阿爾茨海默病病變相關腦區(qū)Pgc-1alpha敲除小鼠模型的構建

［摘要］" 目的： 構建在阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）病變相關腦區(qū)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1 alpha，Pgc-1alpha）敲除小鼠。方法： 引入Pgc-1alpha條件性敲除雜合子小鼠（Pgc-1alphafl/+），通過自交獲得Pgc-1alpha條件性敲除純合子小鼠（Pgc-1alphafl/fl）。將Pgc-1alphafl/fl純合子小鼠和在AD病變腦區(qū)（皮層、海馬）特異性表達Cre重組酶的Cre工具鼠（Calb1-Cre）雜交，提取子代轉基因小鼠基因組DNA，行PCR鑒定，確定其基因型；采用蛋白免疫印跡技術檢測轉基因小鼠與野生型小鼠腦區(qū)及腎臟PGC-1α蛋白表達。結果： 雙重PCR鑒定結果顯示，同時擴增出400 bp及444 bp條帶的小鼠為AD病變腦區(qū)Pgc-1alpha敲除純合子小鼠（Pgc-1alphafl/fl：：Calb1-Cre，Pgc-1alpha-/-）。蛋白免疫印跡結果顯示，與野生型小鼠相比，條件性敲除小鼠腦區(qū)PGC-1α蛋白表達明顯減少（Plt;0.05）。結論： 成功構建在AD病變相關腦區(qū)Pgc-1alpha敲除小鼠。

［關鍵詞］" 過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（Pgc-1alpha）；條件性敲除；小鼠；阿爾茨海默病；皮層；海馬

［中圖分類號］" R749.16" ［文獻標志碼］" A" ［文章編號］" 1671-7783（2024）05-0423-05

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230109

［引用格式］史厚珍，張維君，翟鴻儒，等. 阿爾茨海默病病變相關腦區(qū)Pgc-1alpha敲除小鼠模型的構建［J］. 江蘇大學學報（醫(yī)學版）， 2024， 34（5）： 423-427，450.

［基金項目］江蘇省重點研發(fā)社會發(fā)展面上項目（BE2022782）；鎮(zhèn)江市政策引導類計劃項目（GJ2021010）；鎮(zhèn)江“金山英才”高層次領軍人才培養(yǎng)計劃（第六期“169”工程）科研資助項目；鎮(zhèn)江市重點研發(fā)產業(yè)前瞻與共性關鍵技術項目（SH2022019）

［作者簡介］史厚珍（1998—），女，碩士研究生；王佳（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail： wangjia@ujs.edu.cn

Construction of Pgc-1alpha knockout mouse model in Alzheimer′s disease related pathological brain regions

SHI Houzhen1， ZHANG Weijun1， ZHAI Hongru1， WANG Yijie1，WANG Yuxin1， LIU Zizhong2， WANG Jia1，2，3

（1. School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013; 2. Department of Neurology， the Fourth Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212001; 3. Zhenjiang Jieshengrui Biotechonology Co.， Ltd， Zhenjiang Jiangsu 212013， China）

［Abstract］" Objective： To constuct peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1 alpha （Pgc-1alpha） knockout mouse model in Alzheimer′s disease （AD）-related pathologic regions. Methods： Pgc-1alphafl/fl homozygous mice were obtained by crossing Pgc-1alphafl/+ heterozygous offspring. Pgc-1alphafl/fl homozygous mice were hybridized with Cre tool mice （Calb1-Cre）， which specifically expressed Cre recombinase in AD lesion brain regions （cortex and hippocampus）， and the genetic DNA of progeny transgenic mice was extracted and identified by PCR. The expression of PGC-1α protein in brain and kidney of transgenic mice and wild-type mice was detected by Western blotting. Results： Dual PCR analysis revealed that mice exhibiting simultaneous amplification of 400 bp and 444 bp bands were characterized by Pgc-1alpha deletion specific to AD-related brain regions （Pgc-1alphafl/fl：：Calb1-Cre， Pgc-1alpha-/-）. The results of Western blotting showed that the expression of PGC-1α protein in the brain region of conditioned knockout mice was significantly decreased compared with that of wild-type mice （Plt;0.05）. Conclusion： Conditional Pgc-1alpha knockout mice in AD-related pathological brain regions were successfully constructed.

［Key words］" peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α （Pgc-1alpha）; conditional knockout; mouse; Alzheimer′s disease; cortex; hippocampus

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1 alpha，Pgc-1alpha），編碼基因為PPARGC1A，1998年由Spiegelman課題組在小鼠棕色脂肪中首次發(fā)現(xiàn)［1］。作為一種轉錄輔激活因子，Pgc-1alpha不僅可以調控線粒體的生物合成，而且在調控代謝穩(wěn)態(tài)方面起重要作用［2］。PGC-1α主要表達于線粒體含量豐富及氧化代謝活躍的組織，如脂肪、骨骼肌、心臟和大腦等［3-4］。多種神經疾病的發(fā)生與腦組織中PGC-1α表達降低、抗氧化酶減少及活性氧誘導的線粒體功能障礙密切相關［5］，如γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神經元敲除Pgc-1alpha可模擬精神分裂癥的行為學表型［6］。Pgc-1alpha通過調控基因和環(huán)境的相互作用影響神經突觸的可塑性［6］。帕金森病患者尸檢報告結果顯示，其黑質腦區(qū)PGC-1α表達顯著降低，同時伴隨線粒體融合蛋白表達降低［7］。

本課題組前期在對阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）患者腦組織、AD模型動物（APP/PS1）腦組織及APPswe轉染的AD細胞模型的研究中發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)生伴隨PGC-1α表達降低、磷酸化Tau蛋白表達增加以及自噬異常等［8-9］。通過腦區(qū)定點微注射技術及腺相關病毒介導的基因重組技術誘導PGC-1α在AD病變腦區(qū)過表達，結果發(fā)現(xiàn)PGC-1α活化可改善AD模型小鼠的學習、認知障礙以及空間記憶能力下降［10］。由此推測，Pgc-1alpha可能為AD治療的潛在靶點。因此，本研究擬構建AD病變腦區(qū)（皮層、海馬、紋狀體、丘腦）Pgc-1alpha條件性敲除小鼠，以便后續(xù)探討Pgc-1alpha對于AD靶向藥物的研發(fā)。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 抗體" 兔抗小鼠PGC-1α多克隆抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；小鼠抗小鼠GAPDH單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；HRP標記的山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗均購自蘇州ImmunoWay Biotechnology公司。

1.1.2" 實驗動物" Pgc-1alphafl/+雜合子小鼠，品系名稱B6N.129（FVB）-Ppargc1atm2.1Brsp/J，從美國Jackson Lab引進，雌、雄各2只。Calb1-Cre工具鼠，品系名稱B6/JGpt-Calb1em1Cin（P2A-iCre）/Gpt，購自江蘇集萃藥康有限公司（#T006202），雌、雄各2只。遺傳背景均為C57BL/6J小鼠。C57BL/6J野生型小鼠購自江蘇大學實驗動物中心，許可證編號：SCXK 2018-0012。

1.2" 方法

1.2.1" 小鼠飼養(yǎng)" 按照SPF動物飼養(yǎng)標準執(zhí)行，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，小鼠自由攝食和飲水。所有實驗程序均嚴格按照SPF動物管理相關規(guī)定進行。本實驗通過江蘇大學實驗動物管理委員會和倫理委員會批準（UJS-IACUC-AP-2022022525）。

1.2.2" Pgc-1alphafl/+、Pgc-1alphafl/fl小鼠鑒定

1.2.2.1" Pgc-1alphafl/fl小鼠的獲得" Pgc-1alphafl/+小鼠與Pgc-1alphafl/+雜交獲得Pgc-1alphafl/fl純合子、Pgc-1alphafl/+雜合子以及Pgc-1alpha+/+野生型小鼠（圖1）。

1.2.2.2" Pgc-1alpha條件性敲除小鼠基因組DNA提取" 雜交Pgc-1alphafl/+小鼠，取其繁育后出生10 d的子代，提取其基因組DNA：通過剪取1～3 mm腳趾的方式獲得小鼠組織樣本并按一定順序進行編號，從后肢到前肢，從左到右。將小鼠腳趾按照編號依次放入1.5 mL EP管中，待其沉于管底，吸取27 μL組織裂解液和3 μL蛋白酶K至EP管中并混勻。將EP管放置于金屬浴恒溫器中，55 ℃消化3～5 h，12 000 r/min離心30 s，95 ℃金屬浴30 min滅活蛋白酶K，12 000 r/min離心30 s。取上清液，-20 ℃保存，制備PCR的DNA模板。

1.2.2.3" Pgc-1alpha條件性敲除小鼠基因型鑒定" Pgc-1alpha條件性敲除小鼠的3～5號外顯子兩端具有2個LoxP序列，其鑒定引物8041和8491的序列分別為5′-TCCAGTAGGCAGAGATTTATGAC-3′和5′-TGTCTGGTTTGACAATCTGCTAGGTC-3′。PCR條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 3 min；10 ℃保存。PCR產物行2％瓊脂糖凝膠電泳，BioRad凝膠電泳成像儀分析。

1.2.3" Calb1-Cre小鼠基因型鑒定" 通過Cre-LoxP介導的基因重組技術可以特異性刪除兩個LoxP之間的基因片段，在Calb1啟動子作用下，使Cre重組酶在Calb1陽性細胞，如皮層、海馬、紋狀體和丘腦等特異性移除Pgc-1alpha基因片段。Cre鑒定引物為T006202-F1和T006202-R1，二者序列分別為5′-CTTAATGGACTGGTGTAGCAAGCAGT-3′和5′-CTG-CACACAGACAGGAGCATCTTC-3′。PCR條件：95 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；10 ℃保存。PCR產物行2％瓊脂糖凝膠電泳，BioRad凝膠電泳成像儀分析。

1.2.4" 皮層、海馬條件性敲除Pgc-1alpha基因小鼠的繁育

1.2.4.1" Pgc-1alphafl/+：：Calb1-Cre（Pgc-1alpha+/-）小鼠的獲得" 通過Pgc-1alphafl/fl小鼠與Calb1-Cre雜交，獲得Pgc-1alpha基因敲除雜合子小鼠（Pgc-1alphafl/+：：Calb1-Cre）以及Pgc-1alphafl/+雜合子小鼠（圖2）。

1.2.4.2" Pgc-1alphafl/fl：：Calb1-Cre（Pgc-1alpha-/-）小鼠的獲得" 通過Pgc-1alphafl/fl與Pgc-1alphafl/+：：Calb1-Cre小鼠雜交，獲得Pgc-1alpha基因敲除純合子小鼠（Pgc-1alphafl/fl：：Calb1-Cre）、Pgc-1alpha基因敲除雜合子小鼠（Pgc-1alphafl/+：：Calb1-Cre）、Pgc-1alphafl/fl小鼠以及Pgc-1alphafl/+小鼠（圖3）。

1.2.5" 蛋白免疫印跡檢測PGC-1α表達" 提取野生型及Pgc-1alpha-/-小鼠（腦、腎）組織蛋白并測定濃度；上樣量為100 μg/孔，行8% SDS-PAGE；先80 V，跑出濃縮膠升至120 V；300 mA轉膜90 min，將蛋白轉至0.45 μm PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉90 min；TBST洗膜3次，5 min/次；兔抗PGC-1α抗體（稀釋比1∶1 000）、小鼠抗GAPDH抗體（稀釋比1∶5 000）于4 ℃孵育過夜；TBST洗膜5次，5 min/次；HRP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗常溫孵育1 h（稀釋比1∶5 000）；TBST洗膜5次，5 min/次；化學發(fā)光顯色，Image J軟件進行灰度掃描分析。

1.3" 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示。兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" 結果

2.1" Pgc-1alphafl/+、Pgc-1alphafl/fl小鼠PCR鑒定結果

PCR鑒定結果顯示，僅擴增得到一條400 bp條帶的為純合子Pgc-1alphafl/fl小鼠；同時具有360 bp和400 bp兩條帶的為雜合子Pgc-1alphafl/+小鼠，而僅擴增出一條360 bp條帶的為野生型Pgc-1alpha+/+小鼠（圖4）。

1、3：純合子Pgc-1alphafl/fl小鼠（400 bp）；2、5：野生型Pgc-1alpha+/+小鼠（360 bp）；4：雜合子Pgc-1alphafl/+小鼠（同時擴增出360 bp及400 bp條帶）；N：陰性對照

2.2" Calb1-Cre小鼠PCR鑒定結果

提取Calb1-Cre小鼠的基因組DNA，通過引物T006202-F1和T006202-R1鑒定其基因型，PCR鑒定結果顯示，擴增出一條444 bp條帶的為Calb1-Cre小鼠，而未擴增出條帶的為野生型小鼠（圖5）。

1、2、5、6：雜合子Calb1-Cre小鼠（444 bp）；3、4、7、8：野生型小鼠；N：陰性對照

2.3" AD病變腦區(qū)Pgc-1alpha基因條件性敲除小鼠的鑒定

提取小鼠基因組DNA，通過引物8041和8491以及引物T006202-F1和T006202-R1鑒定其基因型。雙重PCR鑒定顯示，同時擴增出444 bp（Cre）及400 bp（目的基因）兩條帶的小鼠為Pgc-1alphafl/fl：：Calb1-Cre，記為Pgc-1alpha-/-；同時擴增出444 bp（Cre）及360 bp和400 bp（目的基因）三條帶的小鼠為Pgc-1alphafl/+：：Calb1-Cre，記為Pgc-1alpha+/-；僅擴增出400 bp（目的基因）一條帶的小鼠為Pgc-1alphafl/fl；僅擴增出360 bp和400 bp（目的基因）兩條帶的小鼠為Pgc-1alphafl/+（圖6）。

1、2：Pgc-1alphafl/-（同時擴增出360 bp及400 bp條帶）；3：Pgc-1alpha基因敲除純合子小鼠Pgc-1alphafl/fl：： Calb1-Cre（Pgc-1alpha-/-）（同時擴增出400 bp及444 bp條帶）；4、7：Pgc-1alpha基因敲除雜合子小鼠Pgc-1alphafl/+：：Calb1-Cre（Pgc-1alpha+/-）（同時擴增出360 bp、400 bp及444 bp條帶）；5、6、8：Pgc-1alphafl/fl（400 bp）；N：陰性對照

2.4" PGC-1α在野生型小鼠及Pgc-1alpha敲除小鼠腦、腎組織中的蛋白表達

蛋白免疫印跡結果顯示，與野生型小鼠相比，Pgc-1alpha-/-小鼠腦中PGC-1α蛋白相對表達水平明顯降低（t=4.623，Plt;0.001），而腎組織勻漿中PGC-1α相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖7。

A：PGC-1α蛋白免疫印跡檢測結果；B：統(tǒng)計分析（n=6）

3" 討論

Lucas等［11］選擇B6.Tg（Nestin-Cre）工具鼠與Pgc-1alphafl/fl小鼠雜交，獲得Pgc-1alpha神經元和膠質前體細胞條件性敲除小鼠；此外，本課題組前期通過雜交Pgc-1alphafl/fl小鼠與Dlx5/6-cre-IRES-EGFP工具鼠，獲得GABA能神經元Pgc-1alpha條件性敲除鼠［6，12-13］。本實驗通過雜交Calb1-Cre工具鼠與Pgc-1alphafl/fl條件性敲除小鼠，獲得Calb1陽性神經元Pgc-1alpha基因敲除小鼠。

研究表明，Pgc-1alpha可通過調控抗氧化酶和解偶聯(lián)蛋白表達，促進線粒體的生物發(fā)生［5，14］。研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)生伴隨PGC-1α表達下調，線粒體動力學及形態(tài)改變，同時伴隨著線粒體腫脹、分布不均、線粒體膜電位下降［8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α過表達調控線粒體動力學，改善AD所伴隨的神經元凋亡及突觸結構損傷［10，15］。然而Pgc-1alpha對AD小鼠線粒體動力學的直接調控機制有待于進一步闡明。本實驗成功構建AD病變腦區(qū)Pgc-1alpha敲除小鼠，為探索Pgc-1alpha調控線粒體動力學異常，改善AD發(fā)生的分子機制提供了可靠的動物模型。

AD患者尸檢結果顯示，其大腦皮質、海馬、某些皮層下核團如杏仁核、前腦基底神經核和丘腦中有大量的淀粉樣沉積及神經纖維纏結［16-17］。Calb1蛋白作為調控Ca2+濃度的一種重要的鈣結合蛋白，主要分布在與認知、記憶密切相關的腦區(qū)—皮層、海馬、紋狀體和丘腦等［18-19］。這些腦區(qū)神經元之所以能夠完成認知、記憶功能主要依賴于Ca2+/鈣調蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）途徑，當Ca2+濃度升高時，內流Ca2+誘導CaMKⅡ磷酸化，繼而影響神經信號傳遞，參與長時程記憶的誘導與維持［20-21］。研究發(fā)現(xiàn)，在人類背外側前額葉聯(lián)合皮層中，tau的病理性改變優(yōu)先影響新皮層中高表達Calb的椎體細胞［22］。此外，與AD腦相似，在老年猴腦中也發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，其椎體細胞Calb表達水平逐漸下降［22］；其潛在的機制與鈣超載相關，即細胞質中Ca2+濃度增加，Ca2+通過誘導tau蛋白磷酸化，經多重、協(xié)同的作用發(fā)揮神經毒性作用，且隨著鈣結合蛋白Calb的大量丟失更為惡化［22］。Calb1作為啟動子，特異性誘導AD病理的易感腦區(qū)—皮層、海馬、紋狀體、丘腦Cre重組酶表達，本實驗通過基因重組技術成功獲得Calb1陽性神經元Pgc-1alpha轉基因小鼠。此外，與野生型小鼠相比，Pgc-1alpha基因敲除小鼠腦區(qū)PGC-1α蛋白表達明顯降低。該Calb1陽性神經元Pgc-1alpha敲除小鼠的構建成功克服了Pgc-1alpha整體敲除子代存活率低（存活率約50%）［23］的缺點。

綜上所述，本實驗成功構建AD病變腦區(qū)（皮層、海馬、紋狀體、丘腦）Pgc-1alpha條件性敲除小鼠。此外，Pgc-1alpha整體敲除鼠的體重下降干擾了AD相關行為學的評價［23］，值得注意的是Calb1作為Cre重組酶的啟動子，驅動Pgc-1alpha在具有AD病理易感性的Calb1陽性神經元特異性敲除，可為探討Pgc-1alpha基因與AD發(fā)病機制的相關性及Pgc-1alpha靶向藥物的研發(fā)提供可靠的動物模型。

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［收稿日期］" 2023-04-07" ［編輯］" 劉星星