應用液相色譜儀-電感耦合等離子體質譜法分析富硒大米中5種硒形態

摘要：通過對流動相檸檬酸濃度、pH、流速等分離條件進行優化，構建HPLC-ICPMS聯用技術平臺，用于精確分析大米樣品中的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亞硒酸根及硒酸根等五種硒形態，實現硒形態的高效識別與定量，為食品安全與營養研究提供科學依據。結果表明，樣品通過HamiltonPRP-X100陰離色譜柱，在流動相為10mmol/L

檸檬酸、pH=4.5，流速為1.0mL/min條件下，5種硒形態在10min內有效分離，在線性范圍內相關系數均gt;0.999，線性良好，經過準確度與精密度驗證，該方法適用大米中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亞硒酸根和硒酸的分析測定。大米中的硒形態主要為SeMet，同時含有少量的SeCys2。

關鍵詞：大米；高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICPMS）法；硒形態

硒為生物體必需微量元素，享有“抗癌衛士”

“心臟保護者”“生命元素”“延年益壽因子”及“自然解毒劑”等學術美譽[1-2]。大量研究表明，硒只有在特定的形態和特定的濃度下才能對人體發揮作用，其利用價值由硒的形態和含量共同來決定的。硒，生物體關鍵微量元素，被譽為抗癌、護心、促進生命活動、延長壽命及自然解毒的學術瑰寶。

文獻報道SeMet[3]生物利用率較高是補硒的最佳形式，SeCys在清除自由基方面發揮著重要作用[4]，具有抵抗細胞膜脂質氧化等功能；MeSeCys在植物體內具有抗腫瘤作用[5]。因此為了更好地評估食品中硒對人健康的影響，對食品中硒含量及硒形態同時進行分析研究非常必要。硒形態檢測主流方法采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（HPLC-ICP/MS），確保學術嚴謹與精準分析[6]、液相色譜-原子熒光光譜法（LC-AFS）[7]。HPLC-ICPMS聯用技術在多種元素形態分析上具有高分離、高靈敏度等優點，因此本文選擇優化流動相的濃度，pH，流速等，建立HPLC-ICPMS對大米中5種硒形態進行分析研究。

1材料與方法

1.1主要儀器

電感耦合等離子體質譜儀采用鉑金埃爾默350X系列，高效液相色譜為沃特世科技2695型，純水儀為美國Milliporemlili-QA10型，分析天平選用北京賽多利斯BSA224S，pH計則為雷磁PHS-25型，均為實驗室高精度分析設備。

1.2試劑

檸檬酸：分析純AR，廣州化學試劑廠；鏈霉蛋白酶E：（CAS#9036-06-0），≥7000U/g，上海源葉生物科技有限公司；硒酸根溶液標準物質，41.5μg/g，編號為GBW10033；中國計量科學研究院提供的標準物質包括：亞硒酸根溶液（GBW10032，濃度42.9μg/g）、

硒代蛋氨酸溶液（GBW10034，濃度39.4μg/g）、硒代胱氨酸溶液（GBW10087，濃度44.2μg/g）及甲基硒代半胱氨酸溶液（GBW10088，濃度34.8μg/g），均具備精確濃度標定。

1.3實驗方法

1.3.1電感耦合等離子體質譜儀

ICP/MS儀器調諧優化參數設定：射頻功率1350W，等離子體、載氣、輔助氣均選用氬氣，流量分別調至16.0、0.92、1.2L/min。選用Seml/z78為定量離子，采用標準模式檢測。采樣錐、截取錐及超級截取錐均配置鎳材質錐體。

1.3.2高效液相色譜儀條件

色譜柱：HamiltonPRPX-100型陰離子交換柱

（250mm×4.1mm，10μm，美國漢密爾頓公司）；柱溫：30℃；洗脫方式：等度洗脫；進樣體積：50μL。

1.3.3樣品制備及前處理

實驗樣品為市場采購的普通大米和富硒大米共7份。

將大米用中藥粉碎機粉碎后過40目尼龍篩后，裝入潔凈的樣品袋內，密封后放入4℃低溫保存。稱取1.0g樣品于15mL離心管中，加入40mg鏈酶蛋白酶E，超純水定容至10mL，渦旋混勻后于37℃水浴超聲提取30min，靜置24h，再于4000r/min離心10min，吸取上清液經0.45μm濾膜過濾，HPLC-ICPMS上機測定。

1.4數據處理

利用Chromera系統鑒定圖譜，結合Excel與GraphPad8.0進行數據分析與圖表繪制，確保學術嚴謹與數據可視化。

2結果分析

2.1不同pH檸檬酸對不同硒形態分離的影響

影響硒形態分離和保留時間的主要因素是流動相的pH。設定檸檬酸濃度為10mmol/L，流速為1.0，考察不同pH對硒形態分離效果的影響。pH在3.8～5.0的五種硒形態的分離效果如圖1所示。隨著pH的升高，硒形態的保留時間和分離效果隨之改變。當流動相pH=3.8

與4.0時，5種硒形態能完全分離，但SeVI的保留時間分別為23.53min和15.58min；當pH增至4.5時，5種硒形態分離度gt;2，完全分離，同時保留時間縮短到

9.29min，峰型及分離度均較佳；當pH超過5.0時，保留時間縮短到8.43min，但SeMeCys和SeIV分離度降低，不能達到基線分離。從分離時間和分離度兩個指標綜合考慮，流動相的pH為4.5時，分離效果最好。

2.2不同濃度檸檬酸對不同硒形態分離的影響

設定檸檬酸pH為4.5，流速為1.0，考察檸檬酸濃度為5、10、15、20mmol/L檸檬酸對5種硒形態的分離效果。經過對比，發現不同濃度的檸檬酸均可實現5種硒形態的完全分離，結果與文獻報道一致[8-10]。隨著檸檬酸濃度的增加，5種硒形態分離所需要的時間有所縮短，但對SeCys2、SeMeCys和SeMet的影響不大，而對硒酸根SeⅥ的保留時間逐漸變短。當檸檬酸濃度為

10mmol/L時，保留時間為10.03min，與15mmol/L檸檬酸的9.58min相差不大，但分離度更好；檸檬酸濃度達20mmol/L時，SeMeCys與SeIV分離度下降。比較各硒形態峰面積隨檸檬酸濃度變化，除硒代蛋氨酸外，SeCys2、SeMeCys、SeVI及SeIV峰面積均隨濃度升高而增大，表明檸檬酸濃度對硒形態分布有顯著影響，見圖2。在一定程度上增強了分離效果，降低了檢出限，提高靈敏度。檸檬酸是一種鹽，會在錐孔附近沉積，降低使用壽命。在保留時間、分離效果的條件下，減少進入ICP/MS的鹽分，選用10mmol/L的檸檬酸作為流動相。

2.3不同流動相流速對不同硒形態分離的影響

在檸檬酸濃度10mmol/L、pH=4.5條件下，探究流速變化（0.8、1.0、1.2mL/min）對硒形態分離效果的影響，記錄并分析五種硒形態在不同流速下的出峰時間。結果顯示，隨著流速的增加，5種硒形態的出峰都逐漸向前移動，硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根和硒代蛋氨酸的保留時間變化不大，但硒酸根的保留時間逐步縮短。流速為1.0mL/min時，保留時間為10.2min。綜合色譜柱的柱效和保留時間，選用1.0mL/min流速進行分析。

2.4方法線性范圍及檢出限

優化色譜條件后，對方法進行了系統驗證。在10～160μg/L濃度范圍內，五種硒形態的相關系數均高于0.999，顯示良好的線性關系。基于3倍基線噪聲定義檢出限，SeCys2、MeSeCys、SeⅣ、SeMet、SeⅥ的檢出限分別為0.100.07、0.25、0.63、0.37μg/L，驗證了方法的靈敏度和準確性。結果見表1。

2.5回收率與精密度

對樣品添加3個不同水平的硒形態混合標準溶液進行加標回收，加標回收率在85%～100%，相對標準偏差在1%～10%，說明本方法準確度好，且重復性較好，滿足要求。

2.6實際樣品測定

利用優化條件后所建的HPLC-ICPMS方法對大米機富硒大米的硒形態進行分析，測定結果見表2。由此可知，富硒大米中的硒形態主要是SeMet；同時含有少量SeCys2，還有部分可能還有SeIV。

3結論

通過優化流動相檸檬酸的pH、濃度和流速，建立了HPLC-ICPMS聯用技術分析大米中5種硒形態的方法，其方法的分離時間短，檢出限低，相關系數在0.999以上，回收率在85%～100%，RSD均不超過10%，結果表明，該方法準確可靠，適用范圍廣，可以較好地實現大米中5種硒形態的定性定量分析。采用該方法分析大米中的5種硒形態，發現富硒大米以SeMet為主，該方法可以更好地了解富硒大米中硒形態的分布規律，為膳食營養提供參考。

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