血流感染診斷生物標志物預測及免疫細胞浸潤分析

摘要：目的 通過生物信息學與機器學習識別血流感染（blood stream infections， BSI）患者的相關診斷生物標志物、發病機制及免疫細胞浸潤水平，尋找新的藥物靶標。方法 從高通量基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）中獲取了BSI相關基因表達數據集。使用R語言進行差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）篩選，然后進行基因富集分析。使用加權基因共表達網絡分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）篩選的關鍵模塊基因。通過使用兩種機器學習算法來識別中心基因。在外部數據集中使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）和箱線圖模型來驗證中心基因的診斷效能。通過CIBERSORT反卷積算法分析免疫細胞浸潤水平。結果 本研究得到了330個加權基因共表達網絡關鍵模塊基因和DEGs的交集基因?；蚋患治鼋Y果顯示，免疫和炎癥相關通路被顯著富集。通過機器學習和外部數據庫驗證共得到8個潛在生物標志物，ROC分析顯示，8個潛在生物標志物曲線下面積（area under curve，AUC）均大于0.9。免疫細胞浸潤分析表明，所有診斷標生物標志物都可能與免疫細胞有著不同程度的相關性。結論 通過生物信息學和機器學習方法，確定了潛在生物標志物，并構建了BSI診斷模型。本研究可以為BSI患者提供潛在的外周血診斷生物標志物，為BSI發病機制、新型治療靶點和新藥研發提供新的方向。

關鍵詞：血流感染；生物信息學；機器學習；診斷生物標志物；免疫細胞浸潤分析

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Prediction of biomarkers for diagnosis of blood stream infections and analysis of immune cell infiltration

Abstract Objective Use bioinformatics and machine learning to find diagnostic biomarkers， pathogenesis， and immune cell infiltration levels that are relevant to people with blood stream infections （BSI） and look for new drug targets. Methods A BSI-related gene expression dataset was obtained from the High-Throughput Gene Expression Omnibus （GEO） database. Use the R language to screen differentially expressed genes （DEG）， and then perform gene enrichment analysis. Key module genes were screened using weighted correlation network analysis （WGCNA）. Identify central genes by using two machine learning algorithms. Use receiver operating characteristic （ROC） curves and box plot models in external datasets to validate the diagnostic efficacy of central genes. Analyze immune cell infiltration levels using the CIBERSORT deconvolution algorithm. Results This study obtained the intersection genes of 330 weighted gene co-expression network key module genes and DEGs. The results of gene enrichment analysis showed that immune and inflammation-related pathways were significantly enriched. A total of 8 potential biomarkers were obtained through machine learning and external database validation. ROC analysis showed that the area under the curve （AUC） of all 8 potential biomarkers was greater than 0.9. Immunocyte infiltration analysis indicates that all diagnostic biomarkers may have varying degrees of correlation with immune cells. Conclusion Through bioinformatics and machine learning methods， potential biomarkers were identified and a blood flow infection diagnosis model was constructed. This study can provide potential peripheral blood diagnostic biomarkers for patients with bloodstream infections and provide new directions for the pathogenesis of bloodstream infections， new treatment targets， and new drug development.

Key words Bloodstream infection; Bioinformatics; Machine learning; Prediction of biomarkers; Immune cell infiltration

血流感染（blood stream infections，BSI）是一種嚴重感染性疾病，是臨床多發病之一，指細菌、真菌等病原微生物通過受損的皮膚屏障侵入血液循環，在機體血液中繁殖并隨著血液循環播散于全身，引起全身播散性感染，進而引起全身炎癥，臨床上常將敗血癥、菌血癥稱為血流感染[1-2]。它具有較高發病率和死亡率，有研究表明細菌性血流感染患者病情發展迅速，可在短時間內發生感染性休克，嚴重時可導致多器官衰竭甚至死亡[3]。因此快速檢測和及時使用抗菌及抗炎藥物對病情的進一步發展有著重要的作用。據報道，全球每年約有150萬BSI患者死亡。BSI作為全球第七大死因，10萬人口中每年平均因BSI死亡高達29例，診斷后的病死率在13%至20%之間[4]。為了最大限度地提高BSI的治療效果，早期發現和及時治療至關重要。

免疫系統是人體的防御系統，旨在保護身體免受病原體（如細菌、病毒、真菌等）的侵害[5]。當免疫系統檢測到病原體存在時，它會啟動一系列免疫反應，以試圖清除病原體并阻止感染的進一步發展，全身免疫反應在BSI的病因和進展中起著至關重要的作用[6]。在BSI初期，免疫反應包括免疫細胞的激活和炎性介質的釋放，有助于清除病原體[7]。隨著BSI的進一步發展，免疫系統受到抑制，表現為免疫細胞的功能和數量下降，病情逐步惡化[8]。

越來越多的研究表明，BSI的發病機制涉及免疫反應的調節和炎癥途徑的激活。特征識別受體是固有免疫細胞感知危險的主要途徑，主要包括胞外模式識別受體：TOLL樣受體（TOLL-like receptor，TLR）和胞內模式識別受體：NOD樣受體 （NOD-like receptor，NLR）。TLR能夠識別病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）并參與免疫防御[9]。當識別到入侵病原體時，通過與下游效應器MyD88的相互作用，激活核轉錄因子-κB（NF-κB）和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）途徑[10]，調控白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥細胞因子的釋放，從而參與炎癥調控過程[11]。宿主免疫反應和病原體抗原都會引發細胞損傷或誘導細胞應激，進而導致損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）的釋放，加劇炎癥反應[12]。NLR作為胞內受體，能識別高度保守的細菌細胞壁成分肽聚糖以及DAMP，并誘NF- κB激活，促使炎癥反應[13-14]。

目前，血培養是診斷血流感染的金標準[15]，但其耗時長，需要3～5 d或更長時間，時效性差，且可能存在標本污染情況，導致結果出現偏差[16]。此外，也有研究表明，中性粒細胞/淋巴細胞比值可用于預測血流感染[17]，并有助于區分不同的致病菌種類，但臨床上并沒有將其作為明確的感染診斷標志，并且確切的閾值還存在爭議[18]。近年來一些臨床研究發現降鈣素原（PCT）、C反應蛋白（CRP）等炎癥因子水平對血流感染的早期診斷和病情判定具有一定的臨床價值[19-20]，但它們也存在一些缺點，C反應蛋白存在于單核巨噬細胞中，濃度較低，難以檢測。此外，降鈣素原很容易因手術和免疫治療等其他因素而升高，限制了其作為血流感染生物標志物的應用。

高通量測序是研究疾病基因表達變化和識別潛在的疾病相關基因以發現新的診斷和治療方法的有用方法[21]，隨著計算能力的提高，各種機器學習和人工智能技術被廣泛用于從高通量測序數據中識別患者疾病的特征基因[22-23]。因此，本研究通過對血流感染患者和健康人的基因表達水平進行了系統性分析，并利用機器學習方法確定了BSI的診斷生物標志物。通過免疫細胞浸潤分析研究了診斷生物標志物與22種免疫細胞之間的關系，以更深入地了解血流感染發生過程中涉及的分子免疫機制[24]。此外，越來越多的研究表明，新型診斷生物標志物不僅有可能作為BSI預后的預測因子，而且有潛力作為BSI免疫治療的新型前瞻性靶標[25]。

1 材料與方法

1.1 RNA微陣列數據獲取和預處理

包含BSI患者和健康樣本的血液中全基因組基因表達微陣列數據集的原始數據從美國國家生物技術信息中心（NCBI）基因表達綜合數據庫（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）收集。使用R語言“sva”包對原始微陣列數據進行批次效應去除、背景校正、歸一化和對數變換處理[26]，并通過相應的測序平臺注釋信息將探針ID轉換為基因Symbol，最后，獲得了包含108個樣本（89名BSI患者和19名健康人）的歸一化基因表達矩陣數據（GSE64456）作為分析集[27]，包含94個樣本（51名BSI患者和43名健康人）的歸一化基因表達矩陣數據（GSE33341）作為驗證集[28]。本研究工作流程見圖1。

1.2 差異表達基因的鑒定

R（Version 4.3.1）軟件中的“limma”包用于篩選BSI患者和健康人之間的差異表達基因[29]。以Plt; 0.05，|log2FC|gt;1作為篩選差異表達基因的閾值。

1.3 基因富集分析

通過分子特征數據庫（MSigDB，https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp），收集了京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、基因本體（gene ontology，GO）和HALLMARK基因集的基因列表。基因集變異分析（GSVA）是一種非參數無監督的分析方法，用于評估基因表達矩陣數據的KEGG基因集富集結果[30]??。使用R語言中的“ClusterProfiler”包進行GO分析[31]，包括細胞組分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）[32]。為了更直觀地了解高度富集的功能途徑的基因表達水平，使用基于HALLMARK基因集的基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）對所有基因進行分析，GSEA[33]使用R語言“GSEABase”包分析，當Plt;0.05時有統計學意義。

1.4 加權基因共表達網絡分析

本研究使用R語言“WGCNA”包構建顯著性排名前10000個基因的共表達網絡[34]。首先，對樣本進行聚類，以便發現可能存在的異常值。R語言 “pickSoftThreshold”函數用于計算軟閾值Power β，并根據無標度網絡圖譜結構R2大于0.8且平均連接度小于100為條件確定軟閾值Power β。然后將鄰接矩陣轉換為拓撲重疊矩陣（topology overlap matrix，TOM）來衡量基因的網絡連通性，同時降低噪音和假相關。通過采用平均層次聚類結合動態樹剪切功能將具有相似表達模式的基因聚類成共表達模塊，設定共表達模塊最小基因數為30，用不同顏色表示聚類樹的分支，并計算基因共表達模塊與表型之間的相關性，將模塊與臨床特征聯系起來，確定與臨床表型高度相關的模塊。使用R語言“cor”函數計算模塊成員（module membership，MM）和基因顯著性（gene significance，GS），其計算公式如下：

式中，MM代表基因與模塊的相關性，GS代表基因與表型的相關性；x、y和z別代表基因表達量、模塊特征和表型；x、y分z別代表基因表達量平均值，模塊特征平均值和表型平均值，n代表樣本數量。

基因共表達模塊網絡中|MM|gt;0.8且|GS|gt;0.2的基因表明具有較強的模塊相關性和臨床相關性，被認定為hub基因。利用Venny圖提取hub基因與DEGs的交集基因，用于下一步的機器學習篩選潛在診斷標志物。

1.5 診斷標志物的篩選和驗證

機器學習[35]是一種新型的算法分析工具，本研究使用兩種二分類機器學習算法篩選了BSI的診斷生物標志物：隨機森林（random forest，RF）和支持向量機-遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）。RF是一種基于決策樹的集成學習算法，通過建立多個決策樹來進行預測。每個決策樹都是由不同的樣本和特征隨機抽取得到的，然后這些決策樹的結果通過投票的方式得到最終的預測結果[36]。SVM是一種基于邊界的分類方法，它可以用于篩選與目標變量最相關的特征。SVM通過在特征空間中尋找最大間隔超平面來實現分類，可以在訓練集上最大化超平面與分類邊界之間的距離[37]。本研究中使用R中的“randomForest” R包來實現隨機森林篩選，使用R中的“e1071”包構建 SVM 模型篩選關鍵基因。然后選擇兩種機器學習分類模型的共有結果作為潛在診斷標志物進行進一步研究。為了評估已確定的生物標志物的診斷效能，使用GSE33341外部驗證數據集繪制受試者工作特征曲線圖，并計算AUC來衡量算法的預測能力。通過Wilcoxon秩和雙側檢驗法，計算BSI組和健康組間潛在診斷生物標志物表達的統計學顯著性，進一步驗證診斷生物標志物的基因表達水平。

1.6 免疫細胞浸潤分析

CIBERSORT是一種用于分析基因表達數據的反卷積算法，并利用基因表達數據估算基因表達譜并估計混合細胞群中成員細胞類型的豐度[38]。使用R語言“cibersort”包進行免疫細胞浸潤分析，并使用原始的CIBERSORT基因特征文件LM22（定義了22種免疫細胞亞型）來計算正常和BSI患者中22種免疫細胞的比例[39]。然后，使用“ggplot2”包繪制箱線圖以可視化各BSI患者與正常組相比在免疫細胞浸潤方面的差異。使用Spearman方法計算了已識別的潛在診斷生物標志物與22種免疫細胞之間的相關系數，并構建了相關性熱圖可視化。

2 結果

2.1 差異表達基因鑒定

從美國國家生物技術信息中心（NCBI）基因表達綜合數據庫獲取包含BSI患者和正常樣本的血液中全基因組基因表達微陣列數據集的原始數據，GEO數據集的相關信息如表1所示，通過R語言“sva”包合并GSE64456數據集中兩個芯片測序數據并消除批次效應、背景校正、歸一化和對數變換，結果見圖2A，2B。以Plt;0.05，|log2FC|gt;1為篩選標準，從GSE64456數據集中得到705個DEGs，其中包括505個上調基因和200個下調基因，使用火山圖來可視化DEGs，見圖2C。

2.2 基因富集分析

本研究通過對根據log2FC排序的所有基因進行基因集富集分析（GSEA），以研究生物信號通路，在HALLMARK基因集中分析識別出顯著富集（p.adjustlt;0.001）的前6個途徑：NF-κB介導的TNF-α信號傳導（TNFA Signaling Via NFKB）、IL6-JAK-STAT3信號傳導（IL6-JAK-STAT3 Signaling）、炎癥反應（inflammatory response）、缺氧（hypoxia）、補體（complement）、IL2-STAT5信號傳導（IL2 STAT5 Signaling），見圖3A。為了深入地了解DEGs在BSI進展中的生物學功能，本研究進行了GO功能和KEGG通路富集分析。在基因本體（GO）富集分析中顯示DEGs在生物過程（BP）中顯著富集于免疫反應調節信號通路（immune response-regulating signaling pathway）、細胞因子產生的正向調節（positive regulation of cytokine production）、免疫反應的激活（activation of immune response）；在分子功能（MF）上顯著富集于：免疫受體活性（immune receptor activity）、細胞因子受體活性（cytokine receptor activity）、模式識別受體活性（pattern recognition receptor activity）；顯著富集的細胞成分（CC）有特殊顆粒（specific granule）、三級顆粒（tertiary granule）、分泌顆粒膜（secretory granule membrane），見圖3B。在基因集變異分析中，對各通路進行歸一化評分，得到KEGG通路的GSVA評分，使用R語言“LIMMA”包對評分進行差異分析，多條KEGG通路被顯著富集（p.adjustlt;0.001）：TGF-β信號通路、抗原處理和呈遞、原發性免疫缺陷、B細胞受體信號通路等，見圖3C～D。

2.3 加權基因共表達網絡分析

對顯著性排名前10000的基因組成的89個BSI樣本和19個健康樣本進行聚類分析，未觀察到異常值。然后，根據無標度網絡圖譜結構R2大于0.8且平均連接度小于100為條件，確定軟閾值Power β為11，以確保無標度網絡具有生物學意義。通過平均層次聚類結合動態樹剪切功能，將10000個基因分為6個模塊。通過對模塊和表型之間關系的仔細分析，揭示了橙色模塊（MEorange）和BSI表型之間最強的負相關聯系（cor=-0.9， P=8e-35），黑色模塊（MEblack）和BSI表型之間最強的正相關聯系（cor=0.88， P=7e-32），并選擇相關性最強的橙色模塊進行進一步分析，并根據|MM|gt;0.8且|GS|gt;0.2對模塊基因進行篩選。最確定了1644個與BSI顯著相關的關鍵基因，見圖4。

2.4 診斷標志物的篩選和驗證

利用Venny圖比較DEGs和關鍵模塊基因的交集基因，共篩選出330個重疊基因，見圖5E。通過了兩種機器學習算法來識別潛在生物標志物：圖5A～B展示了SVM篩選出的重要性排名前20的關鍵基因；圖5C～D展示了RF篩選出的重要性排名前20的關鍵基因；最終得到從SVM篩選出的重要性排名前15的基因和RF篩選出的重要性排名前15的基因的11個交集基因，其中在驗證集GSE33341中找到的8個基因（OPLAH、RETN、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1、HK3和MMP9）被認定為潛在診斷生物標志物，見圖5F。為了驗證潛在診斷標志物的診斷功效，在GSE13904驗證集中，本研究使用R語言“rms”包繪制了潛在診斷生物標志物的諾莫圖模型，用于BSI輔助診斷，8個潛在生物標志物中，TLR5提供了最大的分類貢獻，而MMP9分類貢獻最小，見圖6A。通過決策曲線分析（Decision Curve Analysis，DCA）分析對諾莫圖復合診斷模型預測效能進行評估，同時為了減少檢測成本，逐步建立去除貢獻最小的生物標志物的復合診斷模型，當生物標志物低于6個時，模型診斷效能開始下降，最終構建了包含OPLAH、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1和HK3在內的6個生物標志物的復合診斷模型，結果顯示，對比單個生物標志物的預測效能，諾莫圖復合診斷模型提供了更好的臨床診斷效能，可有效對BSI患者和健康人進行鑒別，見圖6B。通過構建箱線圖可視化，BSI組潛在生物標志物的表達量顯著高于健康組（P lt;0.001），見圖6C，通過進行 ROC 曲線分析來檢查8個中心基因的診斷敏感性和特異性。結果表明，8個基因的AUCOPLAH=0.954、AUCRETN=0.959、AUCDYSF=0.954、AUCTLR5=1.000、AUCCKAP4L=0.953、AUCCEACAM1=0.973、AUCHK3=0.992、AUCMMP9=0.926，其中AUCTLR5=1.000，ROC曲線表明潛在生物標志物具有高度診斷敏感性和特異性，同時具有較高的預測準確性，見圖6D。

2.5 免疫細胞浸潤分析

通過CIBERSORT算法，分別計算了健康人和BSI患者中22種免疫細胞的分數，與健康樣本相比，BSI患者中初始B細胞、靜息樹突細胞、嗜酸性粒細胞（eosinophils）、靜息自然殺傷細胞、靜息CD4+記憶T細胞、CD8+T細胞、調節性T細胞免疫細胞豐度顯著下降（Plt;0.001），活性樹突狀細胞、M0型巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞免疫細胞豐度顯著升高（Plt;0.001）。根據相關性分析結果，潛在生物標志物與多種免疫細胞表現出顯著程度的相關性，其中靜息CD4+記憶T細胞表現為最強負相關，中性粒細胞表現為最強正相關，見圖7。這些結果進一步顯示了潛在生物標志物對免疫微環境和免疫活性的影響。

3 討論

血流感染的發病機制復雜，涉及生物過程多，大量研究表明，在BSI致病微生物中革蘭陰性菌占主導地位[40-41]，BSI通常是在免疫力下降、皮膚黏膜屏障被破壞或免疫功能受損等情況下，原本不能致病的微生物引發的感染和免疫抑制造成的[42]。持續的過度炎癥反應和免疫抑制，以及難以恢復健康狀態的機體內穩態是其病理生理過程的重要特征。當病原微生物入侵機體時，病原體首先被內在免疫系統識別，引發炎癥反應清除入侵的病原體，但失衡的促炎、抗炎反應導致細胞因子紊亂和免疫抑制，從而導致機體免疫系統受損，造成嚴重的組織損傷和器官功能障礙，最終導致多器官衰竭甚至死亡[43]。在本研究中，致力于鑒定BSI特異性地診斷生物標志物，提高BSI診斷效率，并研究了免疫細胞浸潤對BSI的影響，有助于識別免疫治療新型靶標并為免疫治療新藥研發提供思路。

本研究中，通過對BSI患者和健康人之間的基因表達譜進行綜合分析，總共發現了705個DEGs，其中505個基因上調，200個基因下調。通過對所有基因進行GSEA分析，與BSI顯著相關的前6個Hallmark基因集是NF-κB介導的TNF-α信號傳導、IL6-JAK-STAT3信號傳導、炎癥反應、缺氧、補體和IL2-STAT5信號傳導。隨后的基因本體（GO）富集分析中顯示DEGs在生物過程（BP）中顯著富集于免疫反應調節信號通路、細胞因子產生的正向調節、免疫反應的激活；而基于KEGG數據集的GSVA分析顯示于TGF-β信號通路、抗原處理和呈遞、原發性免疫缺陷、B細胞受體信號通路有一定的相關性。這些富集結果都普遍揭示了免疫和炎癥在BSI中的重要影響。補體是一種血清蛋白質，主要存在于血清及組織液中，可被抗原-抗體復合物或微生物所激活而具有酶活性，進而介導免疫應答和炎癥反應[44]。大量研究表明，缺氧與多種生物過程有關，可調節一系列下游基因的表達，參與細胞代謝、細胞生長/死亡、細胞增殖、糖酵解、免疫反應、微生物感染、腫瘤發生和轉移等多個過程，缺氧可以增強終末耗竭性T細胞上相關蛋白的表達，從而制造出一種免疫抑制微環境，來抑制其他T細胞的功能[45]。這些結果表明，過度的炎癥和免疫抑制對BSI的不良預后有著顯著相關。

二分類機器學習RF具有很好的準確性和穩定性，但是當數據集過小或噪聲較大時隨機森林可能會過度擬合[46]。SVM可以用于特征選擇，去除不必要的特征，從而降低過擬合的風險，兩種機器學習相結合有利于提高預測結果準確性[47]。在DEGs的基礎上，結合了WGCNA和上述兩種機器學習算法來篩選和識別BSI診斷生物標志物，并鑒定出8個基因，包括OPLAH、RETN、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1、HK3和MMP9。與健康人相比，以上潛在診斷生物標志物在BSI患者中的表達均顯著上升。目前，已有多項研究報道這些生物標志物參與了多種疾病。Toll樣受體5（TLR5）是位于細胞表面模式識別受體（PRR），參與先天免疫和炎癥反應的激活，在識別到細菌鞭毛蛋白等病原體相關分子模式（PAMP）后，通過與下游效應器MyD88的相互作用，激活核轉錄因子-κB（NF-κB）和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK），導致細胞因子分泌和炎癥反應的誘導[48]。癌胚抗原相關細胞黏附分子（CEACAM1）在免疫反應、胰島素作用中發揮共抑制受體的作用，并在血管生成過程中充當激活劑。受到細菌感染后在T細胞、自然殺傷（NK）和中性粒細胞參與的免疫反應中發揮作用[49]?；|金屬蛋白酶-9（MMP9）可能在細胞外基質的局部蛋白水解和白細胞遷移中發揮重要作用。細菌感染患者的血清MMP9水平已被證明比健康對照者高得多，MMP9在BSI中可能充當新的炎癥調節因子[50]。5-氧代脯氨酸酶（OPLAH）能催化5-氧代-L-脯氨酸裂解形成 L-谷氨酸，同時將 ATP 水解為ADP和無機磷酸鹽；有研究表明，受大腸埃希菌感染的HT-29細胞中檢測到OPLAH顯著上調，這可能與感染后造成的氨基酸代謝紊亂有關[51]。抵抗素（RETN）是由位于19號染色體上的基因編碼的一種富含半胱氨酸的多肽激素，可誘導炎癥細胞因子的釋放，并參與BSI的發病機制[52]。Dysferlin蛋白（DYSF）參與Ca2+觸發的突觸囊泡-質膜融合過程，在骨骼肌和心肌細胞的肌膜修復機制中發揮作用，這可能與BSI誘發的相關肌肉損傷有關[53]。人細胞骨架關聯蛋白4（CKAP4）可通過Dickkopf-1信號誘導NF-kB通路參與炎癥反應[54]。己糖激酶（HK3）催化己糖磷酸化為6-磷酸己糖來介導糖代謝的初始關鍵步驟，炎癥細胞浸潤的比例隨著HK3表達的升高而顯著增加[54]。ROC分析進一步證實了其在區分BSI和健康人的診斷價值。本研究結果發現了OPLAH、RETN、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1、HK3和MMP9作為BSI患者新型生物標志物的潛力，對這些潛在生物標志物進行進一步驗證與探索，有望成為有效的新型免疫治療靶點。

最后，在免疫細胞浸潤分析及其與生物標志物的相關性分析中，活性樹突狀細胞、M0型巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞在BSI患者中高度浸潤，而幼稚B細胞、靜息樹突細胞、嗜酸性粒細胞、靜息自然殺傷細胞、靜息CD4+記憶T細胞、CD8+T細胞、調節性T細胞豐度較低。各種免疫細胞浸潤的變化可能與BSI的發生和進展有關[55]。免疫抑制和免疫失調：幼稚B細胞、CD4+記憶T細胞、CD8+T細胞以及調節性T細胞的減少可能導致免疫系統的抑制和失衡。這些細胞在調節和協調免疫應答中起著重要作用。它們的減少可能降低了免疫的效力，使患者更容易受到感染，同時也可能影響免疫對病原體的記憶和識別能力；炎癥和免疫激活：活性樹突狀細胞、M0型巨噬細胞、單核細胞以及中性粒細胞的增加可能反映了免疫系統的激活和炎癥狀態。這些細胞在感染和炎癥中發揮著關鍵作用，它們參與吞噬病原體、釋放炎癥介質以及調節免疫反應。然而，過度的炎癥反應也可能導致組織損傷和炎癥性疾??；免疫記憶受損：幼稚B細胞和CD4+記憶T細胞的減少可能影響免疫系統對之前感染的記憶。免疫記憶對于快速識別和抵御再次暴露的病原體至關重要。缺乏足夠的記憶細胞可能導致對相同病原體的再次感染出現較弱的免疫反應；細胞免疫的增強：嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的增加可能反映了細胞免疫的增強。這些細胞對抗細胞內病原體以及炎癥反應具有重要作用。然而，過度的中性粒細胞激活也可能引發組織損傷。這些分析結果揭示了在BSI患者中免疫細胞的復雜調節和相互作用。免疫細胞的增加和減少可能是機體對抗感染的努力，但同時也可能導致免疫平衡的紊亂和炎癥反應的加劇。這些結果有助于更深入地理解免疫系統在感染狀態下的變化，為設計更有效的治療和免疫調節策略提供線索。然而，進一步的研究仍然需要，以更全面地解析這些變化對機體免疫和疾病進程的影響。

然而，本研究存在一些局限性。通過生物信息學分析，可對血流感染進行診斷，但針對不同病原菌感染導致的血流感染無法進行區分，后續研究中應加強對免疫浸潤模式及相關基因的深入研究，有望找出不同病原菌感染導致的血流感染的獨特浸潤模式，得到新的依據幫助快速診斷疾病。其次，本研究結果是基于公共數據庫和計算算法，可能無法完全反映實際情況。結果沒有使用細胞、動物或臨床樣本來驗證研究結論，需要在進一步的體外和體內實驗中來證實生物標志物在BSI中的作用。

4 結論

通過生物信息學分析，篩選出的OPLAH、RETN、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1、HK3和MMP9關鍵基因可作為BSI的診斷生物標志物，并且它們與多種免疫細胞浸潤顯著相關，預計上述免疫細胞將對BSI的發展產生重要影響，對這些免疫細胞和生物標志物進行深入研究將有助于識別免疫治療靶點并優化BSI的免疫調節治療。

參 考 文 獻

Kern W V， Rieg S. Burden of bacterial bloodstream infection—a brief update on epidemiology and significance of multidrug-resistant pathogens[J]. Clin Microbiol Infect， 2020， 26（2）： 151-157.

Choi H， Ahn H， Lee R.， et al. Bloodstream infections in patients with hematologic diseases： Causative organisms and factors associated with resistance[J]. Infect Chemother， 2022， 54（2）： 340.

陽央， 張曉麗， 王建敏， 等. 念珠菌血流感染臨床特征及死亡相關危險因素分析[J]. 中國真菌學雜志， 2023， 18（3）： 221-225.

Li Y L， Wu Y T， Gao Y L， et al. Machine-learning based prediction of prognostic risk factors in patients with invasive candidiasis infection and bacterial bloodstream infection： A singled centered retrospective study[J]. Bmc Infect Dis， 2022， 22（1）： 1-11.

趙玉婷， 廖黎， 王鏡雅， 等. 基于轉錄組學策略分析川銀花對耐藥銅綠假單胞菌生物被膜的影響[J]. 成都大學學報（自然科學版）， 2023， 42（2）： 119-124.

程琳琳， 李詹， 李永哲. 感染在自身免疫性疾病中的作用機制[J]. 協和醫學雜志： 2023，14（5）：925-931.

包相華， 劉文文， 鄒茹， 等. 革蘭陰性菌血流感染膿毒癥患者炎性因子和免疫功能及其診斷價值[J]. 中華醫院感染學雜志， 2023， 33（12）： 1795-1799.

付緒哲， 柳英杰， 牛明明， 等. 膿毒癥免疫抑制機制的研究進展[J]. 中國臨床研究， 2023， 36（5）： 741-745.

Duan T H， Du Y， Xing C S， et al. Toll-like receptor signaling and its role in cell-mediated immunity[J]. Front Immunol， 2022， 13： 812774.

李彩麗， 翟沙， 張靜， 等. 感染性休克外周血單核細胞TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路表達[J]. 中華醫院感染學雜志， 2022， 32（13）： 1931-1935.

劉永， 李子健， 康佳佳， 等. Toll樣受體及其與病原微生物感染關系的研究進展[J]. 畜牧與獸醫， 2022， 54（6）： 139-147.

丁燁， 任靜宜， 于洪強， 等. 病原相關分子模式和損傷相關分子模式在免疫炎癥反應中的作用[J]. 國際口腔醫學雜志， 2016， 43（2）： 172-176.

曹蘭秀， 呂娟， 趙嫻， 等. 基于TLRs/NODs受體與MAPK及NF-κB信號通路的朱砂七免疫調節機制研究[J]. 中國免疫學雜志， 2019， 35（4）： 424-428.

毛海燕， 陳元歡， 吉秀家， 等. 加味少腹逐瘀湯抑制NOD1/RIP2/NF-κB信號通路改善子宮內膜異位癥痛經大鼠異位內膜及炎性微環境[J]. 時珍國醫國藥， 2022， 33（10）： 2334-2338.

陳麗華， 裴奇， 周建黨. 兩種不同血培養系統對模擬菌血癥標本檢測能力的比較[J]. 中國感染控制雜志， 2023， 22（8）： 894-900.

金建文， 王倩倩， 王蔚， 等. 某三甲醫院重癥醫學科血培養污染現狀分析[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2022， 32（20）： 2544-2546.

Huang Z W， Fu Z Y， Huang W J， et al. Prognostic value of neutrophil-to-lymphocyte ratio in sepsis： A meta-analysis[J]. AJEM， 2020， 38（3）： 641-647.

劉靜靜， 蔡興龍， 黃玲. 幾種炎癥指標對細菌性血流感染預測診斷的比較分析與聯合應用評價[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（8）： 849-853.

孫天文， 楊柯. 血清PCT、CRP及NLR聯合檢測在細菌性血流感染診斷中應用研究[J]. 罕少疾病雜志， 2023， 30（1）： 101-102.

Sui Y D， Xin W N， Feng L L. Comparison of the clinical application values of PCT， hs-CRP and SAA detection in the early diagnosis of sepsis[J]. Pak J Med Sci， 2020， 36（7））： 1683-1687.

Souche E， Beltran S， Brosens E， et al. Recommendations for whole genome sequencing in diagnostics for rare diseases[J]. Eur J Hum Genet， 2022， 30（9）： 1017-1021.

鄭睿穎， 劉根焰. 機器學習在感染性疾病臨床預測模型中的應用進展[J]. 中國血吸蟲病防治雜志， 2023， 35（3）： 317-321.

楊森. 機器學習在生物序列問題中的應用研究[D]. 吉林大學， 2021.

田仁偉， 張少謙， 太鶴蓓， 等. 非特異性間質性肺炎關鍵基因與免疫細胞浸潤分析及中藥預測[J]. 中草藥， 2023， 54（15）： 4934-4947.

李帥， 梁群. 膿毒癥相關生物標志物的應用價值及中醫藥干預研究進展[J]. 遼寧中醫雜志， 2021， 48（5）： 196-200.

Leek J T， Johnson W E， Parker H S， et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments[J]. Bioinformatics， 2012， 28（6）： 882-883.

Mahajan P， Kuppermann N， Mejias A， et al. Association of RNA biosignatures with bacterial infections in febrile infants aged 60 days or younger[J]. Jama， 2016， 316（8）： 846-857.

Ahn S H， Tsalik E L， Cyr D D， et al. Gene expression-based classifiers identify Staphylococcus aureus infection in mice and humans[J]. Plos One， 2013， 8（1）： e48979.

Ritchie M E， Phipson B， Wu D I， et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies[J]. NAR， 2015， 43（7）： e47-e47.

Ferreira M R， Santos G A， Biagi C A， et al. GSVA score reveals molecular signatures from transcriptomes for biomaterials comparison[J]. J Biomed Mater Res A， 2021， 109（6）： 1004-1014.

Wu T Z， Hu E Q， Xu S B， et al. clusterProfiler 4.0： A universal enrichment tool for interpreting omics data[J]. The Innovation， 2021， 2（3）： 100141.

鄧燕君， 劉博文， 賀楨翔， 等. 基于網絡藥理學和分子對接法探索藿香正氣口服液預防新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）活性化合物研究[J]. 中草藥， 2020， 51（5）： 1113-1122.

杜志欣， 劉岳軒， 張一格， 等. 基于生物信息學研究宮內生長受限的免疫機制及中藥預測[J]. 中國免疫學雜志， 2024，40（2）： 225-232.

王京， 米芳， 高慧杰， 等. 加權基因共表達網絡分析方法及其應用[J]. 家畜生態學報， 2023， 44（3）： 92-96.

白志勛， 王艷平， 楊杰， 等. 基于機器學習聯合加權基因共表達網絡分析鑒定狼瘡腎炎潛在生物標志物[J]. 華西醫學， 2023， 38（7）： 996-1005.

Tai A M， Albuquerque A， Carmona N E， et al. Machine learning and big data： Implications for disease modeling and therapeutic discovery in psychiatry[J]. Artif Intell Med， 2019， 99： 101704.

Huang S J， Cai N G， Pacheco P P， et al. Applications of support vector machine （SVM） learning in cancer genomics[J]. Cancer Genom Proteom， 2018， 15（1）： 41-51.

Le T， Aronow R A， Kirshtein A， et al. A review of digital cytometry methods： Estimating the relative abundance of cell types in a bulk of cells[J]. Briefings Bioinform， 2021， 22（4）： bbaa219.

Chen B B， Khodadoust M S， Liu C L， et al. Profiling tumor infiltrating immune cells with CIBERSORT[J]. Cancer Systems Biol： Meth Proto， 2018： 243-259.

王盼， 別甜敏， 金文平， 等. 2012—2021年間血流感染病原菌分布及耐藥性分析[J]. 中國抗生素雜志， 2023， 48（4）： 445-452.

朱小燕， 黎興盛， 李文莉， 等. 新生兒血流感染病原菌分布及耐藥性分析[J]. 實驗與檢驗醫學， 2020， 38（1）： 126-127.

周婷婷， 覃仁利， 徐秋紅， 等. 94例念珠菌血流感染患者的臨床特點及死亡危險因素分析[J]. 中國真菌學雜志， 2023， 18（2）： 130-134.

羅國蘭， 李夢薇， 朱虹貞， 等. 2017—2020年柳州某醫院血流感染病原菌變遷及耐藥性分析[J]. 國外醫藥（抗生素分冊）， 2022， 43（4）： 267-271.

孫永杰. 血清免疫球蛋白、補體及炎癥因子水平對肺炎支原體感染患兒病情程度的評估價值[J]. 醫學理論與實踐， 2021， 34（7）： 1216-1217.

Luo Z， Tian M F， Yang G， et al. Hypoxia signaling in human health and diseases： Implications and prospects for therapeutics[J]. STTT， 2022， 7（1）： 218.

Palimkar P， Shaw R N， Ghosh A. Machine learning technique to prognosis diabetes disease： Random forest classifier approach[C]. Advanced Computing and Intelligent Technologies： Proceedings of Icacit 2021： Springer， 2022： 219-244.

Boukhatem C， Youssef H Y， Nassif A B. Heart disease prediction using machine learning[C]. 2022 Advances in Science and Engineering Technology International Conferences （ASET）： IEEE， 2022： 1-6.

高權新， 邢錢錢， 唐瓊英， 等. 細菌鞭毛蛋白與Toll樣受體5的互作關系研究進展[J]. 動物營養學報， 2020， 32（9）： 3979-3985.

劉艷娟， 顧瀟宵， 陳芳. 膿毒癥患者血清CEACAM1的表達及臨床意義[J]. 實用休克雜志（中英文）， 2021， 5（4）： 206-208.

Rivas-Ortiz C I， Morales-Guerrero S E， Ponce-de-León-Rosales S， et al. Overview of gene expression analysis in gastric disease infected with Helicobacter pylori： CLDN1 and MMP9 could be biomarkers for early diagnosis of gastric cancer[J]. Processes， 2022， 10（2）： 196.

Kot?owski R. Comparative analysis of mRNA transcripts of HT-29 cell line expressed in identical quantities for pathogenic E. coli strains UM146 and UM147 with control Escherichia coli Nissle 1917[J]. J Genom， 2022， 10： 1.

Kim W， Oh S J， Trinh N T， et al. Effects of RETN polymorphisms on treatment response in rheumatoid arthritis patients receiving TNF-α inhibitors and utilization of machine-learning algorithms[J]. Int Immunopharmacol， 2022， 111： 109094.

李延芳， 顧方方， 閔國美， 等. 慢性心力衰竭合并肺炎支原體感染外周血miRNA-21/PTEN表達與心肌損傷和預后的關系[J]. 中華醫院感染學雜志， 2022， 32（22）： 3386-3390.

Sarker M T， Saha S， Biswas P， et al. Identification of blood-based inflammatory biomarkers for the early-stage detection of acute myocardial infarction[J]. Netw Model Anal Health Inform" Bioinform， 2022， 11（1）： 28.

Shi L， Salamon H， Eugenin E A， et al. Infection with Mycobacterium tuberculosis induces the Warburg effect in mouse lungs[J]. Scientific Reports， 2015， 5（1）： 18176.