黏細菌A96-1產埃博霉素B的鑒定及其發酵培養基優化

摘要：目的 篩選埃博霉素B產生菌，并優化發酵培養基，以提高發酵產量。方法 利用高效液相色譜法和薄層色譜法對次級代謝產物進行分析鑒定，從實驗室保存的菌庫中篩選出埃博霉素B產生菌，再通過單因素實驗和正交試驗優化發酵培養基成分。結果 獲得1株產埃博霉素B的黏細菌A96-1，采用優化后的發酵培養基：馬鈴薯淀粉6 g/L，玉米漿干粉2 g/L，CaCl2" 2 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，微量元素溶液1 mL/L，樹脂添加量2%，埃博霉素B發酵產量為251.4 mg/L，較優化前提高了3.83倍。結論 通過菌株篩選和優化的培養基大幅提高了埃博霉素B的產量，為今后其資源開發利用及產業化提供參考。

關鍵詞：黏細菌；埃博霉素B；發酵優化；薄層層析色譜法；正交實驗

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Identification of epothilone B produced by Myxobacterium A96-1

and optimization of fermentation medium

Abstract Objective To improve the production of epothilone B by screening of epothilone producing strains and optimizing the fermentation medium. Methods The secondary metabolites were identified by HPLC and TLC， and the epothilone B producing bacteria were screened out from the culture collection in our laboratory. The fermentation medium components were optimized by a single factor experiment and an orthogonal experiment. Results A Myxobacterium A96-1 producing epothilone B was obtained. The optimized fermentation medium consisted of potato starch （6 g/L）， corn slurry dry powder （2 g/L）， CaCl2 （2 g/L）， MgSO4·7H2O （3 g/L）， trace element solution （1 mL/L）， resin addition （2%）. Under the conditions， the fermentation yield of this strain of epothilone B was 251.4 mg/L， which was 3.83 times higher than before optimization. Conclusion The production of epothilone B was significantly increased through strain screening and optimized medium， which provided a reference for the future resource development and utilization and industrialization of epothilone B.

Key words Myxobacteria; Epothilone B; Fermentation optimization; Thin layer chromatography; Orthogonal experiment

埃博霉素是一類具有抗腫瘤等生物活性的次級代謝產物，是十六元大環內酯類聚酮化合物，在細胞有絲分裂過程中與β-微管蛋白結合，導致細胞凋亡或程序性死亡，是微管穩定的強效誘導劑[1-2]。該化合物家族中最突出的成員埃博霉素B（圖1）已在美國通過Ⅲ期臨床試驗，英國、西班牙和希臘正在進行用于卵巢癌治療的Ⅲ期臨床試驗，其衍生物伊沙匹隆（ixabepilone）已被美國食品藥品監督管理局批準作為單一療法或與卡培他濱聯合治療局部晚期或轉移性乳腺癌[3]。第二種半合成埃博霉素B衍生物BMS-310705是通過甲基噻唑側鏈C21上的氨基取代羥基生成的，其水溶性比埃博霉素B高10倍[4-5]。第一個全合成的第三代埃博霉素B衍生物是沙戈匹隆（sagopilone）。這種藥劑在體外相對于其他埃博霉素能夠表現出更大的效力，即使在耐多藥癌細胞中也保持活性。與紫杉醇不同，沙戈匹隆已被證明可以穿過血腦屏障，表明有可能滲透到中樞神經系統[6-7]。

埃博霉素的生產方法有化學合成法和生物合成法。埃博霉素的化學合成步驟冗長，產率低，實現產業化有一定的難度[1]，所以現今主要應用的方法是生物合成法。生物合成法主要是利用黏細菌發酵生產埃博霉素。國際上通過黏細菌發酵合成埃博霉素B的產量較低，美國BMS公司采用紫外（ultraviolet，UV）和亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）對原始菌株進行了誘變，其搖瓶的埃博霉素B產率達到88 mg/L以上，為目前已知的報道中的較高水平[8]。國內較早，龔國利等[9]使用搖瓶發酵的埃博霉素B產量為29.95 mg/L。后來，經UV和NTG復合誘變及篩選，獲得一株高產突變菌株，該菌株發酵獲得的埃博霉素B的產量提高到79.83 mg/L[10]。但相比于其他大環內酯抗生素的產業化產量來說，還存在較大的提升空間[11]。

薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）直接生物測定法以其分離能力、高分辨率和可視化，作為傳統分光光度和色譜方法的方便替代品，已被廣泛用于篩選天然生物活性物質[12]。TLC熒光法既可用于混合提取物，也可用于直接分離未知化學成分；它特別適用于不穩定的成分，但只有在紫外 254 nm下不形成淬滅點的物質才能被檢測到，這在很大程度上限制了該方法的應用[13-14]。另外，TLC盡管靈敏度較低，但其使用簡單、可平行分離大量樣品、分析物與顯色劑之間的顯色反應可在現場形成、易于色譜后衍生化以提高選擇性、一次性板的單一使用、提高通量、多種檢測可能性以及更易于操作固定相和流動相而廣受歡迎[15]。李越中等[16]利用薄層層析法分離代謝粗產物，篩選有效組分，分析它們的生物活性。El-Sayed等[17]先通過 TLC分析對提取的樣品進行分級和鑒定，再通過HPLC等方法對埃博霉素類似物進行定量分析和驗證。

本文從實驗室保存黏細菌菌液中利用濾紙片及酵母菌誘導法分離出埃博霉素B的產生菌A96-1，通過TLC對發酵產物進行初步分級純化和鑒定，再利用HPLC對分級純化后的樣品進行驗證，與標品的保留時間一致，確認發酵所獲得產物為埃博霉素B。通過單因素實驗和正交實驗優化發酵培養基成分，以提高埃博霉素B的產量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

黏細菌A96-1，由本實驗室分離保藏。

1.1.2 實驗培養基

①種子培養基M26（g/L）：馬鈴薯淀粉 8，葡萄糖 2，大豆蛋白胨 2，酵母浸粉 2，MgSO4 1，CaCl2·2H2O 1，微量元素溶液[18] 1 mL/L。

②液體發酵培養基（g/L）：馬鈴薯淀粉2，葡萄糖2，玉米漿干粉2，MgSO4·7H2O 1.5，CaCl2 1.5，微量元素溶液 1 mL/L，XAD-16樹脂2%。

③濾紙培養基 L1 （g/L）：KNO3 1，K2HPO4 1，MgSO4 0.2，CaCl2 0.1，FeCl3 0.02，瓊脂10。以上培養基均用KOH調節pH至7.2，121℃下滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養

從-80 ℃的冰箱中取出菌種后緩慢升至室溫。再將菌液接種于L1濾紙平板培養基上，于恒溫培養箱中30 ℃，培養6～7 d后，將菌體接種到種子培養基中于30 ℃，180 r/min培養3 d。

1.2.2 埃博霉素B的發酵培養

取10%上述種子液接種于液體發酵培養基中于30 ℃，180 r/min恒溫培養7～8 d，發酵3 d后添加2%滅過菌的XAD-16樹脂。

1.2.3 埃博霉素B鑒定及含量測定

采用薄層色譜（TLC）和HPLC分析。

（1）發酵液預處理" " 發酵液以10000 r/min離心

8 min后去上清液，用相同體積的水清洗沉淀，取樹脂去掉菌體，樹脂用等體積的蒸餾水清洗3次，于40 ℃

的烘箱中烘40 min。將上述樹脂先用50%的甲醇洗脫，除去極難溶性的雜質，再用無水甲醇浸提樹脂過夜，將甲醇提取液用旋轉蒸發儀40 ℃減壓濃縮，用

2 mL無水甲醇復溶即為粗提物，以便進行產物分析。

（2）發酵液薄層色譜（TLC）分離" " 將上述粗提物通過TLC對提取的樣品進行分級和鑒定。并且探索三氯甲烷、二氯甲烷和甲醇等常用有機溶劑對埃博霉素B的最佳分離及顯影條件。

（3）HPLC分析條件" " 色譜柱為C18反相柱（Cosmosil Packed Column 5 C18， 4.6 mm×250 mm），進樣量20 μL，流動相為甲醇/水（70 ： 30，V/V），流速1.0 mL/min，時間20 min。

1.3 發酵培養基的優化

1.3.1 發酵培養基成分優化

利用單因素實驗，考察培養基成分MgSO4·7H2O濃度、CaCl2濃度、微量元素溶液濃度、XAD-16大孔吸附樹脂的添加量和添加時間對發酵埃博霉素B產量的影響。

1.3.2 碳源種類篩選

碳源用于構建微生物細胞和形成產物的碳架，并提供細胞生長所需的能量。選擇可溶性淀粉、糊精、馬鈴薯淀粉、果糖、葡萄糖、糖蜜、蔗糖、乳糖作為碳源，進行搖瓶發酵培養，檢測埃博霉素B產量。探索最優碳源及其最佳濃度。

1.3.3 氮源種類篩選

考察不同氮源對發酵水平的影響。 選擇蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、脫脂奶粉、硝酸鉀、氯化銨和乙酸銨作為氮源，進行搖瓶發酵培養，測定埃博霉素B產量。探索最優氮源及其最佳濃度。

1.3.4 正交實驗設計

在單因素試驗的基礎上，將碳源（馬鈴薯淀粉）、氮源（玉米漿干粉）、MgSO4·7H2O濃度、CaCl2濃度、微量元素溶液濃度和XAD-16樹脂添加量，設計6因素3水平正交試驗設計L27（36），以埃博霉素B的產量作為評價指標探索各因素對A96-1發酵獲得埃博霉素B的影響。

2 結果與分析

2.1 菌株形態

從甘油管中復壯菌株采用濾紙片及酵母菌誘導法分離細菌，經過反復純化，得到A96-1菌株。A96-1在M26液體培養基中菌結團，菌球呈黃色，菌球在油鏡下可見菌絲呈輻射狀向邊緣擴散，營養細胞為兩端鈍圓的圓柱形（圖2）。

2.2 黏細菌生物活性產物的TLC和HPLC分析

根據“1.2.3”的發酵液預處理方式獲得產物粗提物，再取未接菌發酵液中的樹脂浸提液為空白對照，與標準品埃博霉素B在TLC上進行比較，對不同菌株粗提物進行初步篩選與鑒定。探索展開劑發現三氯甲烷和甲醇（6：1）于GF254硅膠板上對粗提物的分離及顯影效果最佳（圖3）。將與標品Rf值相同的樣品斑點刮下，于甲醇或者二氯甲烷中復溶。HPLC分析結果表明（圖4），在254 nm下，標準品埃博霉素B保留時間為9.272 min。對A96-1菌株發酵產物進行高效液相色譜檢測，樣品中的埃博霉素B保留時間為（9.2±0.2） min，這種微小的保留時間變化可能與提取樣品和正品樣品的溶解體系的極性或純度有關。

2.3 發酵培養基成分的優化

2.3.1 CaCl2對產量的影響

如圖5所示，CaCl2添加量小于1 g/L時，埃博霉素B產量隨著CaCl2濃度的升高而增加，當添加量大于1 g/L時產量下降。因此，添加1 g/L的CaCl2能夠獲得埃博霉素B產量達到65.6 mg/L，選擇此濃度作為正交實驗中CaCl2濃度的中間水平。

2.3.2 MgSO4·7H2O對產量的影響

如圖6所示，MgSO4·7H2O添加1～2 g/L時，埃博霉素B產量隨著其濃度的升高而增加，當添加量大于2 g/L時產量下降。因此，添加2 g/L的MgSO4·7H2O能夠獲得最佳產量，同時選擇此濃度作為正交實驗中MgSO4·7H2O濃度的中間水平。

2.3.3 微量元素溶液對產量的影響

如圖7所示，微量元素溶液的添加小于1 mL/L時，埃博霉素B產量增加，當添加量大于1 mL/L時產量下降。因此，選擇1 mL/L的微量元素溶液濃度作為正交實驗中微量元素溶液濃度的中間水平。

2.3.4 樹脂XAD-16添加量及時間對產量的影響

如圖8所示，當吸附樹脂的添加量為2%時，埃博霉素B產量最佳。在發酵0～2 d后分別添加樹脂，埃博霉素B的產量明顯增加，當在發酵4～8 d后添加樹脂，初級代謝產物會對菌體的生長造成一定程度的影響，從而影響埃博霉素B的生物合成，造成埃博霉素B的產量下降，故選擇發酵3 d時添加大孔吸附樹脂，以保證最大程度的獲得埃博霉素B，其產量達到147 mg/L，是優化前的2.24倍。

2.3.5 碳源種類及添加量對產量的影響

如圖9所示，相比于糖蜜、可溶性淀粉、乳糖和蔗糖，糊精、馬鈴薯淀粉、果糖、葡萄糖作為碳源發酵獲得較高產量的埃博霉素B，故進一步探索以上4種碳源的不同濃度對埃博霉素B產量的影響。而且在培養基中添加一定量的葡萄糖作為速效碳源有利于發酵過程中菌體生長。馬鈴薯淀粉的添加量為4 g/L

時，埃博霉素B的產量達到198 mg/L，故馬鈴薯淀粉為最佳碳源。

2.3.6 氮源種類及添加量對產量的影響

以“2.3.4”的結果為基礎，選擇馬鈴薯淀粉作為最佳碳源。如圖10所示，蛋白胨、脫脂奶粉、豆餅粉、玉米漿干粉作為氮源發酵獲得較高產量的埃博霉素B，故進一步探索以上4種氮源的不同濃度對埃博霉素B產量的影響。當玉米漿添加量為2 g/L時，埃博霉素B的產量達到188 mg/L。故玉米漿干粉為最佳氮源。

2.3.7 正交實驗優化發酵培養基

根據前期的實驗結果及預實驗確定各因素的水平（表1），按照表2進行正交實驗，以埃博霉素B的產量為實驗效果的評價指標。

對實驗結果進行極差和方差分析（表3～4）。根據極差分析的得知，因素的影響由大到小為MgSO4·7H2O濃度gt;馬鈴薯淀粉濃度gt;玉米漿干粉濃度gt;CaCl2濃度gt;樹脂添加量gt;微量元素溶液濃度，結合方差分析表可知，以上6種因素中，MgSO4·7H2O、馬鈴薯淀粉和玉米漿干粉的濃度對A96-1發酵產埃博霉素B的影響顯著（Plt;0.05），其中MgSO4·7H2O和馬鈴薯淀粉的影響極顯著（Plt;0.01）。如表2所示，正交實驗時以24號實驗組的條件發酵獲得最高埃博霉素B的產量為231.6 mg/L。根據極差分析表推測最優的發酵條件為A3B2C3D3E2F2，即6 g/L馬鈴薯淀粉、2 g/L玉米漿干粉、2 g/L CaCl2、3 g/L MgSO4·7H2O，1 mL/L微量元素溶液、樹脂添加量2%。由于該推測的最優組合未出現在實驗組中，將該推測組合與24號實驗組進行驗證實驗。結果發現，24號實驗組獲得埃博霉素B的產量為228 mg/L，按推測最優條件發酵所得產量為251.4 mg/L，比優化前提高了3.83倍，確認該推測條件為最優發酵條件。

3 討論

黏細菌是存在于大自然中且具有復雜的生活史的捕食性微生物類群，能夠產生豐富多樣且結構新穎的生物活性產物，如具有抗腫瘤藥物研發潛力的埃博霉素B[19]。但目前埃博霉素B的規模化發酵的培養條件和技術尚不成熟，為實現其產業化還需解決埃博霉素B生產菌株分離純化困難[20]、發酵生產的得率低和分離提取產物時產量損失[17]等研究難題。

目前國內對埃博霉素B的產量提高集中在菌株選育和發酵條件優化等方面[21-22]，在高效提取產物方面的報道較少。本研究先使用TLC法進行埃博霉素B發酵產物初步分離再溶解進行HPLC含量鑒定。研究發現三氯甲烷和甲醇作為展開劑不僅能夠對產物進行初步分離，而且還能在一定程度上減少操作過程中埃博霉素B的產量損失。但是三氯甲烷有劇毒，操作嚴格而且存在風險，后期將進一步探索安全簡便的展開劑；本研究通過添加XAD-16大孔吸附樹脂進行在位發酵和分離相耦合的工藝以提高埃博霉素B發酵產量。但由于XAD-16大孔吸附樹脂的價格十分昂貴，一定程度上影響其實現產業化。Epothilones和avermectins都屬于十六元大環內酯類化合物，在大環內酯類化合物下游分離純化方面，本團隊提出采用廉價的活性炭、甲苯和乙醇對發酵液進行處理以提取阿維菌素B2a，獲得的結晶阿維菌素B2a的純度完全達到要求，工藝簡單、經濟實用[23]。后期本團隊將以相同結構化合物的分離純化方法為參考，探索低廉的吸附材料提取發酵液中的埃博霉素B，希望對其實現產業化具有一定幫助及推動作用。

總之，本研究獲得埃博霉素B的產生菌A96-1，利用TLC法和吸附樹脂減少產物在鑒定時的損失，通過優化發酵培養基實現了埃博霉素B的高效生物合成，使其產量提高了3.83倍達到目前國內文獻報道的最高水平，產量較為穩定，為埃博霉素B的工業化生產鑒定基礎。

參 考 文 獻

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