基因編輯技術在食源性微生物檢測中的應用研究進展

摘 要：食源性微生物污染嚴重威脅人類健康，而傳統檢測方法如培養法、生化檢測法、免疫學檢測法和分子生物學檢測法存在一定局限性。近年來，基因編輯技術的快速發展為食源性微生物檢測帶來了新機遇。與傳統方法相比，基因編輯技術在靈敏度、特異性和檢測速度上表現出優勢，可檢測低拷貝數的目標核酸、精準識別目標微生物且耗時短。本文綜述了食源性微生物的傳統檢測方法、新型基因編輯技術及其應用前景。

關鍵詞：基因編輯技術；食源性微生物；食品安全

Research Progress on the Application of Gene Editing Technologies in the Detection of Foodborne Microorganisms

Abstract： Foodborne microbial contamination poses a serious threat to human health， and traditional detection methods such as culture methods， biochemical detection methods， immunological detection methods， and molecular biological detection methods have certain limitations. In recent years， with the rapid development of gene editing technology， new opportunities have emerged for the detection of foodborne microorganisms. Compared with traditional methods， gene editing technology has advantages in sensitivity， specificity， and detection speed， capable of detecting low copy number target nucleic acids， accurately identifying target microorganisms， and being time-efficient. This article mainly reviews the traditional detection methods for foodborne microorganisms， new gene editing technologies， and their application prospects.

Keywords： gene editing technology; foodborne microorganisms; food safety

食源性微生物污染是全球公共衛生面臨的重大挑戰之一，可引起食物中毒、腸道感染等多種疾病，嚴重威脅人類健康。食源性致病因子包括細菌、病毒、真菌、寄生蟲、立克次體和產毒藻類等，其中細菌是主要的危害因素。常見的食源性細菌包括沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌、彎曲桿菌、弧菌、耶爾森氏菌和志賀氏菌等，主要存在于肉類、禽類、海鮮、蛋類和蔬菜等多種食品中[1]。據世界衛生組織統計，全球每年因食用受污染食品而患病的人數眾多。因此，快速、準確地檢測食源性微生物對于保障食品安全至關重要。雖然傳統的檢測方法在食源性微生物檢測中發揮了重要作用，但隨著科技的發展，其局限性日益凸顯。近年來，基因編輯技術的出現為食源性微生物檢測帶來了新的機遇和突破[2]。

1 傳統檢測方法

1.1 培養法

培養法是通過將樣品接種到特定的培養基上，在適宜的溫度、濕度和氣體條件下培養一定時間，觀察微生物的生長情況，從而對微生物進行鑒定和計數。此方法主要基于不同微生物對營養物質、溫度、pH值、氧氣等生長條件有不同的要求，通過利用這些微生物的生長特性差異，選擇性地培養和檢測目標微生物。培養法可以直接觀察微生物的生長情況，并可進一步開展生化和藥敏試驗等分析。然而，該方法檢測周期較長，尤其是對于一些生長緩慢的微生物（如結核分枝桿菌），可能需要數周甚至數月才能得到檢測結果。

1.2 生化檢測法

生化檢測法是通過檢測微生物在代謝過程中產生的特定生化反應來鑒定微生物，主要基于細菌在代謝糖類時會使培養基pH值下降，通過加入酸堿指示劑（如溴甲酚紫）并根據顏色變化差異進行檢測。該方法需要先對微生物進行培養，因此仍然存在檢測周期較長的問題。此外，生化反應可能受到多種因素的影響，如培養基成分、培養條件等，可能導致結果出現假陽性或假陰性。

1.3 免疫學檢測法

免疫學檢測法是利用抗原與抗體的特異性結合來檢測食源性微生物。常見的免疫學檢測方法包括酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫熒光技術、乳膠凝集試驗等。目前，常用的免疫學檢測法主要是ELISA，該方法是將已知的抗體或抗原固定在固相載體表面，加入待檢測樣品，若樣品中含有相應的抗原或抗體，則會與固相上的抗體或抗原結合，然后加入酶標記的第二抗體或抗原，通過酶催化底物顯色反應來檢測抗原-抗體復合物的存在。免疫學檢測法具有較高的特異性和靈敏度，可以快速檢測出微量的微生物抗原或抗體。然而，該方法需要高質量的抗體，且抗體的制備過程復雜且成本較高。此外，某些微生物可能存在抗原變異的情況，導致檢測結果不準確。

1.4 分子生物學檢測法

分子生物學檢測法是通過直接檢測微生物的核酸（DNA或RNA）來鑒定微生物。常見的方法包括聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）及其衍生技術（如實時熒光定量PCR、多重PCR等）[3]。PCR是一種體外擴增DNA的技術，以目標DNA為模板，在耐熱DNA聚合酶、引物、dNTP等存在的條件下，通過高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個步驟的循環，使目標DNA大量擴增。實時熒光定量PCR則是在PCR的基礎上引入熒光標記物，實時監測PCR反應過程中產物的積累量，從而實現對目標基因的定量分析。分子生物學檢測法具有極高的靈敏度，可以檢測到極少量的微生物核酸，從而能夠快速檢測到微生物。然而，該方法對儀器設備和實驗環境要求較高，操作需要專業人員，并且容易受到污染，導致假陽性結果。此外，一些復雜的樣品，如含有大量雜質或抑制物的食品樣品，可能會干擾核酸的提取和檢測。

2 基因編輯技術

基因編輯技術是一類能夠在基因組水平上修改DNA序列的技術。近年來，基因編輯技術得到飛速發展，推廣應用到了生物、醫學、農業以及食品安全等領域，在疾病篩查、動植物改造及病原微生物檢測等領域發揮著巨大的作用。主要的基因編輯工具包括鋅指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases，ZFNs）、轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（Transcription"Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）和成簇規律間隔短回文重復序列/CRISPR相關蛋白9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Protein 9，CRISPR/Cas9）。目前，基因編輯技術已廣泛應用于疾病篩查、癌癥基因監測和食源性致病菌檢測等領域[4]。

2.1 ZFNs在食源性微生物檢測中的應用

ZFNs由鋅指蛋白結構域和核酸內切酶Fok Ⅰ結構域組成。鋅指蛋白結構域可以識別特定的DNA序列，通過設計不同的鋅指蛋白組合，可以特異性地識別并結合目標DNA序列。核酸內切酶結構域則具有切割DNA的功能，當鋅指蛋白與目標DNA結合后，核酸內切酶在特定位置切割DNA雙鏈，使得雙鏈斷裂（Double-Strand Break，DSB）[5]。對于病原微生物檢測，可設計ZFNs識別病原微生物基因組中的保守序列，當病原微生物核酸存在于樣本中時，ZFNs與之結合并切割，隨后可通過檢測切割產物或相關的信號變化來確定病原體的存在。與傳統的病原體培養和檢測方法相比，基于ZFNs的檢測方法可以直接對食源性微生物核酸進行操作，能在較短時間內得到檢測結果。此外，該方法可精準識別食源性微生物的特異基因，有效區分不同種類的微生物，避免因其他微生物或宿主核酸的干擾而出現假陽性，有助于及時、高效、精確診斷。

2.2 TALENs在食源性微生物檢測中的應用

TALENs是一種可對特定DNA序列進行編輯的工具，由轉錄激活因子樣效應物（Transcription Activator-Like Effector，TALE）和核酸內切酶Fok Ⅰ組成。TALE依據目標基因的序列進行設計，其氨基酸序列與目標DNA堿基之間存在特定的對應關系，能夠精確地識別目標基因的特定序列，Fok Ⅰ則在識別位點發揮切割作用[6]。對于食源性微生物檢測，可針對微生物的毒力基因、耐藥基因或標志性基因等特定基因設計TALENs。當TALENs識別并結合到目標微生物的特定DNA序列后，Fok Ⅰ發揮切割作用。在切割反應發生時，通過檢測熒光信號的變化來確定目標微生物的存在。TALENs能夠高度特異性地識別目標食源性微生物的基因序列，這一特性使得其在復雜的食品樣本中能夠準確區分目標微生物與其他微生物或食品成分中的非靶DNA，從而有效降低假陽性率。此外，TALENs可以檢測到較低水平的目標微生物。即使微生物含量較低且處于初始污染階段，TALENs也能檢測到其特定基因的存在，有助于盡早發現食品微生物污染問題，保障食品安全。

2.3 CRISPR/Cas9在食源性微生物檢測中的應用

CRISPR-Cas系統是一種來源于細菌和古細菌的適應性免疫系統，該系統由單導向RNA（single-guide RNA，sgRNA）、Cas相關蛋白兩部分組成。sgRNA能夠特異性地識別目標DNA序列；Cas相關蛋白能夠在sgRNA的引導下切割目標DNA序列。通過設計特定的sgRNA，CRISPR/Cas系統能夠精確地識別并切割目標微生物的DNA序列，并結合熒光報告基因或其他檢測方法來確認目標微生物的存在，從而實現對目標微生物的檢測[7]。操作步驟主要包括設計并合成特異性的sgRNA，使其能夠識別目標微生物的DNA序列；表達Cas相關蛋白，可以是天然的Cas相關蛋白，也可以是經過改造的Cas相關蛋白，如dCas12，以提高系統的特異性和安全性；將sgRNA和Cas蛋白引入樣品中，使其與目標微生物的DNA序列結合并切割。CRISPR-Cas系統在檢測食源性微生物時具有極高的靈敏度，可以檢測到低至幾個拷貝數的目標核酸。

3 基因編輯技術的應用前景與挑戰

3.1 應用前景

隨著基因編輯技術的不斷發展與成熟，有望開發出基于基因編輯技術的即時檢測（Point-of-Care Testing，POCT）設備，實現食源性微生物的現場快速檢測。例如，可開發基于CRISPR-Cas系統的試紙條檢測方法，將基因編輯反應與可視化檢測相結合，可以在短時間內得到檢測結果，適用于食品加工現場、農貿市場等場所的快速檢測。此外，通過設計多種特異性的基因編輯工具，可以實現對多種食源性微生物的同時、及時、快速檢測。例如，利用多重CRISPR-Cas系統，實現在一個反應體系中檢測多種常見的食源性致病菌，提高檢測效率，減少檢測時間和成本。

3.2 面臨的挑戰

目前，基因編輯技術在實際應用中仍存在脫靶效應的問題，即編輯工具可能會錯誤地切割非目標DNA序列。在食源性微生物檢測中，脫靶效應可能會引起假陽性結果，影響檢測的準確性。這就需要進一步改進基因編輯技術，提高其特異性，降低脫靶風險。此外，現階段基因編輯技術在食源性微生物檢測中的應用還缺乏統一的標準和規范。不同實驗室采用的基因編輯方法和檢測流程可能存在差異，導致檢測結果的可比性較差。因此，需要制定相關的標準和指南，確保基因編輯技術在食源性微生物檢測應用中的可靠性和穩定性。

4 結語

基因編輯技術為食源性微生物檢測帶來了新的思路和方法，在靈敏度、特異性和檢測速度等方面具有明顯優勢。然而，其在應用過程中也面臨著脫靶效應和技術標準化等挑戰。隨著技術的不斷發展和完善，基因編輯技術有望在食源性微生物檢測領域發揮更重要的作用，為保障食品安全提供更有力的支持。

參考文獻

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