免疫層析技術在豬常見病毒病快速檢測中的應用

摘 要： 免疫層析技術是一類典型的以抗原抗體特異性免疫反應為基礎的快速診斷技術，以不同材料作為示蹤標記物，具有快速、特異、價格低廉的特點，對豬常見病毒病的現(xiàn)場檢測具有廣泛的應用價值。本文基于免疫層析技術原理，根據(jù)不同的信號表現(xiàn)方式將當前常見的免疫層析技術進行了歸類，詳細介紹了比色型免疫層析技術，熒光型免疫層析技術的代表性標志物，綜述了免疫層析技術在豬常見病毒病快速檢測中的應用，并將不同標記物免疫層析試紙條的優(yōu)點與挑戰(zhàn)進行比較，以期為豬病毒病快速檢測技術的發(fā)展提供思路。

關鍵詞： 免疫層析技術；豬病毒??；快速檢測；臨床應用

中圖分類號：S854.4

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-4900-12

收稿日期：2024-01-02

基金項目：“十四五”重點研發(fā)項目 （2022YFD1801103）；國家自然科學基金項目（32302916）；家畜產(chǎn)業(yè)技術體系北京市家畜創(chuàng)新團隊（BAIC05-2023）；北京農(nóng)學院青年教師科研創(chuàng)新能力提升計劃資助項目（QJKC-2023011）；北京農(nóng)學院科技創(chuàng)新“火花行動”支持計劃（BUA-HHXD2023001）；市屬高校分類發(fā)展都市農(nóng)林特色教師隊伍建設（11000024T000002961733）

作者簡介：蘆烘德（2000-），男，山東濟南人，碩士生，主要從事中藥替抗防控動物疫病研究，E-mail： 1643142874@qq.com

*通信作者：董 虹，主要從事提高機體免疫和抗菌中藥篩選及分子機制研究，E-mail： donghong@bua.edu.cn；何至遠，主要從事中藥替抗防控動物疫病研究，E-mail： hezhiyuan@bua.edu.cn

Application of Immunochromatographic Technique in the Rapid Detection of Common Swine Viral Diseases

LU" Hongde1，2， LIU" Haoyang1，2， GONG" Shimiao1，2， YANG" Zhi1，2， WANG" Yuxuan1，2， WANG" Luhao1，2，

HE" Zhiyuan1，2*， DONG" Hong1，2*

（1.Beijing Key Laboratory of TCVM， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206，" China;

2.Beijing Engineering Research Center of CVM，

Beijing University of Agriculture， Beijing 102206，" China）

Abstract：" Immunochromatography is a typical rapid diagnostic technology based on antigen-antibody-specific immune reaction， using different materials as tracer markers， which is rapid， specific and inexpensive， and has wide application value for on-site detection of common viral diseases in pigs. In this paper， based on the principle of immunochromatographic technology， the current common immunochromatographic techniques were categorized according to different signal manifestation modes， colorimetric immunochromatographic techniques， fluorescent immunochromatographic techniques of the representative markers were introduced in detail， the application of immunochromatographic techniques in the rapid detection of common porcine viral diseases was reviewed， and the advantages and challenges of immunochromatographic test strips with different markers were compared， with a view to providing ideas for the development of rapid detection techniques for porcine viral diseases.

Key words： immunochromatography; swine viral diseases; rapid detection; application

*Corresponding authors：" DONG Hong， E-mail： donghong@bua.edu.cn; HE Zhiyuan， E-mail： hezhiyuan@bua.edu.cn

近年來，我國生豬養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，已成為全球最大的生豬產(chǎn)出國，然而在生豬生產(chǎn)過程中不斷出現(xiàn)“新病突發(fā)、老病復發(fā)”的現(xiàn)象，豬場中反復出現(xiàn)不同程度的混合交叉感染等復雜多變的情況［1］。同時，部分豬場飼養(yǎng)密度大，飼養(yǎng)環(huán)境復雜，衛(wèi)生消毒不徹底，導致豬群的發(fā)病率和死亡率進一步增高。此外，由于生豬及其相關產(chǎn)品的全球貿(mào)易流動日益增多，豬病毒病的傳播途徑增多、傳播范圍擴大，進一步增加了生豬疫病防控的難度。

明確病原是制定防控方案的基礎。目前，臨床上主要根據(jù)病豬的臨床癥狀和病理剖檢變化，初步判斷病原；接著采用病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗、常規(guī)和實時聚合酶鏈式反應等實驗室診斷方法進一步檢測，但這些實驗室診斷方法普遍耗時長，且需要相關儀器設備，便捷性略有不足。而基層獸醫(yī)只有及時發(fā)現(xiàn)并監(jiān)測豬群疫情發(fā)生和發(fā)展情況，才能采取有效手段，降低甚至消除病毒對豬群的影響，保障生豬養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益。因此，快速準確的檢測方法是防控豬病毒病的關鍵。

免疫層析技術（immunochromatographic assay， ICA）基于抗原抗體的特異性結合與層析技術相融合，具有使用簡便、檢測快、成本低和體積小等特點，充分滿足了臨床診斷的即時性檢測（point-of-care testing， POCT）需求［2-3］。近年來，隨著各類新材料、新技術的開發(fā)和完善，免疫層析技術逐漸成為豬病毒病快速檢測應用中的研究熱點，免疫層析試紙條（immunochromatographic test strips， ICTSs）也隨著免疫層析技術的不斷完善而得到快速發(fā)展。本文對免疫層析技術在豬常見病毒病檢測中的應用進行了總結和分析，最后討論了免疫層析技術存在的不足和未來展望，旨在為豬病毒病快速檢測技術的發(fā)展提供參考。

1 免疫層析技術簡介

ICA于20世紀60年代興起，到20世紀80年代逐漸完善，是一種將免疫技術和色譜層析技術相結合的快速檢測技術。基于其開發(fā)的ICTSs主要由樣品墊、結合墊、聚氯乙烯（polyvinyl chloride， PCV）底板以及硝酸纖維素（nitrocellulose， NC）膜等組成（見圖1），其核心檢測原理是待測物溶液通過層析作用在層析條上移動，到達反應區(qū)域后發(fā)生抗原-抗體的特異性結合反應，從而實現(xiàn)特異性免疫檢測。

2 免疫層析技術檢測原理

根據(jù)其檢測原理，以膠體金免疫層析試紙條為例，免疫層析試紙條可分為競爭法和非競爭法（夾心法和間接法）兩類（見圖2）。競爭法大多適用于小分子物質的檢測；夾心法一般適用于大分子物質（如細菌和病毒等）檢測，而間接法主要適用于血清特異性抗體的檢測。

而隨著材料科學的發(fā)展，越來越多具有高敏感性和強表面穩(wěn)定性的納米材料通過標記抗體作為結合墊上裝載的信號標記探針［4］。不同標記材料制備的信號探針在檢測中呈現(xiàn)出不同的信號表現(xiàn)方式及效果，所對應的信號檢測模式也有所不同［5］。探針的信號強度和穩(wěn)定性是影響檢測靈敏度的重要因素［6］。根據(jù)不同的信號表現(xiàn)方式，可將免疫層析技術分為：基于比色信號的比色型免疫層析技術，基于熒光信號的熒光型免疫層析技術以及基于磁信號的磁性免疫層析等。其中，比色型和熒光型免疫層析技術應用最為廣泛。

2.1 比色型免疫層析技術

以比色型材料作為信號探針的免疫層析技術，是目前應用最為廣泛的免疫層析技術，其原理是通過特異性反應，產(chǎn)生可進行判斷的顏色條帶，通過肉眼或者借助讀取儀即可對待測物進行定性及半定量分析。目前常用的比色型納米標記材料主要包括納米金和乳膠微球等。

2.2 熒光型免疫層析技術

為滿足檢測需求，以各種熒光納米材料作為示蹤標記物，對特異性抗體（或抗原）進行標記，再與待測的抗原（或抗體）結合，使用熒光檢測儀檢測其特異性熒光反應的熒光免疫層析技術，也相繼應用于豬常見病毒病的臨床診斷［7-8］。根據(jù)熒光標記物的種類不同，可分為熒光素免疫層析技術、量子點免疫層析技術等，進一步提高了檢測試紙條的特異性和穩(wěn)定性。

3 比色型免疫層析技術在豬病毒病快檢中的應用

3.1 膠體金免疫層析

免疫膠體金技術主要包括斑點免疫金滲濾法（dot immunogold filtration assay， DIGFA）和膠體金免疫層析法（colloidal gold immunochromatographic assay， GICA）兩類，目前在豬病毒病的檢測中使用最為廣泛的當屬GICA［9］。GICA是對抗原（或抗體）物質進行定性或定量（半定量）分析的快檢技術。

目前，針對膠體金免疫層析法存在的局限性，主要從以下三方面進行優(yōu)化：① 抗原-抗體反應體系：研究豬病毒抗原與相應抗體的交互作用，包括病毒抗原的篩選與分離、鑒定病毒抗體等。該方向的研究主要為病毒檢測提供了技術基礎。Bai等［10］通過構建具有天然同源二聚體構象、與抗豬瘟病毒（classical swine fever virus， CSFV）-E2單抗WH303有較高親和力的重組E2胞外蛋白，研制出用于豬瘟抗體檢測的新型免疫層析試紙，其檢測靈敏度是CnC2試紙的4倍。此外，Zhang等［11］基于非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）感染的靶點蛋白P30，研制出雙P30單克隆抗體標記的膠體金試紙條，也顯著提高了檢測特異性。② 膠體金納米顆粒：研究納米顆粒的制備技術，比如其大小、形態(tài)、表面修飾等，以及與病毒抗原標記的相容性和穩(wěn)定性，優(yōu)化檢測系統(tǒng)的性能和靈敏度。Zhou等［12］采用靜電法將辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）和檢測抗體同時固定在納米金顆粒表面，形成納米金探針，顯著增強檢測豬細小病毒的靈敏度。③ 免疫試劑的制備和銜接方式：研究膠體金納米顆粒與病毒抗體間的結合方式和性能，改進免疫試劑的制備工藝，提高檢測的特異性。Ding等［13］將抗截短的衣殼蛋白（capsid protein， CAP）血清經(jīng)辛酸/硫酸銨沉淀（caprylic acid/ammonium sulfate precipitation， CAAS）初步純化后，再用親和色譜柱與dCAP偶聯(lián)純化特異性PAbs，最終合成膠體金-PAbs偶聯(lián)物，從而制備出基于豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2， PCV2）-dCAP多克隆抗體的檢測豬圓環(huán)病毒抗原的GICA，該試紙具有更好的敏感性、特異性和準確性。

3.2 乳膠免疫層析

乳膠免疫層析法（latex immunochromatographic assay，LIA）以乳膠微球為標記材料，相較于膠體金，乳膠微球具有顏色多樣、易于合成和大小均勻等優(yōu)點，便于偶聯(lián)抗體，有較高的靈敏度。胡一帆等［14］以ASFVp30、p54和pK205R蛋白作為檢測線，以兔IgG作為質控線，利用葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A， SPA）和乳膠微球偶聯(lián)作為免疫探針，建立了ASFV抗體檢測乳膠微球免疫層析方法，用該試紙條與商品化ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒分別檢測同一批血清樣本，p30抗體檢測試紙條的符合率為96.8%，p54和pK205R抗體檢測試紙條的符合率達100%。相較于膠體金免疫層析法，乳膠免疫層析法檢測結果更為直觀，顯色更加穩(wěn)定。

比色型免疫層析技術，因其探針制備簡單便捷，成本低，被應用于多種豬病毒的檢測（見表1）。

其他比色型免疫層析技術如膠體碳免疫層析法（colloidal carbon immunochromatographic assay， CICA）是近年來發(fā)展迅速可代替膠體金免疫層析的新型檢測技術，其本身顏色與白色的硝酸纖維素膜形成鮮明色差，對比度高，價格低，顏色信號的讀取更加方便［33］，在以核酸、蛋白質等小分子化合物為靶標分析物的檢測中得到廣泛應用［34］。

4 熒光型免疫層析技術在豬病毒病快檢中的應用

4.1 熒光微球免疫層析

熒光微球免疫層析法（fluorescent microbead immunochromatographic assay， FM-ICA）以熒光微球作為示蹤標記物。常用于FMICA的微球材料主要包括直徑在微米級以下的硅、硒、磁等高分子材料［17］。Li等［35］將截短的ASFV p54蛋白作為抗原與Eu摻雜的熒光微球結合作為示蹤劑，對ASFV抗體的檢測具有很高的特異性。熒光微球可以更好地保護其表面標記或體內結構含有的熒光性物質，增強了熒光的穩(wěn)定性，降低了熒光素染料發(fā)生自淬的可能性；微球體積雖然較小，但富集作用更強，使其可應用的領域和范圍更廣泛［36-37］。

4.2 時間分辨熒光免疫層析

時間分辨熒光免疫層析法（time-resolved fluorescence immunochromatographic assay， TRFIA）是以鑭系元素及其螯合劑等高敏物質作為熒光信號的標記物，通過標記抗原、抗體和蛋白質等物質，檢測熒光波長和發(fā)光時間的一種非同位素免疫檢測技術［38-39］。目前，TRFIA已被用于人和動物各種病毒性傳染病的診斷和篩查。Chen等［40］建立了一種Eu3+螯合物標記檢測抗體的雙抗體夾心TRFIA方法，其檢測ASFV的靈敏度為0.015 ng·mL-1（動態(tài)范圍為0.24～500 ng·mL-1），具有高特異性。此外，使用銪納米顆粒（EuNPs）標記的病毒體抗原和高效價PRV gE單克隆抗體（PRV gE-mAb）開發(fā)的TRFIA，也可用于PRV感染和接種疫苗后豬群的現(xiàn)場鑒別診斷，極大提高了檢測效率［41］。與普通熒光素相比，TRFIA的標記物接觸面小，幾乎不影響與標記物結合的大分子蛋白的空間結構，另外，放射峰窄、熒光壽命長、環(huán)境干擾少等熒光特性，使其特異性和穩(wěn)定性顯著升高，檢測結果更可靠［35，41-42］。

4.3 量子點免疫層析

量子點（quantum dots， QDs）主要是元素周期表中Ⅱ-Ⅵ或Ⅲ-Ⅴ的元素組成的納米顆粒，具有光穩(wěn)定性好、發(fā)射廣譜尺寸可調、吸收光譜寬和熒光強度高等特點，因此不同粒徑的量子點可以通過同一波長的光進行捕獲，實現(xiàn)同時檢測多目標的結果，基于該種光學特性，量子點已被廣泛應用于開發(fā)高靈敏度、多選擇性的免疫層析試紙條［43-45］。此外，QD還被應用于病毒感染成像，Liang等［46］通過鏈霉親和素-生物素親和系統(tǒng)用QD標記豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV），實時追蹤活細胞內的小病毒。

量子點熒光微球免疫層析法（quantum dot fluorescent microsphere immunochromatographic assay， QDFM-ICA）的標記物是通過在高聚物載體吸附或包埋量子點而構成的量子點微球。它不僅兼具量子點熒光強度強、穩(wěn)定性高、生物相容性高、抗漂白能力和熒光壽命長等優(yōu)勢，同時，將量子點裝載后，可有效保護量子點和隔絕量子點對其他生物大分子的毒性。由于單個量子點微球可裝載大量的量子點，進一步提升了單個熒光探針的熒光性能，其作為新的熒光標記物能更顯著提高快速檢測的穩(wěn)定性、靈敏度和定量分析性能［47-49］。張越［50］選用高敏感性的ASFV P30蛋白作為被標記蛋白，建立了量子點熒光微球免疫層析試紙條，與膠體金試紙條進行比較驗證，證明了該方法具有更高的靈敏度。在322份臨床血清樣品檢測中，準確率達98.45%。

為了更為直觀地體現(xiàn)熒光型免疫層析技術在豬病毒病快速檢測中的應用，總結了不同熒光標記材料作為信號探針檢測出的豬常見易感病毒（見表2）。

除上述熒光標記材料外，上轉換熒光納米材料（upconversion nanoparticles， UCNPs）具有長波激發(fā)和短波發(fā)射的特性，能更好地穿透組織，但其發(fā)光效率偏低，制備復雜［5］?；谠摬牧系纳飩鞲衅?，在病毒檢測中具有顯著優(yōu)勢［64］，目前，上轉換免疫層析技術在檢測細菌抗原、藥物殘留方面有廣泛的應用。

5 免疫層析試紙條的比較分析

免疫層析的有效性主要取決于抗原-抗體復合體的結合效率和檢測復合體生成率的能力［65］，同時ICTSs的靈敏度是其應用于臨床檢測的一個關鍵性指標，而不同標記物則是影響其靈敏度的重要因素之一，例如納米顆粒、熒光微球以及量子點等常用標記物各有其優(yōu)點，但它們仍面臨挑戰(zhàn)（見表3）。而基于其他信號的免疫層析技術，如基于磁信號的磁性免疫層析，基于表面增強拉曼散射信號的表面增強拉曼散射免疫層析，因標記材料的特殊性質，在檢測過程中展現(xiàn)出高靈敏度的優(yōu)勢，已被用于檢測獸藥殘留、癌癥標志物等［66-67］。由于制備條件復雜，市售成熟產(chǎn)品的價格高，檢測結果難以讀取，目前還未應用于豬常見病毒病的快速檢測中。

6 總結與展望

隨著現(xiàn)代生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)集約化和規(guī)?；牟粩喟l(fā)展壯大，豬病的發(fā)生頻率、危害程度及傳播范圍也在逐步提高，群發(fā)性疾病尤其是病毒性傳染病嚴重阻礙養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，如何進行豬病毒病的快速檢測和有效防控，已經(jīng)成為當前生豬產(chǎn)業(yè)的重中之重。通過臨床癥狀和流行病學往往難以對豬病毒病進行準確判定，同時病毒變異快，且大多數(shù)豬病毒病無特異性疫苗或藥物，因此，快速檢測確定豬病毒病的類型、病因，及時采取合理的防控措施，對于阻斷豬病毒病的傳播和進行病豬的及時救治具有重要意義。當前，相較于實驗室診斷方法，免疫層析技術雖便捷，快速，可用于大批量樣本的篩查，但其靈敏度低，因存在主觀差異性導致假陽性率和假陰性率仍較高。其結果可以用于初篩檢測，但不能作為確診依據(jù)［74］。期望隨著新型標志物（表面增強拉曼散射材料、納米磁珠等）的開發(fā)、特異性識別元件（抗體、分子印跡聚合物、適配體等）的制備以及一體化檢測設備的研發(fā)，能開發(fā)出更便捷、靈敏、廉價的豬病毒病快檢技術。

總體而言，隨著免疫層析技術的應用和普及，極大地降低了基層或經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)豬病毒病的檢測難度，在豬發(fā)病早期階段可進行快速地檢測，盡早采取科學有效的防治措施，對保障生豬養(yǎng)殖戶的效益具有重大作用。

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（編輯 白永平）