鳶尾素調節JAK2/STAT3信號通路對牙周炎大鼠牙周組織損傷的影響

[摘要]目的：探討鳶尾素調節Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus protein tyrosine kinase 2，JAK2）/信號轉導和轉錄激活子3（Signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信號通路對牙周炎大鼠牙周組織損傷的影響。方法：通過結扎和接種牙齦卟啉單胞菌液建立牙周炎大鼠模型，將大鼠隨機分為模型組、鳶尾素低（鳶尾素-L，50 mg/kg）、中（鳶尾素-M，100 mg/kg）、高劑量（鳶尾素-H，200 mg/kg）組、鳶尾素-H+激活劑（200 mg/kg鳶尾素+2 mg/kg香豆霉素）組，每組10只，并以注射等體積生理鹽水的正常大鼠對照組。干預結束后，對大鼠牙齦出血指數、牙齒松動度評分；牙槽骨吸收、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（Interleukin，IL）-6、IL-1β以及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）水平分別以Micro-CT試劑盒檢測；HE檢測牙周組織病理學變化；Western blot檢測JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達。結果：與對照組相比，模型組大鼠牙周組織被破壞，炎性浸潤嚴重，牙齦出血指數、牙齒松動度評分、牙槽骨吸收、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達顯著增加，SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，不同劑量的鳶尾素組大鼠病理損傷得到改善，牙齦出血指數、牙齒松動度評分、牙槽骨吸收、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達顯著降低，SOD水平顯著增加，具有劑量依賴性（P＜0.05）；與鳶尾素-H組相比，鳶尾素-H組+激活劑組大鼠病理損傷加重，大鼠牙齦出血指數、牙齒松動度評分、牙槽骨吸收、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達顯著增加，SOD水平顯著降低（P＜0.05）。結論：鳶尾素抑制牙周炎大鼠氧化應激、炎性反應，減輕大鼠牙周組織損傷，減少牙槽骨吸收，可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關。

[關鍵詞]鳶尾素；Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導和轉錄激活子3；牙周炎；牙周組織損傷；炎癥反應；氧化應激

[中圖分類號]R743.3 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2024）08-0022-05

Effect of Irisin on Periodontal Tissue Damage in Rats with Periodontitis by Regulating the JAK2/STAT3 Signaling Pathway

TIAN Mengting， ZHAO Jingyao， LIU Jing

[ Department of Dental Prosthetics and Implantation， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University （ Affiliated Stomatological Hospital ） /Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Stomatology， Urumqi 830000， Xinjiang， China]

Abstract： Objective To investigate the effect of Irisin on periodontal tissue damage in rats with periodontitis by regulating the Janus protein tyrosine kinase 2 （JAK2）/signal transduction and activator of transcription 3 （STAT3） signaling pathway. Methods A rat model of periodontitis was established by ligation and inoculation of Porphyromonas gingivalis solution. The rats were randomly sepan61fiOsL2iFVbGtkuX+xzQ==rated into a model group， a low （50 mg/kg irisin L）， a medium （100 mg/kg irisin M）， a high-dose （200 mg/kg irisin H） groups， and a irisin H+activator group （200 mg/kg irisin+2 mg/kg coumermycin）， with 10 rats in each group. Normal rats were injected with an equal volume of physiological saline as the control group. After the intervention， the gingival bleeding index and tooth mobility score of the rats were evaluated; the alveolar bone resorption， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， IL-1β， malondialdehyde （MDA）， and superoxide dismutase （SOD） levels were detected using the Micro-CT kit. HE was applied to detect pathological changes in periodontal tissue. Western blot was applied to detect the expression of JAK2， STAT3， p-JAK2， and p-STAT3 proteins. Results Compared with the control group， the periodontal tissue of rats in the model group was damaged and inflammatory infiltration was severe， the gingival bleeding index， tooth mobility score， alveolar bone resorption， TNF-α， IL-6， IL-1β， MDA levels， p-JAK2/JAK2， p-STAT3/STAT3 expression were obviously increased， the SOD level was obviously decreased （P＜0.05）. Compared with the model group， the pathological damage in rats treated with different doses of Irisin was improved， the gingival bleeding index， tooth mobility score， alveolar bone resorption， TNF-α， IL-6， IL-1β， MDA levels， p-JAK2/JAK2， p-STAT3/STAT3 expression were obviously decreased， the SOD level was obviously increased， in a dose dependent manner （P＜0.05）. Compared with the Irisin H group， the pathological damage in the Irisin H+activator group worsened， the gingival bleeding index， tooth mobility score， alveolar bone resorption， TNF-α， IL-6， IL-1β， MDA levels， p-JAK2/JAK2， p-STAT3/STAT3 expression were obviously increased， the SOD level was obviously decreased （P＜0.05）. Conclusion Irisin inhibits oxidative stress and inflammatory response in periodontitis rats， alleviates periodontal tissue damage and reduces alveolar bone resorption， which may be related to inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathway.

Key words： Irisin; Janus protein tyrosine kinase 2/signal transduction and transcriptional activator 3; periodontitis; periodontal tissue damage; inflammatory response; oxidative stress

牙周炎是一種進行性炎癥性牙周疾病，其特征在于牙周組織破壞、牙槽骨吸收和牙齒缺失[1]。牙周炎是一種非常普遍的疾病，但會導致全身性炎癥，增加多種疾病的患病風險，是一個需要盡快解決的公共衛生問題[2]。鳶尾素是一種由骨骼肌分泌的肌因子，參與成骨細胞增殖、脂質體內平衡、骨生成和肌肉生長，還作為全身許多炎癥途徑的介質，參與疾病發展[3]。Huang X等[4]研究提出鳶尾素可以促進牙周牙髓干細胞的成骨/成牙骨質分化，為牙齦卟啉單胞菌破壞的牙周硬組織的再生提供了方向，但其機制尚未明確。Janus蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）/信號轉導和轉錄激活子3（STAT3）信號在促進成骨細胞增殖和分化中起著至關重要的作用[5]。在牙周炎研究中[6]，抑制JAK2/STAT3軸的激活可阻止成骨分化促進牙槽骨吸收，緩解牙周炎并重建骨穩態。IL-6是通過激活JAK2/STAT3信號通路介導脂多糖對鳶尾素的分泌減少，提示鳶尾素與JAK2/STAT3信號通路存在一定關系[7]。但鳶尾素對牙周炎的影響是否與JAK2/STAT3信號通路有關尚不清楚，因此本驗證旨在探討鳶尾素對牙周炎大鼠牙周組織損傷及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑與儀器：TNF-α、IL-6、IL-1β試劑盒購自安迪生物科技（上海）有限公司；鳶尾素購自美國Biovisiona公司；JAK2/STAT3信號通路激活劑-香豆霉素購自BIOMOL公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3一抗購自Abcam公司。Nikon Eclipse 80i光學顯微鏡購自尼康公司；EM-UC6超薄型切片機購自德國徠卡公司；Micro-CT系統購自ScancoMedicalAG公司。

1.1.2 實驗動物：中山大學孫逸仙紀念醫院提供體重為200～230 g的Sprague-Dawley雄性大鼠，許可證號：SYXK（粵）2022-0289。大鼠被飼養在（23±3）℃、（55±15）%的濕度以及8：00-22：00的光照環境中，隨意進食和飲水，動物實驗遵循國家實驗動物護理和使用指南。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎大鼠模型的制備及干預：將適應性喂養的大鼠隨機選取10只進行注射生理鹽水，標記為對照組；其余50只大鼠進行用棉線結扎上頜第一磨牙牙齦下部，并于牙齦溝部位接種牙齦卟啉單胞菌液，連續接種1周，每天接種1次，之后取出棉線，當大鼠第一磨牙牙周袋形成，牙齦紅腫，牙槽骨吸收等現象，表明牙周炎大鼠造模成功[8]。造模成功的大鼠隨機分為模型組、鳶尾素低劑量（鳶尾素-L）、中劑量（鳶尾素-M）、高劑量（鳶尾素-H）組、鳶尾素-H+激活劑組，每組10只。其中不同劑量的鳶尾素干預組分別以50、100和200 mg/kg的劑量灌胃[9]；鳶尾素-H+激活劑組以200 mg/kg的劑量灌胃的同時，以2 mg/kg香豆霉素腹腔注射干預[10]；其余各組以等體積的生理鹽水干預，每天1次，連續干預4周。

1.2.2 牙齦出血指數與牙齒松動度評分：干預結束后，麻醉各組大鼠，肉眼觀察大鼠牙齒顏色，并對第一磨牙及牙周周圍進行拍照[11]；其中0分為牙齦正常；1分為輕度炎癥，探測時無出血；2分為中度炎癥、發紅、水腫和探診出血；3分為嚴重炎癥、存在潰瘍、水腫和嚴重出血。牙齒松動度評分：0分為無移動；1分為輕度活動（前庭-腭）；2分為中度活動度（前庭-腭，近中-遠中）；3分為重度松動（垂直，牙齒進出牙槽）。

1.2.3 Micro-CT測定牙槽骨吸收：評分結束后，各組隨機選取4只大鼠，經戊巴比妥鈉麻醉后處死，將頜骨組織浸泡在亞甲藍溶液中，隨后洗去多余染液，Micro-CT拍攝，軟件分別測定第一磨牙至第三磨牙牙槽嵴頂與釉牙骨質界的距離，標記為牙槽骨吸收值。多次測量取平均值。

1.2.4 ELISA檢測牙齦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平：麻醉各組剩余6只大鼠，將部分牙齦組織在冰上解凍，并在300μl裂解緩沖液中勻漿，然后補充蛋白酶抑制劑混合物。隨后將樣品在4℃下以14 000 r/min離心保持10 min，收集上清液試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.2.5 試劑盒檢測牙齦組織中MDA、SOD水平：取部分牙齦組織，按照試劑盒說明檢測MDA、SOD水平。

1.2.6 HE檢測牙周組織病理學變化：頜骨組織用10%中性福爾馬林緩沖液固定，然后用乙二胺四乙酸在4℃脫鈣2周。在乙醇中脫水后，將樣品包埋在石蠟中，并以5μm的厚度進行切片。切片用二甲苯脫蠟，用梯度乙醇進行再水合，并用蘇木精和曙紅染色。使用光學顯微鏡觀察組織變化。

1.2.7 Western blot檢測JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達：在含有苯甲基磺酰氟和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解牙周組織。定量后上樣，并進行電泳、轉模，將轉移的聚偏二氟乙烯膜在5%Tris緩沖鹽水的脫脂牛奶中封閉。然后將膜與JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3在4℃下孵育，次日將膜與二抗共孵育。使用增強化學發光試劑進行蛋白印跡，蛋白條帶灰度值進行定量蛋白表達。

1.3 統計學分析：采用SPSS 27.0軟件分析實驗數據，P＜0.05時，差異有統計學意義。計量資料以均數±標準差（xˉ±s）表示，單因素方差分析用于多組間比較，以snk-q檢驗進一步兩兩比較。

2 結果

2.1 鳶尾素對各組大鼠牙齦出血指數、牙齒松動度評分的影響：與對照組相比，模型組大鼠牙齦出血指數、牙齒松動度評分顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，不同劑量的鳶尾素組大鼠牙齦出血指數、牙齒松動度評分顯著降低，具有劑量依賴性（P＜0.05）；與鳶尾素-H組相比，鳶尾素-H組+激活劑組大鼠牙齦出血指數、牙齒松動度評分顯著增加（P＜0.05），見表1。

2.2 鳶尾素對各組大鼠牙槽骨吸收影響：與對照組相比，模型組大鼠牙槽骨吸收顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，不同劑量的鳶尾素組牙槽骨吸收顯著降低，具有劑量依賴性（P＜0.05）；與鳶尾素-H組相比，鳶尾素-H組+激活劑組牙槽骨吸收顯著增加（P＜0.05），見圖1、表2。

2.3 鳶尾素對各組大鼠牙周組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平：與對照組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，不同劑量的鳶尾素組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低，具有劑量依賴性（P＜0.05）；與鳶尾素-H組相比，鳶尾素-H組+激活劑組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著增加（P＜0.05），見表3。

2.4 鳶尾素對各組大鼠牙周組織中MDA、SOD水平：與對照組相比，模型組MDA水平顯著增加，SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，不同劑量的鳶尾素組MDA水平顯著降低，SOD水平顯著增加，具有劑量依賴性（P＜0.05）；與鳶尾素-H組相比，鳶尾素-H組+激活劑組MDA水平顯著增加，SOD水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

2.5 鳶尾素對各組大鼠牙周組織病理學的影響：對照組大鼠結締組織無顯著變化，牙槽骨無吸收；模型組牙周組織被破壞，結締組織中炎性浸潤嚴重，并伴隨牙槽骨吸收；鳶尾素-L組、鳶尾素-M組、鳶尾素-H組病理損傷得到改善，牙槽骨吸收減少，炎性浸潤降低；但鳶尾素-H+激活劑組病理損傷較鳶尾素-H組加重，見圖2。

2.6 鳶尾素對各組大鼠JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達影響：與對照組相比，模型組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，不同劑量的鳶尾素組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達顯著降，具有劑量依賴性（P＜0.05）；與鳶尾素-H組相比，鳶尾素-H組+激活劑組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達顯著增加（P＜0.05），見圖3、表5。

3 討論

牙周炎是世界范圍內最常見的口腔疾病之一，由牙周病原微生物感染和宿主免疫系統失調引起，我國牙周炎患病率高達80%[12]。此外牙周炎的發生與糖尿病、心血管疾病等疾病的發作、發展有關[13]，因此治療牙周炎的目前亟需解決的問題。

鳶尾素是一種新的激素樣肌動蛋白，具有調節凋亡、炎癥和氧化應激的獨特功能[6]。如在骨關節炎發展中[14]，鳶尾素抑制炎癥介導的氧化應激和細胞外基質的減少，保護軟骨組織。在牙周炎大鼠模型中[15]，鳶尾素可以減輕牙槽骨丟失和氧化應激，恢復炎癥刺激影響的牙周膜細胞的成骨和破骨能力。牙周炎作為常見的慢性炎癥性疾病，炎癥反應和氧化應激是其中主要的致病因素[16]。本研究結果發現牙周炎大鼠牙齦出血指數、牙齒松動度評分、牙槽骨吸收、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平增加，SOD水平降低，病理組織顯示牙周組織被破壞，炎性浸潤嚴重，與先前研究[17]相吻合。但經鳶尾素干預后，牙周炎大鼠病理損傷得到改善，牙槽骨吸收好轉，牙齦出血指數、牙齒松動度評分降低，氧化應激及炎性水平被抑制，表明鳶尾素可以抑制牙周炎大鼠氧化應激及炎性反應，改善大鼠牙周病變。

JAK2/STAT3參與炎癥反應、細胞生物學過程、氧化應激等途徑[18]。大量研究發現在牙周組織中存在JAK2和STAT3高表達[19]。在人慢性根尖周炎研究中[20]，JAK2、STAT3表達在根尖周肉芽腫組織及根尖周囊腫組織中均上調。在糞腸球菌誘導的根尖周炎大鼠中[21]，JAK2、STAT3表達隨著炎癥反應的增加而增加。牙周炎與根尖周炎均炎癥性骨破壞疾病，其機制相似，故推測JAK2/STAT3信號通路可能參與牙周炎的進展。結果發現，牙周炎大鼠牙周組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達增加，提示牙周炎的發生可能與激活JAK2/STAT3信號通路有關。經鳶尾素干預后，JAK2/STAT3信號通路被抑制，牙周炎大鼠牙周病變得到改善，推測鳶尾素可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路對牙周炎大鼠發揮抗炎、抗氧化作用。最后，實驗以JAK2/STAT3通路激活劑-香豆霉素進行反向驗證，結果發現香豆霉素逆轉了鳶尾素對牙周炎大鼠的保護作用，表明鳶尾素對牙周炎大鼠牙周組織損傷的改善作用是通過抑制JAK2/STAT3信號通路實現。

綜上所述，鳶尾素抑制牙周炎大鼠氧化應激、炎性反應，減輕大鼠牙周組織損傷，減少牙槽骨吸收，可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關，具體機制仍在進一步研究中。

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[收稿日期]2023-11-16

本文引用格式：田夢婷，趙景瑤，劉晶.鳶尾素調節JAK2/STAT3信號通路對牙周炎大鼠牙周組織損傷的影響[J].中國美容醫學，2024，33（8）：22-26.