5′-N-乙基酰胺基腺苷對心肌線粒體自噬和呼吸功能的影響

［摘要］" 目的： 探討選擇性腺苷A2受體激動劑5′-N-乙基酰胺基腺苷（5′-N-ethylcarboxamido adenosine，NECA）對心肌線粒體自噬和呼吸功能的影響及可能機制。方法： 培養大鼠心肌H9c2細胞，給予不同濃度NECA（10、100、1 000 nmol/L）處理2 h，對照組給予等體積PBS處理2 h。CCK-8法檢測細胞活性；蛋白質印跡實驗檢測線粒體自噬及相關因子的表達水平；運用線粒體膜電位探針四甲基羅丹明乙酯（TMRE）檢測線粒體膜電位；運用線粒體紅色熒光探針Mitotracker Red和溶酶體綠色熒光探針Lysotracker Green同時標記細胞，并用激光共聚焦掃描顯微鏡記錄線粒體和溶酶體的共定位情況；應用Oxygraph-2k高分辨率呼吸儀檢測細胞線粒體呼吸功能。結果： 與對照組相比，不同濃度NECA組細胞活力和線粒體膜電位均無顯著變化。蛋白質印跡實驗結果顯示，與對照組相比，10 nmol/L和100 nmol/L NECA處理組線粒體的線粒體外膜轉位酶20（TOM20）和內膜蛋白細胞色素C氧化酶Ⅳ亞型（COX Ⅳ）增高，1 000 nmol/L處理后，TOM20和COX Ⅳ較對照組無明顯差異；而NECA對線粒體內膜轉位酶23（TIM23）表達水平無顯著影響。與對照組相比，加入10 nmol/L NECA處理后線粒體自噬相關因子FUN14結構域包含蛋白1（FUNDC1）表達明顯增加，100、1 000 nmol/L NECA處理對FUNDC1表達無顯著影響；而NECA對同源性磷酸酶張力蛋白誘導激酶1（PINK1）和帕金森蛋白（Parkin）表達水平無明顯影響。共聚焦顯微鏡可見，與對照組相比，NECA處理組的溶酶體與線粒體共定位降低。Oxygraph-2k高分辨率呼吸儀檢測結果顯示，NECA處理組心肌H9c2細胞線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性與對照組相比無明顯變化。結論： NECA抑制心肌H9c2細胞線粒體自噬但對線粒體呼吸功能無影響。

［關鍵詞］" 5′-N-乙基甲酰胺基腺苷；線粒體自噬；線粒體呼吸功能；冠心病

［中圖分類號］" R542.2" ［文獻標志碼］" A" ［文章編號］" 1671-7783（2024）05-0388-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230292

［引用格式］王蘊琦，黃家康，王瑤，等. 5′-N-乙基酰胺基腺苷對心肌線粒體自噬和呼吸功能的影響［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（5）： 388-394.

［基金項目］中央引導地方科技發展資金項目（226Z7711G）；河北省引進留學人員資助項目（C20220354）；華北理工大學公共衛生學院青年人才托舉計劃（QNRC202313）

［作者簡介］王蘊琦（1996—），女，碩士研究生；徐菁蔓（通訊作者），副教授，博士，E-mail： xujm@ncst.edu.cn

Effects of 5′-N-ethylcarboxamido adenosine on myocardial mitophagy and

mitochondrial respiratory function

WANG Yunqi1， HUANG Jiakang1， WANG Yao1， TIAN Wei2，3，4， XU Jingman1，2，3

（1. School of Public Health， Norh China University of Science and Technology; 2. Hebei Coordinated Innovation Center of Occupational Health and Safety; 3. Hebei Key Laboratory of Organ Fibrosis; 4. Laboratory Animal Center， Norh China University of Science and Technology， Tangshan Hebei 063200， China）

［Abstract］" Objective： To investigate the effect and its possible mechanism of 5′-N-ethylcarboxamido adenosine （NECA）， a selective adenosine A2 receptor agonist， on myocardial mitophagy and mitochondrial respiratory function. Methods： Rat myocardial H9c2 cells were cultured and treated with different concentrations of NECA，while the control group was treated with equal volume PBS for 2 h. CCK-8 was used to test cell viability. The expression levels of mitophagy related proteins were detected by Western blotting. Mitochondrial membrane potential was measured by Tetramethyl rhodamine ethyl ester （TMRE） fluorescent probe. Mitochondrial red fluorescence probe Mitotracker Red and lysosome green fluorescence probe Lysotracker Green were used to label the cells simultaneously， and the co-localization of mitochondria and lysosome was recorded by laser confocal scanning microscope. The mitochondrial respiratory function was measured with Oxygraph-2k high resolution respiratory apparatus. Results： Comparing to the control group， NECA （10， 100 and 1 000 nmol/L） could not change both the cell viability and the mitochondrial membrane potential. Western blotting results showed that compared with the control group， translocase of the outer mitochondrial membrane 20 （TOM20） and inner membrane protein cytochrome C oxidase Ⅳ （COX Ⅳ） in the NECA （10， 100 nmol/L） group were increased， and there was no significant difference between TOM20 and COX Ⅳ after 1 000 nmol/L treatment. There was no significant change in the expression level of translocase of inner mitochondrial membrane 23 （TIM23）. Compared with the control group， the expression of mitophagy related factor FUN14 domain-containing protein 1 （FUNDC1） was significantly increased after the addition of NECA （10 nmol/L）， while 100 and 1 000 nmol/L NECA treatments had no significant effect on FUNDC1 expression. The expression levels of homologous phosphatase tensin induced kinase 1 （PINK1） and Parkinson′s protein （Parkin） were not changed markedly. Confocal results showed that compared with the control group， the co-localization of lysosome to mitochondrial was reduced in the NECA treatment group. The results of Oxygraph-2k high resolution respiratory apparatus showed that compared with the control group， the activity of mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ， Ⅱ and Ⅳ of myocardial H9c2 cells in the NECA treatment group had no significant change. Conclusion： NECA inhibited mitophagy but had no effect on mitochondrial respiratory function in cardiac H9c2 cells.

［Key words］" NECA; mitophagy; mitochondrial respiratory function; coronary heart disease

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心?。┦菄乐匚：θ祟惤】档囊活惣膊?。研究表明腺苷及其類似物可能是最具潛力的心臟保護藥物，其能夠減輕冠心病引起的心肌損傷［1］。多項實驗研究發現腺苷A2受體激動劑5′-N-乙基酰胺基腺苷（5′-N-ethylcarboxamido adenosine，NECA）能夠減輕再灌注誘發的心肌損傷［2-4］。心肌組織能量需求大，富含線粒體，線粒體穩態的維持對心肌細胞能量代謝和細胞凋亡調控都有重要的作用。維持線粒體數量和質量的動態平衡對細胞正常生命活動至關重要［5］。本課題組前期也證實NECA可激活線粒體Src酪氨酸激酶，促進呼吸鏈復合體Ⅰ的酪氨酸位點磷酸化，抑制其活性，減少活性氧的產生，同時增加抗氧化酶活性，促進活性氧的分解，進而減輕心肌氧化應激損傷［6］。然而，NECA對心肌線粒體結構和功能的影響仍未完全闡明。本研究主要探討NECA對心肌線粒體自噬和呼吸功能的影響及其可能機制，為完善NECA的心臟保護機制提供可靠的實驗依據。

1" 材料和方法

1.1" 儀器與試劑

多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Oxygraph-2k線粒體呼吸測定系統（奧地利OROBOROS公司）。

NECA以及線粒體呼吸功能測定相關試劑（美國Sigma公司）；線粒體外膜轉位酶20（translocase of the outer mitochondrial membrane 20，TOM20），線粒體內膜轉位酶23（translocase of inner mitochondrial membrane 23，TIM23），細胞色素C氧化酶Ⅳ亞型（cytochrome C oxidase Ⅳ，COX Ⅳ），β-tubulin抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；同源性磷酸酶張力蛋白誘導激酶1（homologous phosphatase tensin induced kinase 1，PINK1），帕金森蛋白（Parkin），FUN14結構域包含蛋白1（FUN14 domain containing 1，FUNDC1）抗體（成都正能公司）；CCK8檢測試劑盒，四甲基羅丹明乙酯（tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE）檢測試劑盒，Mitotracker Red和Lysotracker Green均購自上海碧云天公司。

1.2" 細胞培養

大鼠心肌H9c2細胞系購自美國ATCC細胞庫。用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞密度達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，計數后傳代培養。實驗設對照組（給予等體積PBS處理2 h）和不同濃度NECA組（分別給予10、100和1 000 nmol/L NECA處理2 h）。

1.3" CCK-8檢測H9c2細胞活力

取對數生長期的H9c2細胞，以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，待密度達到80%左右時，按照分組處理細胞，PBS清洗后，每孔加入含10% CCK-8的DMEM 100 μL，37 ℃、5% CO2培養箱中培養1 h，于450 nm波長下檢測光密度值。每組設6個復孔，同時設置空白對照。

1.4" TMRE熒光探針檢測線粒體膜電位

按照分組處理細胞結束后，取出細胞培養小皿，棄去培養基，PBS洗滌3次，更換含有100 nmol/L線粒體膜電位探針TMRE的新培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養20 min，棄去培養基，PBS洗滌3次，更換不含熒光探針的培養基，置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，設置激發波長為543 nm，發射波長為575 nm，采集圖像，利用Image J軟件分析圖像熒光強度值，反映線粒體膜電位的高低。

1.5" 蛋白質印跡檢測線粒體自噬相關蛋白及相關因子表達水平

按照分組處理細胞，加入含100 nmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液，冰上裂解30 min，刮取細胞，超聲破碎20～30 s，1.1×104 r/min離心15 min，提取上清液。經BCA測定蛋白濃度，100 ℃變性5 min后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白轉膜后，用10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，0.1% TBST洗膜3次，用鼠源TOM20、兔源COX Ⅳ、鼠源TIM23、兔源FUNDC1、兔源PINK1、兔源Parkin一抗（1∶1 000）于4 ℃分別孵育過夜。0.1% TBST洗膜3次，室溫孵育同源二抗（1∶1 000）2 h，0.1% TBST洗膜3次，用ECL顯色并采集圖像，使用Image J軟件對條帶進行灰度值分析，記錄數據并進行統計分析。

1.6" Mitotracker Red和Lysotracker Green檢測線粒體和溶酶體共定位

按照分組處理細胞結束后，取出細胞培養小皿，棄去培養基，PBS洗滌3次，更換含有Mitotracker Red（1∶1 000）和Lysotracker Green（1∶1 000）熒光探針的新培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養30 min，棄去培養基，PBS洗滌3次，更換不含熒光探針的培養基，置于激光共聚焦掃描顯微鏡上，設置激發波長分別為488 nm/543 nm，發射波長分別為525 nm/575 nm，采用序列掃描方式采圖。

1.7" Oxygraph-2k高分辨率呼吸儀測定線粒體呼吸鏈復合體活性

每次實驗前需進行空氣校準，向倉內加入按照實驗分組處理完成的H9c2細胞懸液（2×105/mL），完全插入金屬塞后待曲線平穩即可依次加入反應試劑：洋地黃皂苷（digitonin，8 μmol/L）用以破壞細胞膜；細胞色素c（cytochrome，4 mmol/L）用以評價線粒體外膜完整性；蘋果酸（malic acid，5 mmol/L）和谷氨酸（glutamic acid，10 mmol/L）以誘導復合體Ⅰ依賴性呼吸；二磷酸腺苷（ADP，2.5 mmol/L）以誘導復合體Ⅰ最大呼吸速率；復合體Ⅰ抑制劑魚藤酮（rotenone，0.2 μmol/L）抑制復合體Ⅰ呼吸；復合體Ⅱ底物琥珀酸（succinicacid，10 mmol/L）以誘導復合體Ⅱ依賴性呼吸；復合體Ⅱ抑制劑抗霉素A（antimycin A，5 μmol/L）抑制復合體Ⅱ活性；復合體Ⅳ底物四甲基對苯二胺二鹽酸鹽（TMPD，0.25 mmol/L）+抗壞血酸（ascorbate，1 mmol/L）以誘導復合體Ⅳ依賴性呼吸；復合體Ⅳ抑制劑疊氮化鈉（sodium azide，5 mmol/L）以抑制復合體Ⅳ活性。

1.8" 統計學方法

應用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組均數比較采用t檢驗，三組及以上組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間均數比較采用LSD-t檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1nbsp; NECA對心肌H9c2細胞活性和線粒體膜電位無明顯影響

CCK-8實驗結果（圖1）顯示，與對照組相比，不同濃度NECA（10、100和1 000 nmol/L）處理對H9c2細胞的活性無顯著影響，表明實驗中NECA對心肌細胞無毒性作用。與對照組相比，加入NECA（10、100和1 000 nmol/L）后，TMRE熒光強度無明顯變化，表明NECA對心肌線粒體膜電位也無顯著影響（圖2）。

2.2" NECA抑制心肌H9c2細胞線粒體自噬

線粒體自噬相關蛋白的蛋白質印跡結果如圖3所示，與對照組相比，加入10 nmol/L和100 nmol/L NECA處理后，TOM20和COX Ⅳ明顯增高（Plt;0.05）；1 000 nmol/L處理后，TOM20和COX Ⅳ與對照組無明顯差異，表明NECA抑制心肌細胞線粒體自噬。而NECA對TIM23的表達水平無顯著影響。

H9c2細胞溶酶體與線粒體共定位結果如圖4所示，與對照組相比，NECA處理組的溶酶體與線粒體共定位減少，表明加入NECA后溶酶體對線粒體的捕獲清除被抑制，由此說明NECA抑制了線粒體的自噬。

圖中綠色熒光為Lysotracker標記細胞溶酶體；紅色熒光為Mitotracker標記細胞線粒體

2.3" NECA對線粒體自噬相關因子的影響

蛋白質印跡結果如圖5所示，與對照組相比，加入10 nmol/L NECA處理后線粒體自噬相關因子FUNDC1表達水平上升，其他濃度下與對照組相比無顯著差異，表明NECA并非通過下調FUNDC1表達抑制心肌H9c2細胞線粒體自噬。而NECA對PINK1和Parkin的表達水平無顯著影響，說明PINK1/Parkin信號途徑也未參與NECA對心肌線粒體自噬的抑制作用。

2.4" NECA對心肌H9c2細胞線粒體呼吸功能無明顯影響

2.4.1" 洋地黃皂苷破膜濃度的滴定" 實驗開始之前需要對細胞進行破膜處理，使得胞內線粒體呼吸鏈復合體能與加入的底物、抑制劑等試劑進行反應。應用Oxygraph-2k高分辨率呼吸儀滴定洋地黃皂苷以確定細胞破膜的最適濃度，結果如圖6所示，當進行到第4次加入洋地黃皂苷時，耗氧量開始增加，說明復合體開始與底物進行反應，確定最適破膜濃度為8 μmol/L。

2.4.2" 細胞色素C滴定評價線粒體外膜的完整性" 在確定洋地黃皂苷破膜濃度后，需進一步驗證該濃度下的線粒體外膜是否完整。當外膜完整性缺失時，細胞色素C可漏出線粒體，從而使呼吸速率下降，甚至抑制呼吸。此時，如果添加外源性細胞色素C將顯著地刺激線粒體呼吸，導致其耗氧量增加。如圖7所示，滴定細胞色素C，耗氧量沒有上升，表明線粒體細胞色素C沒有損失，說明洋地黃皂苷破膜濃度為8 μmol/L時，線粒體外膜仍具有完整性。

2.4.3" NECA對心肌H9c2細胞線粒體復合體活性的影響" 通過添加各復合體的底物、抑制劑和足量的ADP，以刺激或抑制相應復合體的呼吸，Oxygraph-2k高分辨率呼吸儀逐步測量復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ呼吸耗氧量，并定位功能障礙的復合體。圖8所示為心肌H9c2細胞應用底物解偶聯劑抑制劑滴定方案測定線粒體復合體呼吸耗氧量，與對照相比，10 nmol/L NECA處理組線粒體復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ呼吸耗氧量無顯著變化，說明NECA處理對復合體活性無顯著影響。

3" 討論

線粒體是細胞的能量工廠，在生理條件下，其數量和質量的調節處于動態平衡，被稱之為線粒體穩態。線粒體穩態的維持，是心肌細胞發揮正常生理功能所必需的。線粒體自噬能夠清除受損的線粒體，在線粒體的質量控制和正常線粒體功能的維持中起著至關重要的作用［7］，然而，過度的線粒體自噬導致腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）產生減少和DNA突變，最終誘發細胞死亡［8］。

線粒體自噬為細胞自噬的一個重要類型，其變化趨勢多與細胞自噬一致。線粒體內外膜標志蛋白是檢驗線粒體自噬的主要指標。大多數線粒體蛋白在細胞質基質中合成為含有N端靶向肽的前體蛋白，并通過線粒體外膜蛋白TOM和線粒體內膜蛋白TIM導入線粒體［9］，COX Ⅳ是定位在線粒體內膜的蛋白，三者的表達水平能反映細胞內線粒體的數量變化。有研究報道NECA能夠抑制再灌注時心肌細胞自噬［4］，但其對心肌線粒體自噬的影響尚不清楚。本研究結果顯示，加入NECA（10、100 nmol/L）后，線粒體自噬標志蛋白TOM20和COX Ⅳ表達水平增高，提示NECA抑制心肌細胞線粒體自噬。同時，NECA處理組的溶酶體與線粒體共定位減少，表明加入NECA后，溶酶體對線粒體的捕獲清除被抑制，說明NECA抑制了線粒體的自噬。另外值得注意的是，線粒體內膜蛋白TIM23表達水平并無明顯改變，這可能與抗體的特異性等因素相關。

為了探討NECA抑制心肌線粒體自噬的可能機制，本研究檢測了其對線粒體自噬相關因子的影響。PINK1/Parkin是介導線粒體自噬最經典的信號途徑之一［10］。生理條件下，PINK1定位于線粒體膜間隙后被線粒體內膜早老素相關菱形樣蛋白（presenilin associated rhomboid like protein，PARL）切割，釋放至胞質，最終被蛋白酶體降解，維持在低水平狀態［11-13］。然而當線粒體膜電位喪失時，PINKl會定位在線粒體外膜上，并募集Parkin到線粒體上，促進線粒體蛋白泛素化，誘發線粒體自噬。FUNDC1是一種新型的線粒體自噬相關蛋白，其定位于線粒體外膜，參與線粒體動力學和線粒體自噬過程，在各種人類疾病中起關鍵作用［8］。本研究中，NECA處理后PINK1、Parkin蛋白表達水平并未發生改變，提示其未參與NECA對心肌線粒體自噬的調控。但10 nmol/L NECA處理后FUNDC1的表達水平并未下降，這與NECA抑制心肌線粒體自噬的結果相矛盾。以上結果說明可能存在其他因素參與了NECA對心肌線粒體自噬的抑制作用。

為了探討NECA對心肌線粒體自噬的抑制作用是否對線粒體呼吸功能造成影響，本研究檢測了線粒體復合體的呼吸功能。線粒體通過氧化磷酸化為大多數細胞供應能量［14］。氧化磷酸化由嵌入線粒體內膜的5個復合體執行，即復合體Ⅰ-Ⅴ［15］。在此過程中，電子由定位于線粒體內膜的電子傳遞系統傳遞，同時在復合體Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ水平上質子被泵至線粒體膜間隙。線粒體內外膜間形成的質子梯度被磷酸化系統用來產生ATP形式的能量［16］。在病理條件下，心臟中的超氧化物主要產生于線粒體電子傳遞鏈［17］?；钚匝跏怯醒醮x中產生的高反應性還原氧分子［18］，細胞內高濃度的活性氧會損傷蛋白質、膜脂質、DNA，并觸發線粒體通透性轉換孔開放［19］。本研究結果顯示NECA對心肌H9c2細胞線粒體復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性無顯著影響。

綜上所述，本研究結果表明NECA抑制心肌H9c2細胞線粒體自噬，但對線粒體呼吸功能無明顯影響。然而，NECA抑制心肌H9c2細胞線粒體自噬的分子機制尚不清楚，以及其對線粒體自噬的抑制是否對心肌的結構功能帶來影響，仍有待于進一步研究。

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［收稿日期］" 2023-12-18" ［編輯］" 何承志