尼拉帕利通過DDX21增強膠質母細胞瘤放射敏感性

［摘要］" 目的： 探究多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］抑制劑尼拉帕利作為膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）放療增敏劑的可行性及作用機制。方法： 生物信息學分析PARP抑制劑奧拉帕利和他拉唑帕利在膠質瘤中的作用機制及其與放療的相關性；CCK-8測定尼拉帕利在GBM細胞（A172、U251和U87）中的最適作用濃度和最適作用時間；克隆形成實驗檢測尼拉帕利對GBM細胞放療敏感性的影響；流式細胞術檢測尼拉帕利聯合放療對GBM細胞周期的影響，蛋白質印跡檢測尼拉帕利聯合放療對DExD-box解旋酶（DExD-box helicase，DDX21）蛋白表達的影響，免疫熒光法研究尼拉帕利聯合放療對DDX21在GBM中細胞核定位的影響，以探討尼拉帕利在GBM中放療增敏的作用機制。結果： 生物信息學分析表明，在519個腫瘤細胞系中，PARP抑制劑在膠質瘤中發揮作用的途徑主要與核糖體生物合成和功能相關；在44個實體腫瘤細胞系中，同源重組修復能力與核糖體生物合成能力高度正相關。尼拉帕利在A172和U87細胞系中的IC50值分別為（10.77±3.31）μmol/L和（32.37±2.84）μmol/L；在尼拉帕利濃度為348 nmol/L和1 044 nmol/L時A172細胞的輻射劑量增強因子（DEF37）分別為1.99和2.17，在1 056 nmol/L和3 169 nmol/L時U87細胞的DEF37分別為1.10和1.44，尼拉帕利對p53野生型的A172細胞和U87細胞具有放療增敏作用，但對p53突變型的U251細胞無放療增敏作用；在A172細胞和U87細胞中尼拉帕利聯合放療組的G2/M期細胞均明顯多于對照組，尼拉帕利聯合放療可以使A172和U87細胞阻滯在對射線敏感的G2/M期，從而實現放療增敏。最后，尼拉帕利聯合放療處理U87細胞后，DDX21蛋白表達無顯著變化（P＞0.05），免疫熒光結果提示尼拉帕利聯合放療處理U87細胞后，DDX21從核仁到核質重新定位；敲低DDX21會引起U87細胞產生放療抵抗，尼拉帕利對DDX21敲低后的U87細胞仍有放療增敏作用。結論： 尼拉帕利通過使DDX21從核仁到核質重新定位，影響核糖體生物合成，產生G2/M期細胞周期阻滯，從而增加U87細胞的放療敏感性。

［關鍵詞］" 膠質母細胞瘤；尼拉帕利；DDX21；放療敏感性；核糖體生物合成

［中圖分類號］" R739.41" ［文獻標志碼］" A" ［文章編號］" 1671-7783（2024）05-0395-12

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230281

［引用格式］羅佳，肖何，彭楊，等. 尼拉帕利通過DDX21增強膠質母細胞瘤放射敏感性［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（5）： 395-406.

［基金項目］國家重點研發計劃課題（2018YFC0114402）

［作者簡介］羅佳（1992—），女，碩士研究生；耿明英（通訊作者），主任醫師，教授，E-mail： 380904661@qq.com

Niraparib enhances radiosensitivity of glioblastoma with DDX21

LUO Jia， XIAO He， PENG Yang， GENG Mingying

（Cancer Center， Daping Hospital， Army Medical University， Chongqing 400042， China）

［Abstract］" Objective： To explore the feasibility and mechanism of the poly（ADP-ribose）polymerase （PARP） inhibitor niraparib as a radiosensitizer for glioblastoma （GBM）. Methods： Bioinformatics analysis was used to reveal the mechanism of PARP inhibitors in glioma and its correlation with radiotherapy. CCK-8 was used to determine the optimal concentration and treatment time of niraparib in GBM cells （A172， U251 and U87）. A clonogenic assay was used to detect the radiosensitivity of GBM cells to niraparib. Flow cytometry was used to detect the effect of niraparb combined with radiotherapy on GBM cell cycle. Western blotting was used to detect the impact of niraparib combined with radiotherapy on the expression of DExD-box RNA helicase （DDX21） protein. Immunofluorescence was used to detect the effect of niraparib combined with radiotherapy on the localization of DDX21 in the nucleus of GBM cells. Results： Pathways relevant to ribosome biosynthesis and functions was found to be responsible for cytotoxicity of niraparib in 519 tumor cell lines. Homologous recombination repair ability was highly positively correlated with ribosomal biosynthesis ability in 44 solid tumor cell lines. Moreover， the IC50 of niraparib in A172 and U87 cell lines were （10.77±3.31）μmol/L and （32.37±2.84）μmol/L respectively. The dose enhancement factor （DEF37） of A172 cells was 1.99 and 2.17 at the concentrations of niraparib at 348 nmol/L and 1 044 nmol/L， respectively， and the DEF37 of U87 cells was 1.10 and 1.44 at concentrations of 1 056 nmol/L and 3 169 nmol/L， respectively. Niraparib exerted radiosensization effects on A172 and U87 cells of p53 wild-type， but not on U251 cell of p53 mutant. Niraparib increased radiosensitivity through G2/M phase arrest in A172 and U87 cellls. Finally， in U87 cells， niraparib combined with irradiation didn′t affect the protein expression of DDX21， but it could lead to the translocation of DDX21 from the nucleolus to the nucleoplasm. Knockdown of DDX21 in U87 cells with high expression of DDX21 resulted radiotherapy resistance， and niraparib still has radiosensitization effect in U87 cells after DDX21 knockdown. Conclusions： Niraparib affected ribosome biosynthesis via translocation of DDX21 from the nucleolus to the nucleoplasm， causing the cell cycle to block the G2/M stage， thus increasing the radiosensitivity of U87 cells.

［Key words］" glioblastoma; niraparib; DDX21; radiosensitivity; ribosome biosynthesis

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是發病率最高的顱內原發性腫瘤，盡管Stupp方案顯著延長了GBM中位無進展生存期和總生存期，但5年生存率仍低于10%，GBM預后不良與放化療抵抗密切相關［1］。DNA修復缺陷、干細胞的特殊生物學行為、微小RNA（microRNA）參與的表達調控都直接影響了GBM對放化療的敏感性［2-4］。

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］是一類將二磷酸腺苷核糖基團轉移至靶蛋白的蛋白質超家族，其中PARP1基因在DNA損傷修復中發揮重要的作用，成為PARP家族最早的腫瘤治療靶點。PARP1參與的堿基切除修復是細胞內DNA單鏈損傷的主要修復機制，抑制PARP1活性可阻礙DNA單鏈損傷修復，并可誘導DNA雙鏈損傷。同源重組（homologous recombination，HR）修復缺陷細胞，如攜帶BRCA1/2突變，無法對DNA雙鏈損傷進行有效修復，如果同時使用PARP抑制劑阻斷DNA單鏈損傷修復，則形成“合成致死”而殺傷腫瘤細胞，這一原理已成功應用于卵巢癌和乳腺癌治療［5-10］。此外，研究顯示PARP1也可以通過其他機制調節細胞增殖，在同源重組修復能力完整的乳腺癌細胞中，PARP1通過DExD-box解旋酶（DExD-box helicase，DDX21）減少核糖體生物合成，從而抑制具有高同源重組修復活性的乳腺癌細胞增殖［11］。DDX21主要是通過參與調節核糖體DNA轉錄、核糖體RNA加工和修飾影響核糖體生物合成［12］。因此PARP抑制劑也可通過DDX21影響聚腺苷二磷酸核糖［Poly（ADP-ribose），PAR］依賴的核糖體蛋白轉錄激活并促進核糖體生物合成［13］。GBM保留了完整的同源重組修復功能，幾乎不存在BRCA突變［14］，因此，在GBM中PARP抑制劑可能存在與乳腺癌類似的作用途徑，由DDX21調控核糖體生物合成。對GBM細胞系的研究發現，PARP抑制劑的放療增敏效應幅度依然取決于同源重組修復機制的缺失，同源重組修復缺失的細胞系與同源重組修復完整的細胞系相比，達到同樣的放療增敏效應所需的PARP抑制劑濃度平均低10倍［15-17］。我們推測同源重組修復缺失不單是PAPR抑制劑單藥敏感性標志物，也可能是放療增敏效應的標志物。

在GBM中，PARP抑制劑的放療增敏可能與單藥敏感性有共同機制，即PARP抑制劑通過DDX21影響PAR依賴的核糖體蛋白轉錄激活并促進核糖體生物合成，實現放療增敏。故本研究擬通過生物信息學分析和分子生物學實驗探討PARP抑制劑尼拉帕利對GBM放療敏感性的影響。

1" 材料和方法

1.1" 生物信息學分析

1.1.1" 數據獲取和預處理" 從腫瘤藥物敏感性基因組學（GDSC）數據庫（https：//www.cancerrxgene.org/）分別下載具有PARP抑制劑奧拉帕利（Olaparib）和他拉唑帕利（Talazoparib）半數抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）的癌細胞系百科全書（CCLE）細胞系946個和910個。

從京都基因組百科全書（KEGG）數據庫中獲取hsa03440同源重組修復通路的41個基因，在cBioPortal提取CCLE細胞系的41個同源重組通路基因突變數據。同時具有奧拉帕利和他拉唑帕利IC50數據及41個同源重組修復通路基因突變數據的乳腺癌（breast cancer，BRCA）、卵巢癌（ovarian cancer，OV）和膠質瘤細胞系分別有45、30和33個，共108個細胞系納入分析。

從https：//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3610/files/raw/下載CCLE細胞系經［HG-U219］Affymetrix Human Genome U219 Array微陣列芯片得到的CEL文件。讀取CEL文件并用穩健多芯片分析算法（RMA）函數對背景校正、歸一化和探針合并后得到探針簇水平的表達值矩陣。美國國立癌癥研究規定的60種（NCI60）細胞系2 Gy生存分數（survival fraction at 2 Gy，SF2）從文獻獲取［18］。其中有48個細胞系可在E-MTAB-3610獲取CEL文件。與108個細胞系同法利用RMA得到48個細胞系的表達值矩陣。539例癌癥基因組圖譜數據庫（TCGA）GBM表達譜數據（Affymetrix HT Human Genome U133a microarray platform）以及臨床特征和預后隨訪等數據從加利福尼亞大學圣克魯茲分校（UCSC）數據庫（https：//xenabrowser.net/datapages/）下載。

1.1.2" 計算PARP敏感標簽" PARP敏感性標簽根據CCLE細胞對PARP抑制劑敏感性篩選得到，按照文獻方法計算耐藥細胞系與敏感細胞系差異表達基因表達倍量［log2（FC）］的皮爾遜相關系數作為PARP抑制劑敏感性量度指標［19］。PARP抑制劑敏感性指標與IC50值的相關性采用單因素線性回歸分析，以IC50值作為因變量，PARP抑制劑敏感性指標作為自變量。

采用與腫瘤免疫功能障礙和排斥（TIDE）評分中T細胞耗竭標簽分子篩選的類似方法［20］，以PARP抑制劑IC50值作為因變量，以PARP敏感性標簽、基因表達值和兩者交互項作為協變量進行多元線性回歸。提取18 464個基因的交互項t值，使用t值作為檢驗變量，利用clusterProfiler包gsePathway函數完成基因集的富集分析［21］。取校正后Plt;0.15作為顯著富集通路。

1.1.3" 構建放療抵抗指數、核糖體生物合成及同源重組能力指標" 48個NCI60細胞系與TCGA GBM表達值矩陣共有10 127個重疊基因。以RADzeta值（radiosensitivity zata value）表示放療抵抗指數，48個NCI60細胞系主要用于RADzeta值的構建。對48個NCI60細胞系表達值矩陣取z值轉換后，篩選SF2最小和最大的12個細胞系間差異表達基因，以SF2值最大的12個細胞系表達均值作為c2，SF2最小12個細胞系表達均值作為c1，用向量射影公式［22］計算RADzeta作為量度放療抵抗指標［23］。RADzeta值越大表明放療抵抗作用越強。用于計算RADzeta的基因和24個細胞的質心值見表1。從Gene Ontology（GO）數據庫中提取正向調控同源重組修復的10個基因，取10個基因的表達均值作為同源重組修復能力的量度指標。在539例TCGA GBM病例中，分析529例原發灶組織和10例正常腦組織間差異表達基因，其中有1 521個基因在癌組織中高表達。取1 521個差異表達基因與GO核糖體合成途徑基因交集作為核糖體生物合成標簽分子，共45個基因，取表達均值作為核糖體生物合成能力指標。

1.2" 分子生物學實驗

1.2.1" 主要試劑" DMEM/F12（1∶1）培養基、胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；尼拉帕利（貨號ZL-2306）由再鼎醫藥（上海）有限公司饋贈；蛋白裂解液、增強型化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（美國Thermo公司）；二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、結晶紫染液購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人DDX21抗體（貨號ab182156）、小鼠抗人β-actin抗體（貨號ab8226）、山羊抗鼠HRP-標記二抗（貨號ab6789）、山羊抗兔HRP-標記二抗（貨號ab6721）均為英國Abcam公司產品；CCK-8檢測試劑盒（博士德生物公司）；DDX21敲除慢病毒（上海吉凱公司），DDX21干擾序列：F：5′-CGCTCCTTGATCAACTCAAAT-3′，R：5′-GGAGACACTGCGAAAGCAAAC-3′。其他常規試劑均為國產分析純產品或進口產品分裝。

1.2.2" 細胞培養" 人腦膠質母細胞瘤細胞系A172、U251、U87，三種細胞BRAC基因突變狀態均未知，購自中國科學院上海細胞庫，均用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養基，置于37 ℃含5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.3" 尼拉帕利藥物配置" 尼拉帕利加入二甲亞砜溶解配置成100 mmol/L的儲存液［24］，0.22 μm除菌過濾器過濾除去細菌、雜質，分裝保存于－20 ℃冰箱，切勿反復凍存。

1.2.4" CCK-8實驗檢測藥物抑制率和細胞增殖率" 將A172、U251、U87細胞用不同濃度（3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、300 μmol/L）的尼拉帕利處理為實驗組，以未處理細胞為空白對照組。按每孔3 000個細胞/100 μL接種到96孔板中，培養至貼壁，加入200 μL各濃度藥物，繼續培養24 h、48 h后，加入CCK-8溶液，全自動酶標儀檢測各孔450 nm處光密度（D）值。藥物抑制率（%）=（D對照組－D實驗組）/D對照組×100%，按照藥物效應中效方程式計算出IC50，篩選出最適藥物濃度和最佳干預時間作為后續實驗給藥條件。細胞增殖率（%）=（D實驗組－D對照組）/D對照組×100%。

1.2.5" 細胞克隆形成實驗檢測放療敏感性" A172和U251細胞按1 000個細胞/4 mL接種，U87細胞按2 000個細胞/4 mL接種，培養至貼壁，加入不同濃度尼拉帕利處理30 min后，采用不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）X射線照射細胞，照射方式：室溫條件下采用8 MV X射線照射細胞，源皮距100 cm，劑量率600 cGy/min［25］。培養14 d后于顯微鏡下可見≥50個細胞的細胞團時，終止培養，4%多聚甲醛室溫固定10 min，1%結晶紫室溫染色10 min，清水洗滌至水無顏色，晾干拍照，顯微鏡下計數克隆數目，≥50個細胞的細胞團為1個克隆。計算克隆形成率（plating efficiency，PE）和細胞存活分數，PE（%）=克隆數目/細胞接種數×100%，細胞存活分數=受照射組PE/對照組PE。

1.2.6" 流式細胞技術檢測細胞周期" 分別將A172、U87細胞設為4組，對照組、尼拉帕利組、放療組和尼拉帕利聯合放療組，尼拉帕利濃度為1/30 IC50、X射線劑量為4 Gy，處理48 h后收集細胞，70%乙醇－20 ℃固定過夜，加入RNase/PI染色，避光孵育30 min，流式細胞分析儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.7" 蛋白質印跡實驗檢測DDX21蛋白表達" 分別將A172、U251、U87細胞設為4組，對照組、尼拉帕利組、放療組和尼拉帕利聯合放療組，尼拉帕利濃度為1/30 IC50、X射線劑量為4 Gy，處理48 h后收集細胞，加入蛋白裂解液裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度。每組取等量蛋白用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，濕轉法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。10%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，Tris-吐溫緩沖液（TBST）洗滌5 min×3次，一抗（DDX21，貨號ab182156，1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5 min×5次，二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌5 min×5次，ECL發光試劑盒自動曝光顯影。Image J軟件分析目的條帶和內參的灰度值比值，判斷目的蛋白的表達水平。

1.2.8" 免疫熒光法檢測DDX21細胞定位" U87細胞接種至6孔板，經1/30 IC50尼拉帕利和4 Gy X射線處理48 h后，4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.5% Triton X-100室溫通透20 min，一抗（DDX21，貨號ab182156，1∶50）4 ℃孵育過夜，山羊抗兔熒光二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后滴加抗熒光淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.9" 克隆形成實驗檢測敲低DDX21對U87細胞克隆形成能力的影響" U87細胞接種于6孔板中，每孔接種1×105個細胞，培養至細胞貼壁。棄掉培養基，加入1 mL培養基、40 μL轉染試劑和2 μL慢病毒，輕搖混勻后置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中轉染12 h。棄掉含慢病毒的培養基，加入2 mL新培養基繼續培養72 h。用濃度為2 ng/mL、含嘌呤霉素的培養基培養轉染后的細胞，繼續傳代3代以上，獲得DDX21穩定敲低的U87細胞株（U87-shDDX21）。將U87-shDDX21細胞分為對照組、尼拉帕利組、放療組和尼拉帕利聯合放療組，克隆形成實驗檢測4組細胞的克隆形成能力，實驗方法同“1.2.5”。

1.3" 統計學方法

使用Image J軟件分析圖像，Graphpad Prism 8.1.1對實驗數據進行統計學分析。實驗組間的兩樣本比較采用配對t檢驗。IC50等參數在不同癌種細胞系間的多組之間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。采用線性回歸分析各種癌細胞系中PARP敏感性標簽與IC50的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" CCLE細胞系PAPR抑制劑耐藥機制

在乳腺癌、卵巢癌和GBM中，兩種PARP抑制劑IC50中位值和四分位距見表2，3種腫瘤的奧拉帕利IC50值無統計學差異（P=0.057），乳腺癌的他拉唑帕利IC50值明顯高于卵巢癌和GBM。3種腫瘤中，兩種PARP抑制劑的IC50值在同源重組基因截短突變和野生型組間均無顯著差異（奧拉帕利P=0.769;他拉唑帕利P=0.239）。然而，PARP敏感性標簽卻表現了良好的預測IC50的作用。對于奧拉帕利，在卵巢癌中PARP敏感性標簽對IC50預測作用具有顯著性（P=0.001），而PARP敏感性標簽對于乳腺癌和卵巢癌的他拉唑帕利IC50預測作用均有顯著性（P分別為0.004和0.025），見表2。

以PARP敏感性標簽作為基礎，分別在乳腺癌、卵巢癌和GBM中利用含交互項的線性回歸篩選與PAPR敏感性標簽存在交互作用的基因。GSEA分析表明，乳腺癌中核糖體生物合成是影響奧拉帕利藥物敏感性的主要機制；而在GBM中影響奧拉帕利藥物敏感性的基因除了主要參與有絲分裂外，還參與核糖體生物合成。見表3、4和圖1。

2.2" 核糖體生物合成及同源重組修復能力影響放療敏感性

在48個NCI60細胞系中，RADzeta與SF2呈正相關（r=0.627，P=5.198×10-6），同源重組修復能力與核糖體生物合成能力呈正相關（r=0.632，P=4.182×10-6）；核糖體生物合成、細胞周期素表達與RADzeta呈顯著負相關性。同源重組修復能力與核糖體生物合成能力的正相關性，以及同源重組修復能力、細胞周期素表達及核糖體生物合成與RADzeta的負相關性也可在529例GBM原發腫瘤組織中觀察到。見圖2。

2.3" 尼拉帕利對GBM細胞的抑制作用

CCK8實驗結果顯示，不同濃度的尼拉帕利處理24 h和48 h后，對A172、U251、U87細胞均有抑制作用（圖3）。相同濃度下，尼拉帕利處理48 h的抑制作用強于24 h，故后續作用時間選擇48 h。根據藥物濃度和抑制率的關系，計算出尼拉帕利處理48 h后A172細胞的IC50為（10.77±3.31）μmol/L，U251細胞的IC50為（18.91±2.95）μmol/L，U87細胞的IC50為（32.37±2.84）μmol/L。由于本研究是探索尼拉帕利的放療增敏作用，故選用IC50的1/10、1/30和1/100三個較低濃度進行后續實驗［26-27］。A172采用104、348、1 044 nmol/L，U251采用189、630、1 891 nmol/L，U87采用316、1 056、3 169 nmol/L。

2.4" 尼拉帕利對GBM細胞的放療增敏作用

不同濃度的尼拉帕利作用于A172、U251和U87細胞，經不同劑量的X射線照射后，隨著照射劑量和藥物濃度的增加，A172和U87細胞的克隆形成能力顯著下降（圖4）。在尼拉帕利濃度為348 nmol/L和1 044 nmol/L時，A172細胞的輻射劑量增強因子（DEF37）分別為1.99和2.17；在1 056 nmol/L和3 169 nmol/L時U87細胞的DEF37分別為1.10和1.44。尼拉帕利明顯增加了p53野生型GBM細胞A172和U87對放療的敏感性，在U251細胞中尼拉帕利放療增敏效果不明顯，故后續研究中采用A172和U87細胞。

2.5" 尼拉帕利對GBM細胞周期分布影響

結果如圖5所示，A172和U87細胞經1/30 IC50尼拉帕利和4 Gy X射線處理48 h后，尼拉帕利聯合放療組的G2/M期細胞數量顯著多于對照組、尼拉帕利組和放療組（Plt;0.05），而4組之間G0/G1和S期的細胞數量無顯著差異（P＞0.05）。放療與尼拉帕利存在協同交叉效應，可使A172細胞和U87細胞產生G2/M期阻滯。

2.6" DDX21在GBM細胞中的表達

在A172細胞中，DDX21沒有表達，在U251和U87細胞中，DDX21呈高表達（圖6）。因A172細胞中無DDX21表達，且尼拉帕利對U251細胞無放療增敏作用，故后續作用機制只在U87細胞中進行研究。

2.7" 尼拉帕利聯合放療對U87細胞DDX21蛋白表達的影響

如圖7所示，在U87細胞中，尼拉帕利聯合放療組和放療組的DDX21蛋白表達較對照組、尼拉帕利組略有下降。尼拉帕利聯合放療對U87細胞中DDX21蛋白表達影響不顯著。

2.8" 尼拉帕利聯合放療影響U87細胞的DDX21定位

如圖8所示，在對照組、尼拉帕利組和放療組中，DDX21在U87細胞的核仁中有染色，而尼拉帕利聯合放療組DDX21在核質中有染色。提示尼拉帕利聯合放療處理U87細胞可以引起DDX21從核仁到核質的重新定位。

比例尺=100 μm

2.9" 尼拉帕利聯合放療對DDX21敲低的U87細胞克隆形成能力的影響

通過慢病毒敲低U87細胞中的DDX21表達（圖9A），以觀察尼拉帕利聯合放療對DDX21敲低的U87細胞克隆形成能力的影響。結果如圖9B和9C所示，在敲低DDX21的U87細胞和未敲低的U87細胞中，尼拉帕利聯合放療組的細胞克隆形成能力均顯著低于對照組、放療組和尼拉帕利組，且各組中敲低DDX21后U87的克隆形成能力顯著高于未敲低組。

A：蛋白質印跡驗證U87細胞敲低DDX21；B：細胞克隆形成圖；C：細胞存活分數統計結果（*：Plt;0.05）

3" 討論

本研究通過生物信息學分析發現GBM主要通過參與核糖體生物合成以及蛋白質翻譯等通路產生對奧拉帕利的耐藥，且同源重組修復能力與核糖體生物合成能力呈正相關性，進一步證實了同源重組修復機制可能參與核糖體生物合成途徑的假設。并且在GBM組織中同源重組修復能力、細胞周期素表達及核糖體生物合成與RADzeta呈顯著負相關性，提示同源重組修復能力越高的GBM對放療越敏感，這與DNA損傷修復機制是相反的，該結果表明在GBM中影響放療敏感性的因素可能不只是DNA損傷修復，也可能與同源重組修復介導的核糖體生物合成相關，在具備高同源重組修復能力和核糖體生物合成特征的GBM組織中，在受到電離輻射照射后更容易引起DNA損傷修復延遲、周期阻滯和凋亡等效應。也有文獻報道GBM細胞U251和U34經25 Gy照射后的下調基因主要參與核仁小RNA、核糖體生物合成、核糖體RNA代謝等通路［28］。因此，高同源重組修復能力和核糖體生物合成與GBM放療增敏密切相關。

已有證據表明核糖體蛋白在介導結直腸癌細胞核仁應激和GBM細胞DNA復制應激誘導的細胞周期阻滯和凋亡中起著重要作用［29-30］，在高同源重組修復活性和核糖體生物合成的GBM細胞中，促進增殖的核糖體蛋白，同樣在電離輻射導致基因組毒性作用中起到介導周期阻滯和凋亡的作用，對這種核糖體蛋白種類的鑒別和功能研究可為GBM放療敏感性機制提供進一步線索。有研究報道，PARP1可以通過在核仁中的富集和影響核仁蛋白的ADP核糖基化參與核糖體生物合成［31］，故PARP抑制劑除了阻止細胞DNA損傷修復殺傷腫瘤以外，還可能通過影響核糖體生物合成而參與細胞周期阻滯和凋亡。且已有研究證明，在同源重組修復能力完整的乳腺癌細胞中，PARP抑制劑尼拉帕利通過抑制PARP1活性，控制DDX21的ADP核糖基化，減少核糖體生物合成，來抑制腫瘤細胞增殖，而不是依賴于DNA損傷［13］。因此，在PARP抑制劑GBM放療增敏中可能會有和乳腺癌類似的作用機制，DDX21可能是尼拉帕利在GBM中放療增敏的關鍵蛋白。

本研究利用A172、U251和U87細胞，對PARP抑制劑的放療增敏作用和DDX21參與放療抵抗機制進行了初步實驗研究，結果表明在p53野生型的A172和U87細胞中，PARP抑制劑尼拉帕利在遠低于單藥抑制細胞活性IC50的濃度下即有放療增敏效應，尼拉帕利聯合放療可以使A172和U87細胞周期阻滯在對射線敏感的G2/M期，但是在p53突變型的U251細胞中卻沒有觀察到尼拉帕利的放療增敏作用，該結果表明尼拉帕利的放療增敏可能還與細胞的p53突變狀態有關。有研究報道DDX21可以通過影響核糖體生物合成和調節p53功能來實現細胞周期阻滯［32］，這也可能是尼拉帕利對p53突變細胞U251沒有放療增敏作用的原因之一。生物信息分析結果得知，在乳腺癌中PARP抑制劑可以通過激活PAR依賴的核糖體蛋白轉錄，促進核糖體生物合成。為了進一步明確影響核糖體生物合成的DDX21對尼拉帕利在GBM放療增敏中發揮的作用，在DDX21高表達的U87細胞中敲低DDX21，結果可導致細胞出現放療抵抗，該結果證明了DDX21可能與GBM產生放療抵抗有密切關系。同時，尼拉帕利對DDX21低表達的A172細胞和敲低DDX21后的U87細胞都有放療增敏的作用，該結果表明，尼拉帕利對由DDX21低表達引起的GBM放療抵抗依然有效。本研究結果還表明尼拉帕利聯合放療處理U87細胞后，DDX21蛋白表達無明顯變化，但是發生了DDX21從核仁到核質的重新定位，該結果證明了DDX21可能通過核仁到核質的重新定位，影響核糖體生物合成，參與了尼拉帕利在GBM中放療增敏的作用。

PARP有兩個作用機制：第一是作為DNA單鏈和雙鏈斷裂感受器，通過PAR編碼機制啟動下游DNA損傷修復［5-6］；第二是通過PAR依賴的核糖體蛋白轉錄激活并促進核糖體生物合成，進而促進腫瘤細胞增殖和存活［13］，而一些核糖體蛋白在DNA損傷應答中參與誘導細胞周期阻滯［33］?；诒狙芯拷Y果可知，尼拉帕利在GBM中發揮放療增敏作用主要是基于第二機制，無論GBM細胞同源重組修復狀態如何，尼拉帕利以DDX21作為增敏位點，使DDX21從核仁到核質重新定位，影響核糖體生物合成，誘導細胞周期阻滯，實現放療增敏。

綜上所述，本研究結果表明尼拉帕利對同源重組修復能力完整的GBM細胞A172和U87有放療增敏作用，其主要作用機制是以DDX21作為增敏位點，通過DDX21從核仁到核質的重新定位，影響核糖體生物合成，誘導細胞周期產生G2/M期阻滯。但尼拉帕利聯合放療影響核糖體生物合成是從文獻中推測得知，還需要在后期研究中分析核糖體合成下游相關的核糖體蛋白表達來進一步證實。同時，DDX21敲低引起的GBM放療抵抗的具體作用機制也有待進一步研究。

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［收稿日期］" 2023-12-18" ［編輯］" 何承志