貝-魚-草生產型濕地沉積物中細菌群落結構特征分析

摘要 ［目的］研究“貝-魚-草”生產型濕地處理養殖尾水工藝中的細菌群落結構變化特征。［方法］采用Illumina-MiSeq高通量測序技術對濕地不同單元沉積物中的細菌群落結構進行分析。［結果］幼貝高效凈化單元和高密度貝類凈化單元中的多樣性和菌群豐度明顯高于其他處理單元。在門水平分類單元上，濕地沉積物中的優勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）。冗余分析發現各單元沉積物中的TP含量是影響細菌群落結構的主要環境因子。［結論］濕地中投放的貝類可以減少沉積物中的氮磷營養鹽，并且通過貝類的生物擾動作用可以提高沉積物中細菌群落的多樣性和豐富度，研究結果為“貝-魚-草”生產型濕地處理養殖尾水提供了科學依據。

關鍵詞 養殖尾水；貝-魚-草生產型濕地；細菌群落結構；生物擾動作用

中圖分類號 Q938 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）14-0058-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.14.012

Characterization of Bacterial Community Structure in Sediments of Shellfish-fish-grass Productive Wetlands

GAO Na1，ZHAN Ming-fei2，ZHANG Huan2 et al

（1.Fisheries Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Freshwater Aquaculture and Enhancement of Anhui Province，Hefei，Anhui 230000;2.Anhui Shuiyun Environmental Protection Co.，Ltd.，Wuhu，Anhui 241000）

Abstract ［Objective］To study the bacterial community structure in sediments of “shellfish-fish-grass” productive wetlands.［Method］ The Illumina-MiSeq high-throughput sequencing technology was used to analyze the bacterial community structure in sediments of different units.［Result］ The diversity and richness of the bacterial community were significantly higher in the unit composed of juvenile shellfish and high-density shellfish purification unit than in the other treatment units.Proteobacteria，Chloroflexi，Acidobacteriota，Actinobacteriota and Bacteroidota were the dominant phylum of the bacterial community in the sediments.Redundancy analysis showed that the main driving factors of the change of bacterial community was the total phosphorus.［Conclusion］ The shellfish placed in the wetland can reduce the nitrogen and phosphorus content in the sediment，and the diversity and richness of the bacterial community in the sediment can be improved through the bioturbation of the shellfish，and the results of this study provide a scientific basis for the treatment of aquaculture tailwater in the “shellfish-fish-grass” productive wetlands.

Key words Aquaculture tail water;Shellfish-fish-grass productive wetlands;Bacterial community structure;Bioturbation

基金項目 安徽省重點研究與開發計劃項目（2022107020008）；安徽省農業科學院青年英才計劃項目（QNYC-202108）；國家現代農業產業技術體系專項（CARS-46）; 安徽省現代農業產業技術體系建設專項（皖農科函〔2021〕711號）。

作者簡介 高娜（1989—），女，安徽阜陽人，助理研究員，博士，從事分子微生物學與生物技術研究。*通信作者，副研究員，碩士，從事養殖尾水治理研究。

收稿日期 2023-09-11

水產養殖是全球糧食安全和可持續發展的關鍵部分，目前，水產養殖魚類產量占全球魚類總產量的50%以上，預計在未來10年中這一比例將超過60%［1］。然而高密度的養殖伴隨而來的水資源的過度使用、養殖排污、飼料浪費、成本增加等問題［2-4］，使得當下水產養殖業面臨量質提升和綠色發展的雙重挑戰。

2019 年初，十部委共同提出《關于加快推進水產養殖業綠色發展的意見》，其中重點強調了改善養殖環境，推進養殖尾水治理。雖然目前常用的穩定塘和人工濕地等工藝能在一定程度上滿足養殖尾水的處理要求，但穩定塘凈化系統存在需要較長的水力停留時間以及處理效果受天氣制約等缺陷［5］。人工濕地采用土建結構，占地面積大，構建和拆除的過程比較麻煩，且易受季節的影響，處理效率不高［6］。因此，在原有技術基礎上迫切需要高效的養殖尾水深度處理技術。

安徽水韻環保股份有限公司發明的“貝-魚-草”異位高效處理技術是一種以淡水貝類為核心的水質凈化技術，它不同于傳統的人工濕地凈化技術，屬于改進型人工濕地凈化系統，其污染物削減負荷高于傳統人工濕地。濕地中的貝類通過其濾水作用，吸收水體中的微藻和懸浮有機顆粒，還可通過生物擾動作用改變沉積物/水界面的物質交換，進而改變水生態系統環境。

在濕地生態系統中，沉積物是微生物和濕地系統中營養物質循環交換的載體。微生物是自然界物質循環的主要驅動力，在全球碳、氮、硫及其他各種元素的生物地球化學循環過程中起到了關鍵作用［7］。該研究擬利用高通量測序技術研究濕地表層沉積物中細菌群落組成及分布特征，探討在不同處理單元中沉積物細菌群落對沉積環境變化的響應，以期為“貝-魚-草”生產型濕地工藝高效處理養殖尾水提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

該研究采用的工藝流程如圖1所示，“貝-魚-草”生產型濕地占地5 hm2。設計日處理水量為15 000 m3/d，收集周邊連片20 hm2的青蝦養殖尾水。該工藝模式包括依次連接的“幼貝高效凈化單元、魚菌藻凈化單元、營養轉化塘1、低密度貝類凈化單元、營養轉化塘2、高密度貝類凈化單元、水下森林”等處理單元。各單元的配置如圖1所示。

1.2 沉積物的采集及理化因子分析

2023年4月中旬，分別從幼貝高效凈化單元、魚菌藻凈化單元、營養轉化塘1、低密度貝類凈化單元、營養轉化塘2、高密度貝類凈化單元采集沉積物樣品，命名為S1、S2、S3、S4、S5、S6，每組樣品設置3個重復。采集的樣品分成2份，一份用于沉積物理化因子測定，一份用于高通量測序分析。沉積物樣品自然風干后，參照相關文獻［8］進行pH、有機質（OM）、總氮（TN）和總磷（TP）的分析。

1.3 DNA提取及高通量測序

采用FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，USA）試劑盒進行沉積物總DNA的提取。使用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4高變區。測序得到的原始序列通過拼接、過濾去除非特異性擴增序列及嵌合體后得到有效序列。利用QIIEME軟件將相似度>97%的序列定義為一個操作分類單元（OTU），采用RDP classifier對OTU進行物種分類。

1.4 數據分析

使用測序公司提供的在線軟件包（Majorbio cloud，https：//cloud.majorbio.com/）進行相關數據分析。利用MOTHUR計算α多樣性。細菌群落柱狀圖用于比較所有樣本的細菌群落結構，樣本之間的相似性通過主坐標分析（PCoA）來衡量。使用Vegan進行環境因子與細菌群落的冗余分析（RDA）。

2 結果與分析

2.1 不同處理單元中沉積物的理化性質 從表1可以看出，沉積物理化性質指標TN、TP、OM的含量在生產型濕地處理系統中存在空間異質性。魚菌藻凈化單元（S2）沉積物中的TN、TP含量最高，幼貝高效凈化單元（S1）沉積物中的TN、TP、OM含量最低。魚菌藻凈化單元中可能由于水生植物殘餌及草魚產生的糞便沉積導致較高濃度的氮磷。與李乾崗等［9］的研究一致，在幼貝高效凈化單元中，幼貝的生物擾動作用使得沉積物中相當一部分氮磷釋放到了上覆水中，還有一部分氮、磷可能通過貝類自身的吸附作用以及微生物活動從系統中去除。在其他貝類凈化單元中，多采用懸浮式貝床系統投放貝類，減少了貝類對沉積物的擾動作用影響。

2.2 細菌群落的多樣性與空間分布

在18個沉積物樣品中，Illumina MiSeq測序共獲得432 630條有效序列，對相似性>97%的序列進行分析，產生的OTU數量見表2。測序的覆蓋率大于0.940，在測序條數達到24 000條以上時，Sobs稀釋曲線基本趨向平坦（圖2），但均未達到飽和，表明測序數據合理，基本能夠覆蓋樣品中的大部分細菌，可能是由于沉積物中環境復雜，其中的物種多樣性較高，存在一些未被測序檢測到的物種。表2列出了樣品的α多樣性指數，其中Chao 1指數越大，代表物種種數越多，豐富度越高；Shannon指數越大，說明群落多樣性越高。從表2可以看出，幼貝高效凈化單元（S1）和高密度貝類凈化單元（S6）中的多樣性和菌群豐度明顯高于其他處理單元，表明貝類的生物擾動作用可能會提高沉積物細菌群落的豐富度和多樣性。Papaspyrou等［10］研究發現，2種活動能力不同的沙蠶可以使得其洞穴中

的細菌多樣性較周邊底泥分別高出1.8和2.3倍。沈輝［11］

研究也發現文蛤和沙蠶擾動組沉積物中的細菌序列數、微生物多樣性指數 Chao 1和 Shannon指數均高于空白對照組。營養轉化塘的菌群豐度和多樣性均較低，可能是由于每周投加的菌藻占據了優勢地位，限制了其他微生物的生長。

2.3 細菌群落組成特征

濕地不同單元沉積物中共檢測到59個細菌門，所有檢測到的細菌門的相對豐度（相對豐度>0.01）如圖3所示，沉積物中的優勢細菌門分別為變形菌門（Proteobacteria，23.71%）、綠彎菌門（Chloroflexi，14.34%）、酸桿菌門（Acidobacteriota，12.76%）、放線菌門（Actinobacteriota，9.3%）、擬桿菌門（Bacteroidota，6.86%），這與不同河流湖泊的沉積物微生物群落組成類型相似［12-13］。變形菌門是濕地中相對豐度最高的優勢細菌門，其作為細菌中的主要部分，普遍存在于水環境沉積物中，在眾多人工濕地廢水處理工藝中發揮主導作用［13］。由圖3還可發現，綠彎菌門的相對豐度也較高，為第二大類群，在濕地不同單元沉積物樣品（S1～S6）中所占比例依次為17.82%、14.92%、24.44%、12.33%、4.61%、11.91%，綠彎菌門在包括沉積物、溫泉、產甲烷厭氧污泥消化池等厭氧棲息地中廣泛存在，是沉積物中氮循環的重要參與者［14］，與擬桿菌門類群中的微生物參與一系列有機化合物的降解［15］。酸桿菌門最初是在酸性沉積物環境中被發現并命名的，但近年來有研究發現，不只是在酸性環境中，有些中性甚至堿性環境中也能檢測出一些酸桿菌的基因序列［16］，這與該試驗結果相同，表1顯示濕地不同單元沉積物的pH呈中性至弱堿性，酸桿菌門在不同單元的沉積物中也占據優勢地位。

為了進一步對細菌群落物種組成差異進行分析，探討不同處理單元間群落細菌組成的相似性或差異性，基于 Bray-Curtis 距離算法，采用主坐標分析法研究不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。如圖4所示，第一主軸（PC1）和第二主軸（PC2）的貢獻率分別為41.94%和28.90%，累計貢獻率達70.84%，濕地不同單元沉積物中細菌群落差異顯著（R=0.928 4，P=0.001），每個取樣點的 3 個重復樣本的聚集性較好，顯示出較好的重復性。營養轉化塘2的樣本單獨聚為一簇，魚菌藻凈化單元、低密度貝類凈化單元和高密度貝類凈化單元沉積物中細菌群落組成較相近。

2.4 環境因素對不同單元沉積物細菌群落組成的影響

為了消除環境因子之間的強共線性，利用方差膨脹因子分析去除沉積物總氮環境因子，保留共線性小的環境因子用于后續分析。為了探討環境因素對細菌豐度和群落組成的影響，對物種群落數據進行去趨勢對應分析（Detrended correspondence analysis，DCA），結果發現（表3），Lengths of gradient的最大數值小于3，此時適合選用線性模型中的冗余分析（RDA）來探討細菌群落與環境因子之間的相關性。

對門水平細菌群落豐度與環境因子進行RDA分析，如圖5所示，紅色箭頭表示數量型環境因子，環境因子箭頭的長短可以代表環境因子對物種數據的影響程度。在環境因子中，TP對細菌群落結構的影響達到顯著水平（r2=0.332，P=0.046），這與徐少奇等［17］的研究結果一致，在豬場廢水表面流人工濕地處理系統中，TP也是影響濕地底泥細菌群落的關鍵環境因子。為進一步研究細菌群落與環境因子的相關性，對相對豐度前10的門水平細菌群落OTU與環境因子進行Pearson相關性分析，并對物種和環境因子層級分別求均值進行聚類分析，繪制門水平上物種與環境因子相關性分析熱圖（圖6）。結果表明（圖6），不同菌群受環境因子影響不同，Actinobacteriota、 Proteobacteria、Bacteroidota、Desulfobacterota和Firmicutes與TP、OM呈負相關，說明這些菌株能在氮磷元素的去除中發揮作用。

3 結論

該研究在養殖尾水的“貝-魚-草”生產型濕地處理工藝中，采用高通量測序技術對濕地各處理單元沉積物中的細菌群落結構進行了分析，得出以下結論：

（1）各處理單元中魚菌藻凈化單元沉積物中的TN、TP含量最高，幼貝高效凈化單元沉積物中的TN、TP、OM含量最低。

（2）在該生產型濕地中，通過對細菌群落多樣性分析發現，幼貝高效凈化單元和高密度貝類凈化單元中的多樣性和

菌群豐度明顯高于其他處理單元，表明貝類的生物擾動作用可能會提高沉積物細菌群落的豐富度和多樣性。

（3）魚菌藻凈化單元、低密度貝類凈化單元和高密度貝

類凈化單元沉積物中細菌群落組成較相近。各單元沉積物中細菌相對豐度較高的門類均為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）。

（4）冗余分析發現各單元沉積物中的TP含量是影響細菌群落結構的主要環境因子。

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