慢性HBV感染者組織學免疫耐受狀態無創診斷指標及相關模型的建立與評價

摘要：目的"" 慢性HBV感染自然史多有組織學意義上的免疫耐受狀態，免疫耐受狀態一旦打破，需立即啟動抗病毒治療。通過對免疫介導的肝損傷與HBV病毒學指標進行相關性分析，精準定義肝組織學免疫耐受狀態的患者。方法以2010年1月—2022年12月中國人民解放軍總醫院第五醫學中心、天津市第二人民醫院、上海瑞金醫院和浙江省臺州醫院收集的HBeAg陽性且HBV DNAgt;2×106 IU/mL未經抗病毒治療的577例慢性乙型肝炎患者為研究對象。通過肝組織活檢確定肝損傷情況，檢測血清ALT、AST水平及病毒學指標。分析現有各大指南無創指標特別是HBV DNA載量界值不同的情況下，肝組織免疫耐受狀態患者所占比例。進一步嘗試以與肝組織免疫病理損傷程度相關性消失時的血清HBV DNA為新的閾值，聯合多因素指標建立組織學免疫耐受狀態的診斷模型。計量資料兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料兩組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman法進行相關性分析。采用二元Logistic回歸分析建立多因素診斷模型，并應用受試者工作特征曲線下面積（AUC）明確各模型的診斷效能，AUC的比較采用Z檢驗。結果""""" 中國2022版、EASL 2017版、AASLD 2018版、APASL 2015版慢性乙型肝炎防治指南病毒學無創指標所鑒定出的免疫耐受狀態患者中符合本研究定義（HBV DNAgt;2×106 IU/mL）的組織學免疫耐受狀態的比例分別為47.0%、38.5%、36.0%、44.6%，均未超過50%。當將血清HBV DNA閾值升至gt;2×108 IU/mL時，盡管免疫介導的肝損傷與HBV DNA相關性消失（r=-0.029，P=0.704），此時肝組織免疫耐受狀態患者所占比例也僅為52.0%。在血清HBV DNAgt;1×108的HBeAg陽性患者隊列（n=251）中，顯著肝損傷組（n=140）和無顯著肝損傷組（n=111）HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT及AST水平比較，差異均有統計學意義（P值均lt;0.05），進一步多因素二元Logistic回歸分析結果顯示，AST、HBV DNA、HBeAg是患者組織學免疫耐受狀態的獨立影響因素（P值均lt;0.05）。根據以上指標并結合臨床，建立預測模型：logit（P）=1.424-0.028×AST，AUC為0.730，AST最佳臨界值為30.5 U/L，敏感度和特異度分別為52.8%、84.1%。進一步使用浙江省臺州醫院接受肝穿刺活檢的238例成人慢性HBV感染者作為驗證隊列，驗證結果顯示，本研究建立的模型預測效能優于AST/ALT、FIB-4、APRI（AUC分別為0.698、0.555、0.518、0.373，P值均lt;0.05）。結論在HBV DNAgt;2×108 IU/mL的HBeAg陽性慢性HBV感染者中，ASTgt;30.5 U/L時，提示組織學免疫耐受狀態可能被“打破”。

關鍵詞：乙型肝炎，慢性；免疫耐受；診斷

HBV感染是慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和肝細胞癌發生的主要致病因素。已知嗜肝性的HBV并不具有直接的致感染肝細胞病變效應，這意味著慢性HBV感染的肝損傷主要是宿主免疫系統控制清除感染病毒肝細胞造成的免疫病理損傷[1]，即慢性HBV感染疾病進展及轉歸是病毒持續感染與宿主抗病毒免疫相互作用的結果。1985年，我國臺灣學者[2]發現，以母嬰垂直傳播為主要傳播方式的慢性HBV感染者疾病進程早期多表現為高病毒復制和輕（無）肝臟炎癥的特點，并據此引入了“宿主免疫”的概念，將慢性HBV感染自然進程劃分為免疫耐受期（HBeAg陽性慢性感染）、免疫激活或免疫清除期（HBeAg陽性CHB）、免疫控制下的非活動攜帶期（HBeAg陰性慢性感染）和再活動期（HBeAg陰性CHB），并被各大指南沿用至今[1]。

然而，值得注意的是，盡管自然史分期曾采用免疫學概念來描述，但一直缺乏直接的免疫學證據和指標來支持對各期的界定。現有的各大指南對于慢性HBV感染者的“免疫耐受期”的定義是以患者肝組織病理學界定的，即在HBeAg陽性患者中，肝組織無明顯炎癥壞死和纖維化，反映肝損傷的生化指標低于正常值且HBV DNA處于高水平狀態。

真實的“免疫耐受”狀態是否存在以及如何界定尚有爭議。Kennedy等[3]收集不同年齡“免疫耐受期”患者的T淋巴細胞，發現兒童和青少年具有更多的HBV特異性T淋巴細胞；Mason等[4]的研究認為慢性HBV感染自然史中并不存在“免疫耐受期”，更傾向于描述為“高病毒復制，低炎癥損傷”時相。因為處在“免疫耐受期”的慢性HBV感染者與HBeAg陽性CHB患者以及HBeAg陰性CHB患者一樣，均能檢測到肝臟炎癥、HBV整合以及整合肝細胞克隆性細胞集落，同時伴隨著HBV特異性細胞免疫反應及肝內免疫細胞浸潤。本實驗室前期研究[5]也發現，HBsAg宮內暴露的小鼠對乙型肝炎疫苗刺激激活了更強的免疫應答且具有抗-HBs免疫記憶。從免疫學定義來講，HBV“免疫耐受期”患者應不存在HBV特異性細胞免疫、體液免疫，甚至也不存在固有免疫識別反應⑹，依照這一定義，CHB疾病進展中是否存在真正的“免疫耐受期”值得商榷。

然而，Milich等[7]持不同意見，認為“高復制低炎癥”是描述性的，“免疫耐受”解釋了高復制低炎癥的機制，且由于慢性HBV感染疾病的進展主要是HBV特異性免疫清除感染肝細胞導致的，因此在命名疾病的各個階段時，仍有必要繼續采用免疫學術語。Liaw等[8]也認為，從臨床角度看“免疫耐受”仍然是正確的。由于真正免疫耐受狀態的慢性感染者肝組織往往沒有明顯的肝損傷，且通常對抗病毒治療缺乏有效的應答，一般認為此時并不亟須啟動抗病毒治療。因此準確地甄別處于“免疫耐受”狀態的患者仍有其臨床意義。

實驗室前期臨床隊列研究[9]發現，在HBeAg陽性且HBV DNAgt;2×106 IU/mL的慢性HBV感染者中，其HBV病毒學指標如HBV DNA、qHBsAg及HBeAg定量（或半定量）水平與患者肝臟免疫介導的損傷程度呈負相關，顯示此時宿主免疫耐受狀態已被打破，并能夠有效清除感染肝細胞和出現HBV DNA水平的下降。因此，應采用更高的HBV DNA水平來輔助界定免疫耐受狀態。

ALT和AST雖可在一定程度上反映肝細胞損傷程度，但因其受多種因素影響，特異性差且各大指南正常范圍標準不一，在我國《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》[10]中指出，慢性HBV感染者1年內連續隨訪3次且每次至少間隔3個月ALT/AST正常才能定義為ALT/AST持續正常。

本研究中，因考慮到ALT和AST的非特異性以及其易受許多非病毒學指標的影響，所以嘗試以HBeAg陽性、高病毒復制、輕（無）炎癥損傷為特征定義組織學意義上的“免疫耐受”狀態，有助于鑒別肝組織學意義上的“免疫耐受”狀態，實現此類患者的精準診療。

1"""" 資料與方法

1.1" 研究對象"""""" 從實驗室既往研究隊列中納入2010年1月—2022年12月中國人民解放軍總醫院第五醫學中心、天津市第二人民醫院、上海瑞金醫院和浙江省臺州醫院HBeAg陽性、HBV DNAgt;2×106 IU/mL的慢性HBV感染者為研究對象。納入標準：（1）年齡≥18周歲者；（2）HBsAg陽性≥6個月者；（3）未接受抗病毒治療者；（4）接受肝組織穿刺檢查有明確病理診斷者。排除標準：（1）合并有其他病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎以及非酒精性脂肪性肝炎等導致肝損傷者；（2）合并心、腦、腎等其他重要臟器功能衰竭或者惡性腫瘤者；（3）女性妊娠、哺乳者。

1.2" 血液生化、病毒學指標檢測""""" 收集入組患者性別、年齡等人口學資料；血液生化指標應用全自動生化分析儀進行檢測；HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc定量應用化學發光法檢測（ARCHITECTi2000SR），HBsAg檢測下限為0.05 IU/mL；HBV DNA病毒載量使用COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan48進行檢測，檢測下限為20 IU/mL。

1.3" 肝組織活檢病理檢測"" 肝活檢組織經4%甲醛液固定，石蠟包埋，連續5 μm組織切片，常規進行HE、Masson染色，顯微鏡下觀察炎癥、纖維化程度及病變特點，根據《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》[10]對肝組織炎癥活動度（GO～G4）和纖維化程度（SO～S4）進行分級。顯著肝損傷定義為經病理學診斷存在中度以上肝臟炎癥（≥G2）和/或中度及以上纖維化（≥S2）。

1.4" 統計學方法"" 使用SPSS 22.0和GraphPad 9.0進行統計學分析。非正態分布的計量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料兩組間比較采用χ2檢驗。HBV DNA和HBsAg定量數據進行對數轉換。采用Spearman法進行相關性分析。采用二元Logistic回歸分析建立多因素診斷模型，并應用受試者工作特征曲線（ROC曲線）下面積（AUC）明確各類模型診斷效能。AUC的比較采用Z檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2"""" 結果

2.1" 一般資料"""""" 本研究共納入4家醫院577例符合入組條件的未經抗病毒治療的慢性HBV感染者，其中HBV DNAgt;2×107 IU/mL有438例，HBV DNAgt;1×108 IU/mL有251例，HBV DNAgt;2×108 IU/mL有171例。577例患者中，男329例，女248例；平均年齡33歲。入組患者根據肝活檢結果分為存在顯著肝損傷組（n=369）和無顯著肝損傷組（n=208），基本臨床特征及病毒學指標分布情況見表1。已經打破免疫耐受的肝組織存在顯著肝損傷（≥G2和/或≥S2）患者的ALT和AST水平顯著高于無顯著肝損傷患者，同時，病毒學指標顯著低于無顯著肝損傷的患者（P值均lt;0.05）。

2.2" 根據各大指南無創指標計算組織學免疫耐受期患者所占比例""""" 本研究分析了除去ALT/AST之外的其他無創病毒學指標對組織學免疫耐受狀態患者的診斷效能。表2是分別依據各大CHB防治指南病毒學無創指標所鑒定出的免疫耐受狀態患者中符合本文定義的組織學免疫耐受狀態的比例。結果顯示，即使提高HBV DNA至108 IU/mL（Mason等[4]2016年在Gastroenterology發表文章入組的免疫耐受期患者HBV DNA平均值為108 IU/mL），組織學免疫耐受狀態患者所占比例（44.6%）也不超過50%。

2.3" 確定與肝組織炎癥活動度出現負相關性消失時的HBV DNA上限閾值 當HBeAg陽性患者血清HBV DNA水平升高至2×108 IU/mL時，其水平與肝炎活動程度相關性消失（r=-0.029，P=0.704）（表3），符合組織學免疫耐受狀態的比例為52.0%（89/171），與HBV DNA高于2×106 IU/mL（36.0%，208/577）、2×107 IU/mL（47.0%，164/349）和1×108 IU/mL（44.6%，112/251）相比，僅略有升高。這可能是因為，在這些HBV DNAgt;2×108 IU/mL的患者中，其HBsAg，特別是HBeAg仍和肝臟炎癥活躍度及反映肝臟炎癥損傷的生化指標有著不同程度的有統計學意義的負相關性（表3），提示部分患者免疫耐受狀態已被“打破”。

2.4" 多指標聯合尋找確定組織學免疫耐受狀態患者的最佳診斷模型"" 考慮到即使將HBV DNA閾值升高至2×108 IU/mL，仍有相當比例（48.0%，82/171）的慢性HBV感染者已經存在明顯的肝臟炎癥損傷，因此，本研究試圖在此基礎上聯合其他無創指標以提高組織學免疫耐受狀態患者的診斷準確度。

在血清HBV DNAgt;1×108的HBeAg陽性患者隊列（n=251）中，顯著肝損傷組（n=140）與無顯著肝損傷組（n=111）比較，ALT、AST、HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平比較均存在統計學差異（P值均lt;0.05）（表4）；進一步二元Logistic回歸分析結果顯示，AST、HBeAg、HBV DNA是影響患者組織學免疫耐受狀態的獨立影響因素（P值均lt;0. 05）（表5）。考慮到HBeAg是半定量指標，且大部分臨床醫生重點關注的是HBeAg陰/陽性問題，故只將AST、HBV DNA納入建立模型：logit（P）=-9.315-0.032×AST+1.236×log10 HBV DNA，AUC為0.800，通過約登指數得出的最佳臨界值所對應的敏感度和特異度分別為94.3%、55.0%（圖1）。

由于HBeAg陽性患者血清HBV DNA水平升高至2×108 IU/mL時，其水平與肝炎活動程度相關性消失（P=0.704），同時考慮到臨床可操作性，在血清HBV DNAgt;2×108 IU/mL的患者中，將AST單獨納入二元Logistic回歸分析，回歸方程模型：logit（P）=1.424-0.028×AST，AUC為0.730（圖2），模型預測效果良好，通過約登指數得出AST最佳臨界值為30.5 U/L，敏感度和特異度分別為52.8%、84.1%。因此，在血清HBV DNAgt;2×108 IU/mL的HBeAg陽性患者中，若ASTgt;30.5 U/L，應考慮患者的組織學免疫耐受狀態已經被“打破”。

2.5" 不同診斷模型預測效能的比較"" 目前針對免疫耐受期的無創診斷模型主要包括AST/ALT、FIB-4和APRI[14]。進一步使用浙江省臺州醫院接受肝穿刺活檢的238例成人慢性HBV感染者作為驗證隊列，在血清HBV DNAgt;2×108 IU/mL的HBeAg陽性患者中，將ALT/AST、FIB-4、APRI與本研究建立的診斷模型進行比較，結果顯示，本研究建立的模型預測效能優于AST/ALT、FIB-4、APR（AUC分別0.698、0.555、0.518、0.373，P值均lt;0.05）（圖3）。

3"""" 討論

由于曾有采用配對肝活檢的研究數據顯示，免疫耐受期的患者5年內肝損傷的進展微乎其微[15]。因此，現階段各大指南[10-13]對“免疫耐受期”患者的管理建議是對組織學診斷的真正“免疫耐受期”患者不推薦進行抗病毒治療。但目前國際上對真正的免疫耐受期的定義尚未達成共識，也缺乏有效的鑒定手段。

本研究首先提出了“組織學免疫耐受狀態”的建議，在現階段缺乏有效的評判免疫狀態的免疫學指標的現實下，在臨床實踐中定義患者是否處于“組織學免疫耐受狀態”可能更加實用。因為一方面，真正的組織學免疫耐受階段的患者疾病進展風險小，且即使開展抗病毒治療，其病毒學應答也不令人滿意；而另一方面，在Kennedy等[3]和Mason等[4]按現行的HBeAg陽性、高病毒復制且ALT水平正常等指標納入其研究的免疫耐受期患者中，相當比例患者的肝組織已經存在顯著肝損傷，不再是真正意義上的“免疫耐受期”。不僅如此，這些患者的肝組織往往有相當數量的、攜帶了HBV DNA 整合片段的細胞克隆集落。其表達HBsAg的能力不僅使CHB難以實現臨床治愈，伴隨著增殖的突變積累也增加了患者未來肝細胞癌發生的風險。因此，進一步明確免疫耐受患者的定義，并嘗試建立甄別符合真正免疫耐受狀態的慢性HBV感染者的手段極為重要。

肝活檢是評估免疫介導的肝損傷程度及是否啟動抗病毒治療的金標準，但因有創性難以常規開展。本研究在實驗室前期工作的基礎之上，嘗試采用不同的無創指標在HBeAg陽性、HBV DNAgt;2×106 IU/mL的慢性HBV感染者中篩選出“組織學免疫耐受狀態”的患者。然而，盡管發現當HBV DNAgt;2×108 IU/mL，免疫介導的肝損傷與HBV DNA相關性消失，但由于其與HBsAg/HBeAg的負相關性依然存在，以致由此定義的“組織學免疫耐受狀態”者中存在明顯肝組織學損傷的比例仍高達48%。因此有必要增加新的無創指標來進一步精準診斷。

本研究發現以AST異常升高（gt;30.5 U/L）輔助研判慢性HBV感染者的“組織學免疫耐受狀態”是否被“打破”，可在HBeAg陽性、HBV DNAgt;2×108 IU/mL的慢性感染者中鑒別組織學免疫耐受狀態的患者，這將有助于HBeAg陽性且HBV DNA高水平患者的臨床管理。

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