蒸水，裝入無菌透析袋后封閉（無菌條件下完成）；體外超聲輻照處理（1.5 W），輻照60 s；將以上超聲處理過的透析袋放入裝有100 ml無菌雙蒸水的燒杯中；將以上燒杯置入恒溫震蕩儀（37 ℃）以125 rpm進行勻速震蕩；分別于3、6、9、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h等時間點從燒杯中取1 ml溶液測定拉帕替尼含量，計算拉帕替尼含量及累積釋放率，繪制時間-藥物累積釋放率曲線。

1.7攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡外超聲顯像

將不同濃度的攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡（100、50、25 mg/ml）以及空白超聲微泡（100 mg/ml）分別裝入預制的1%瓊脂糖凝膠孔洞模具，采用彩超診斷儀進行掃描觀察（MI=0.6），成像后應用DFY超聲圖像分析儀分析各種微泡回聲強度，比較各組間的平均超聲強度（Mean DB）。

1.8新型靶向納米超聲微泡聯合高強度聚焦超聲（HIFU）對乳腺癌SK-BR-3細胞作用的體外細胞實驗

1.8.1乳腺癌SK-BR-3細胞培養

購買的乳腺癌SK-BR-3細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養，當細胞融合率達到70%～80%時用0.125%消化傳代，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養。

1.8.2超聲微泡細胞尋靶實驗

將6孔板以1×105/孔細胞濃度進行細胞爬片，過夜后加入1×107/孔不同類型超聲微泡（A組：綠色熒光生物素化攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡；B組：綠色熒光生物素化單純載拉帕替尼超聲微泡；C組：綠色熒光生物素化攜HER-2抗體空白超聲微泡；D組：空白超聲微泡）。整個過程避光操作，細胞培養箱孵育6 h，用4%多聚甲醛固定，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8.3超聲微泡聯合HIFU處理細胞

實驗分4組，分別是：A組：HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡；B組：單純載拉帕替尼超聲微泡+HER-2抗體；C組：攜HER-2抗體空白超聲微泡；D組：空白超聲微泡。取對數生長期的細胞，以1×105個/孔細胞6孔板常規接種，各組設3個復孔；置于CO2孵箱培養24 h后棄上清，PBS洗3遍；按實驗分組各組加入相應的超聲造影劑100 μl（25 mg/ml）后繼續培養2 h；加入PBS洗去各孔中的超聲造影劑，室溫搖床洗滌次，5 min/次；2～3組給予HIFU輻照（聲強 0.5 W/cm2，輻照時間5 s）；各組加入新鮮培養基繼續培養24 h后收集細胞進行檢測。

1.8.4流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期

收集上述各組處理過的細胞，PBS洗滌3次，取1×104個細胞重懸，加入Annexin V-PE、7-AAD進行標記后用FACS Calibur流式細胞儀上機檢測。

1.8.5 CCK-8檢測細胞增殖

將上述各組處理過的細胞按1×104/孔接種于96孔板，每孔加入100 μl培養基，各組設3個復孔；于1、6、12、24、48、72 h各時間點加入10 μl CCK-8溶液，繼續孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.8.6 Western blot蛋白檢測

主要檢測各組經處理后細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和侵襲相關蛋白MMP-2的表達。

1.9統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料用（x±s）表示。單因素方差分析多組計量資料差異，兩組計量資料采用獨立樣本t檢驗，多變量方差分析重復測量數據。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡的一般性質

本實驗制備的載拉帕替尼靶向超聲微泡在普通光學顯微鏡及掃描電鏡下觀察，微泡分散度良好，呈球形，形態較均勻，大小較一致（圖1、圖2）。經激光粒徑分析系統檢測，載拉帕替尼靶向超聲微泡的平均粒徑為（204.80±116.30）nm（圖3），Zeta電位為（-5.42±4.11）mV（圖4）。在采用不同投放總量拉帕替尼的情況下，當拉帕替尼投放量為300 mg時，拉帕替尼包封率達到最高，為（35.20±1.58）%（圖5）。

2.2攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡體外藥物釋放實驗

從拉帕替尼累計釋放曲線可以看出（圖6），經超聲輻照后12 h載拉帕替尼靶向超聲微泡拉帕替尼累計釋放率達到55.7%，輻照24 h后拉帕替尼累計釋放率達到62.8%。體外藥物釋放實驗結果說明，本實驗制備的載拉帕替尼靶向超聲微泡具有良好的藥物緩釋功能。

2.3攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡體外超聲顯像

本部分實驗檢測了載拉帕替尼靶向超聲微泡在不同濃度的超聲成像強度。如圖7所示，載拉帕替尼靶向超聲微泡呈中高回聲強度信號；與同濃度的空白超聲微泡，載拉帕替尼靶向超聲微泡的回聲強度并沒有明顯差異（P＞0.05）。另外，制備的載拉帕替尼靶向超聲微泡性質結構穩定，在制備完成后72 h內其回聲強度沒有明顯差異（P＞0.05）。

2.4攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡體外細胞尋靶實驗

如圖8所示，A組可見大量綠色熒光聚集在SK-BR-3細胞內及其周圍，B組可見少量綠色熒光聚集在SK-BR-3細胞周圍，C、D組無明顯綠色熒光聚集。體外細胞尋靶實驗結果顯示本實驗制備的攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡具有良好的尋靶能力。

2.5流式細胞檢測經攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡聯合HIFU處理后SK-BR-3細胞凋亡

經攜帶HER-2抗體載拉帕替尼靶向超聲微泡聯合HIFU處理后與其他對照組比較，A組SK-BR-3細胞明顯減少（P＜0.05），見圖9，流式細胞分析結果表明攜HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡聯合HIFU作用可以有效地促進SK-BR-3細胞凋亡。

2.6 CCK-8檢測SK-BR-3細胞增殖

經攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡聯合HIFU處理后與其他對照組比較，A組SK-BR-3細胞增殖活力顯著降低（P＜0.05），見圖10，結果表明攜HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡聯合HIFU作用可以有效地抑制SK-BR-3細胞增殖。

2.7凋亡相關蛋白檢測

采用Western blot方法檢測各組經處理后細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和侵襲相關蛋白MMP-2的表達。經攜帶HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡聯合HIFU處理，A組Bcl-2表達較其他三組升高（P＜0.05），見圖11；同時MMP-2表達較其他三組降低（P＜0.05），見圖12。

3討論

乳腺癌及其轉移腫瘤因發病率高、致殘率高，以及由此而產生的高額治療費用，已成為醫學領域一大治療難題。HER-2型乳腺癌的基礎研究及臨床試驗均已證明[17]，表達HER-2可以促進乳腺癌細胞的轉移和侵襲，是骨轉移發生率最高的一個亞型。拉帕替尼作為新型乳腺癌抗癌藥，有易透過血腦屏障、降低乳腺癌中樞神經系統轉移風險等優勢[18]。在曲諾珠單抗一線治療失敗后，加用拉帕替尼能顯著延長HER-2陽性轉移性乳腺癌患者的中位生存期，且不良反應可控，也是乳腺癌轉移患者治療的選擇之一[19]。目前已有文獻報道[20]，HIFU能增強乳腺癌化療敏感性。因此，研發一種高效載拉帕替尼藥物遞送系統，使其能在HER-2型乳腺癌及其轉移腫瘤局部富集、釋放，從而達到靶向及高效的治療效果，是本研究目的所在。

臨床抗腫瘤藥物需穿過血管內皮屏障、腫瘤組織間隙和腫瘤細胞膜進入腫瘤細胞才能發揮相應的治療效果。近年來，隨著超聲造影劑研制工藝的進展和超聲影像技術在醫學領域的廣泛使用，超聲靶向微泡破裂技術在腫瘤治療學領域發展迅速。它可以通過增加血管及細胞膜通透性，幫助多種藥物或基因進入細胞，提高細胞內的藥物或基因濃度。超聲微泡造影劑是一種新型藥物或基因載體，超聲靶向微泡破裂技術可以使其攜帶的藥物或基因定位釋放，從而達到靶向及高效的治療效果。

本實驗研究中制備了一種高效靶向載拉帕替尼藥物遞送系統，同時聯合HIFU消融作用，探討其對人乳腺癌SK-BR-3細胞的生物學作用。通過體外細胞尋靶實驗結果證實攜HER-2抗體載拉帕替尼新型靶向納米超聲微泡聯合HIFU作用與SK-BR-3細胞的結合能力高于其他三組（P＜0.05）。通過流式細胞技術檢測結果證實攜HER-2抗體載拉帕替尼新型靶向超聲微泡聯合HIFU作用能有效促進SK-BR-3細胞凋亡。通過CCK-8實驗結果證實攜HER-2抗體載拉帕替尼新型靶向超聲微泡聯合HIFU作用能明顯抑制SK-BR-3細胞增殖。伊萬萍等[20]學者前期報道了HIFU能增強乳腺癌化療敏感性。本試驗研究也證實了HIFU消融能有效促進SK-BR-3細胞凋亡并抑制其增殖。同時，通過HIFU的消融作用，能有效將拉帕替尼遞送至腫瘤細胞內，充分證實了該載拉帕替尼超聲微泡體外的高靶向性，為乳腺癌臨床靶向治療提供了依據。目前已知超聲微泡與藥物的結合的方式主要是靜電吸附在微泡外殼，但其在血液循環中極不穩定，且藥物容易脫落，藥物遞送效率略低[21]。文獻報道[21，22]通過生物素-親和素法制備的超聲微泡可以提高靶向區域的藥物濃度，延緩藥物釋放、減少給藥次數，從而增強治療效果。本試驗采用生物素-親和素法制備的HER-2抗體制備攜HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡，與傳統的超聲微泡相比，具有較高的載藥率和包封率，同時HER-2抗體更有利于識別HER-2受體，增加拉帕替尼的富集，從而更具有靶向性。

本實驗研究還存在以下局限性：①僅采用進行體外細胞實驗，但未進行體內相關動物模型實驗研究。因此，在后期的實驗中，需要進一步建立乳腺癌動物實驗模型，研究體內生物學效應。②在本研究中HIFU照射時間短且能量有限，需要在今后的實驗中進一步研究及優化HIFU輻照參數，以提高藥物遞送效果。

綜上所述，攜HER-2抗體載拉帕替尼超聲微泡聯合HIFU消融作用能有效地將拉帕替尼遞送入SK-BR-3細胞，并能有效抑制SK-BR-3細胞的生長，促進其凋亡。以載拉帕替尼陽離子超聲微泡為基礎的HIFU消融治療在治療乳腺癌及其轉移方面有廣闊的應用前景，是乳腺癌及其轉移治療的一種安全的方法。

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收稿日期：2023-07-23；修回日期：2023-08-10

編輯/肖婷婷