利福平降低hvKP毒力的機制及聯合CRO的體內外抗菌活性研究

摘要：目的 探索利福平（RFP）降低高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）莢膜合成的抗毒力能力及其與頭孢曲松（CRO）聯合用藥的體內外抗菌效果。方法 在2021年承德醫學院附屬醫院分離的肺炎克雷伯菌中篩選出4株符合hvKP判定標準的臨床菌株，使用PCR方法測定菌株的莢膜血清型，并使用多位點序列分型方法對菌株進行基因分型。采用莢膜多糖定量、墨汁染色、熒光定量PCR等方法分析RFP作用前后hvKP菌株莢膜含量、莢膜直徑以及莢膜相關基因表達量的變化。在此基礎上檢測RFP與CRO聯合用藥的體外抗菌效果，并建立大蠟螟感染模型，分析二者聯合使用的體內抗菌療效。結果 在篩選的4個hvKP菌株中，10號和35號菌株均為K1-ST23型，12號菌株為K57-ST592型，96號菌株為K5-ST485型。1/4 MIC濃度的RFP可以在不明顯影響細菌生長的情況下顯著降低莢膜多糖含量（Plt;0.05），減小莢膜直徑（Plt;0.001）并下調莢膜合成相關基因的轉錄水平（Plt;0.001）。4個菌株RFP和CRO聯合藥敏試驗結果FIC指數均表現為協同或部分協同效應，且hvKP感染后的大蠟螟幼蟲經CRO+1/4MIC RFP治療后，生存率明顯高于CRO單藥治療時的生存率（Plt;0.05）。結論 利福平具有抑制hvKP莢膜合成的抗毒力能力并可通過減少黏液生成增強藥物滲透性而提高抗菌藥物療效。

關鍵詞：高毒力肺炎克雷伯菌；利福平；抗毒力；聯合用藥

中圖分類號：R978.3 文獻標志碼：A

Study on the mechanism of rifampicin in reducing the virulence of hvKP and its antimicrobial activity in combination with CRO in vitro and in vivo

Abstract Objective To explore the ability of rifampicin （RFP） to reduce the capsule synthesis of hypervirulent Klebsiella pneumoniae （hvKP） and the antibacterial effect of RFP combined with ceftriaxone （CRO） in vitro and in vivo. Methods Four clinical strains that conformed to the criteria for hvKP were screened from Klebsiella pneumoniae isolated from the Affiliated Hospital of Chengde Medical University in 2021. The capsular serotypes of the strains were determined by PCR， and the genotypes of the strains were determined by multilocus sequence typing. Capsular polysaccharide quantification， India ink staining， and fluorescence quantitative PCR were used to analyze the changes in capsule content， capsule diameters， and expression of capsule-related genes of hvKP strains before and after RFP treatment. On this basis， the antibacterial effect of RFP combined with CRO in vitro was detected， and a Galleria mellonella infection model was established to analyze the antibacterial effect of the combination of RFP and CRO in vivo. Results Among the four hvKP strains screened， strains 10 and 35 were K1-ST23 type， strain 12 was K57-ST592 type， and strain 96 was K5-ST485 type. RFP at 1/4 MIC concentration significantly decreased capsular polysaccharide content （Plt;0.05）， decreased capsule diameters （Plt;0.001） and down-regulated the transcription levels of genes involved in capsule synthesis （Plt;0.001） without significantly affecting bacterial growth. The FIC index of RFP and CRO combined drug sensitivity test results of 4 strains showed synergistic or partial synergy effects， and the survival rate of Galleria mellonella larvae after hvKP infection treated with CRO+1/4MIC RFP was significantly higher than that of CRO monotherapy （Plt;0.05）. Conclusion Rifampicin has the anti-virulence ability to inhibit hvKP capsule synthesis and can improve the efficacy of antibacterial drugs by reducing mucus production and enhancing drug permeability.

Key words HvKP; Rifampicin; Anti-virulence; Drug combinations

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae， KP）是臨床常見的條件致病菌，根據毒力特點可將其分為普通型肺炎克雷伯菌（classic" Klebsiella pneumoniae，cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent" Klebsiella pneumoniae，hvKP）[1]。HvKP具有高毒力、高侵襲力以及高致死率和致殘率等特點，并且流行率逐年增高[2]，對人類健康造成巨大威脅。HvKP多數具有高黏液表型，莢膜多糖是其最重要的毒力因子之一[3]。除對氨芐西林天然耐藥外，hvKP通常對常用抗生素敏感，但菌體表層豐富的莢膜阻礙了抗生素滲透進入菌體內部發揮抗菌作用，往往導致抗生素治療效果不佳而預后不良[4]。目前，國內外學者對于hvKP的流行病學及致病機制研究較多，而對于hvKP治療方面的研究很少。近期有研究表明，利福平能夠明顯抑制hvKP莢膜多糖的生物合成，顯著降低莢膜厚度，具有很強的黏液抑制活性，但具體機制未明[5]。本研究旨在通過研究利福平對hvKP菌株的抗黏液能力及機制并在此基礎上探究利福平與頭孢曲松（CRO）聯合使用治療hvKP的體外及體內抗菌效果，探討利福平抑制hvKP莢膜合成的抗毒力能力并通過減少黏液生成增強藥物滲透性而提高抗菌療效的能力，以期為hvKP的臨床治療提供新的思路和方案。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

在2021年度承德醫學院附屬醫院兩院區檢驗科臨床微生物室分離的KP菌株中，使用拉絲實驗檢測高黏液表型及聚合酶鏈式反應（PCR）檢測hvKP相關毒力基因，篩選出4株不同標本來源并符合判定標準的hvKP菌株作為本研究的實驗菌株。

1.2 HvKP判定標準

相關文獻表明，以rmpA、rmpA2、iroB、iucA、和peg-344 5種毒力基因陽性作為hvKP的診斷標準準確率大于95%[6]。本研究以KP菌株具備高黏液表型且以上5種毒力基因同時陽性作為hvKP的判定標準。

1.3 主要儀器及試劑

DNA Engine Peltier熱循環儀（美國MJ Research公司）；雙穩定時電泳儀（北京六一儀器廠）；C200凝膠成像系統（北京深藍云生物科技有限公司）；PCR引物（上海生工生物有限公司）；大腸埃希菌ATCC 25922（美國菌種保存中心）；利福平標準品、頭孢曲松鈉標準品（北京索萊寶科技有限公司）；酶標儀（美國Thermo公司）；新型隱球菌染色液（珠海貝索生物技術有限公司）；培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量預混試劑（北京天根生化科技有限公司）；熒光定量PCR儀Roche480（美國Roche公司）；大蠟螟幼蟲（科云生物公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 高黏液表型分析

使用拉絲實驗檢測菌株的高黏液表型。將KP菌株接種于血瓊脂平板，37 ℃培養16～18 h后，使用細菌接種環輕柔挑起一單個菌落，重復牽拉3次。若3次挑起的黏液絲長度均≥5 mm，則為拉絲實驗陽性，即該菌株具有高黏液表型。

1.4.2 毒力基因、莢膜血清型檢測及多位點序列分型（MLST）

煮沸法提取細菌DNA模板保存于-20 ℃備用。采用PCR技術擴增5種毒力基因（rmpA、rmpA2、iroB、iucA和peg-344）、6種莢膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57）以及KP的7個管家基因（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB），目的基因引物序列、退火溫度及產物長度參考相關文獻[6-8]，引物合成由上海生物工程有限公司完成。反應總體系為25 μL：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，無菌dd H2O 9.5 μL，2×Taq Master mix 12.5 μL。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后觀察特異性條帶，7個管家基因的陽性擴增產物送至上海生工生物工程公司測序，測序結果登錄肺炎克雷伯菌MLST數據庫（https：//pubmlst.org/bigsdb？db=pubmlst_mlst_seqdef）進行在線比對，確定每個菌株的序列型（ST）。

1.4.3 利福平藥物敏感性試驗

利福平對每個菌株的最低抑菌濃度（MIC）使用微量肉湯稀釋法進行測定。挑取 37 ℃過夜培養的單個菌落于無菌生理鹽水中，配制1.5×108 CFU/mL菌懸液，后用MH肉湯稀釋100倍備用。用MH肉湯倍比稀釋RFP溶液，取稀釋后的RFP溶液和菌液各

100 μL加入96孔無菌藥敏板中，使其最終藥物濃度分別為 64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25 μg/mL。

以ATCC 25922作為質控菌株，每株菌做3個平行對照。將接種好的藥敏板置于37 ℃溫箱內孵育16～20 h后，觀察細菌生長情況，判讀MIC值。

1.4.4 細菌生長曲線繪制

取過夜培養的單個菌落于無菌生理鹽水中配制1.5×108 CFU/mL菌懸液，并用LB肉湯稀釋100倍備用。取LB肉湯稀釋后的RFP溶液和菌液各100μL加入96孔板中，使每孔最終藥物濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、0等，并設置空白對照組，每一濃度設3個復孔。將接種好的96孔板置于37 ℃、200 r/min的條件下震蕩培養，每2 h置于600 nm處測量吸光度至18 h，取每組數據的平均值（A值）進行分析，繪制每個菌株在不同濃度RFP作用下的細菌生長曲線。

1.4.5 莢膜多糖（CPS）含量的檢測

KP菌株CPS的提取及含量測定參照文獻[9]。將細菌與不同濃度RFP（1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、0）在LB肉湯中37 ℃共同過夜孵育，取500 μL過夜培養的肉湯培養物與100 μL含有1% zwittergent 3-14 的檸檬酸（pH 2.0）混合，50 ℃孵育20 min；離心后取250 μL上清液，加入1 mL無水乙醇，冰浴20 min沉淀CPS；離心去掉上清液，沉淀在管底的CPS晾干后用200 μL蒸餾水溶解。同時配制系列濃度（0、50、100、150、200和250 mg/L）的葡萄糖醛酸溶液，每一濃度取200 μL，連同提取好的CPS均進行以下操作：每管加入1.2 mL四硼酸鈉-硫酸溶液，振蕩混勻，置于沸水浴中加熱5 min后取出，置于冰水浴中冷卻后加入1.5 mg/ mL間羥基聯苯溶液

20 μL；充分震蕩搖勻5 min后，取200 μL置于96孔板中520 nm處測量吸光度。將各菌株溶液測得的A值帶入標準曲線公式，并除以菌株濃度，即可得各菌株最終CPS含量（以糖醛酸含量來表示）。根據細菌生長曲線及CPS含量測定綜合分析，得到明顯抑制菌株莢膜生成且對細菌生長影響最小的RFP濃度，以該濃度作為后續研究的實驗濃度。

1.4.6 墨汁染色

將不含RFP與含有RFP的細菌分別在LB肉湯中37 ℃過夜孵育后調至同一濃度，取少量培養物與等量墨汁混合后加蓋玻片，置于油鏡下觀察并記錄莢膜直徑。每一標本制備3張玻片，每個細菌細胞周圍透明區最短直徑記錄為莢膜直徑，隨機選取3個視野中觀察到的所有細胞計算莢膜平均直徑。

1.4.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

RT-qPCR分析利福平作用前后4個菌株莢膜多糖結構基因galF、manC、wzi，黏液表型調節基因rmpA、rmpA2以及鐵載體相關基因iucA和iroB的相對表達量。以23sRNA作為內參基因，用2-ΔΔCt算法計算RFP作用前后基因的相對表達量。引物序列參照相關文獻[5]，引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.4.8 聯合藥敏試驗

微量肉湯稀釋法測定4個菌株CRO的MIC值，方法參見“1.4.3”項。根據RFP和CRO的MIC值設計聯合藥敏實驗的藥物稀釋度。采取棋盤稀釋法，將兩種藥物用MH肉湯倍比稀釋，設置8個稀釋濃度，RFP和CRO測試濃度分別為1～128 μg/mL、0.002～0.25 μg/mL。兩種藥物交叉組合呈棋盤式分布，每一橫排依次加入由高濃度到低濃度的RFP溶液，每一豎排依次加入由高濃度到低濃度的CRO溶液，每孔加入不同藥液各50 μL共計100 μL，再將MH肉湯稀釋后的菌懸液100 μL加入每孔中，并設置陰、陽性對照孔。置于37 ℃溫箱培養18～20 h觀察結果，記錄兩種藥物聯合使用時各自的MIC值，以計算FIC指數（fractional inhibitory concentration index， FICI）。FIC指數計算與判讀標準如下[10]：FIC=MIC甲藥聯合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯合/MIC乙藥單用；FICI≤0.5，協同效應；0.5＜FICI＜1，部分協同效應；1為相加效應；1＜FICI＜4，無關效應；FICI≥4，拮抗效應。

1.4.9 大蠟螟毒力試驗

將不同KP菌株通過倍比稀釋法分別配置成1.0×108 CFU/mL至1.0×102 CFU/mL不同濃度的菌液，每組20只幼蟲，并設置雙蒸水對照組和空白對照組。將配制的菌液用25 μL微量進樣器經右后足注射10 μL入幼蟲體腔，雙蒸水對照組注射10 μL雙蒸水，空白對照組不做任何處理。將各組大蠟螟分別置于一次性培養皿中于37 ℃培養箱中孵育96 h， 記錄注射后24、48、72和96 h大蠟螟的存活情況，每組試驗重復3次，記錄96 h每個菌株的80%致死量（LD80）。

1.4.10 大蠟螟體內抗菌藥物敏感試驗

根據毒力試驗96 h對應的LD80進行菌液濃度的配制。每株菌設置5組，每組20只幼蟲，第1～3組注射相應濃度的菌液，第4組注射無菌雙蒸水，第5組為空白對照組。幼蟲37 ℃孵育2 h后進行藥物注射，試驗組大蠟螟幼蟲（以250 mg換算）的頭孢曲松用量一次性模擬人體（以50 kg換算）給藥劑量2 g/50 kg進行抗菌藥物治療，利福平用量以每個菌株1/4 MIC對應的藥物濃度作為給藥劑量。

第1組大蠟螟幼蟲給予CRO 10 μg·10 μL，第2組幼蟲給予CRO 10 μg·5 μL與1/4 MIC RFP 5 μL聯合治療，第3、4、5組不做任何處理。將幼蟲置于37 ℃培養箱中孵育96 h，每隔24 h觀察并記錄幼蟲的死亡數量。每組試驗重復3次，每次試驗相隔24 h以上。

1.5 統計學分析

采用IBM SPSS Statistics軟件進行t檢驗統計分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KP菌株高黏液表型、毒力基因、莢膜血清型、MLST分型及臨床資料分析

4株KP菌株均表現為拉絲試驗陽性且5種毒力基因陽性。4株菌均來自于住院患者標本，其中10號和35號菌株均為K1-ST23型，標本類型分別為膿液和血液；12號菌株為K57-ST592型，96號菌株為K5-ST485型，分別來自于痰液和尿液標本（圖1～2）。

2.2 RFP藥物敏感性結果

經微量肉湯稀釋法測定，10、12和96號菌株RFP的MIC值均為16 μg/mL，35號菌株MIC值為8 μg/mL。

2.3 細菌生長曲線分析

為觀察不同濃度RFP對hvKP菌株生長的影響繪制了細菌生長曲線（圖3）。從生長曲線可以看出，當RFP濃度小于或等于1/4 MIC時，細菌的生長幾乎不會受到影響。

2.4 CPS含量測定結果

采用間羥基聯苯比色法檢測不同濃度RFP作用后菌株CPS含量的變化，結果顯示RFP可明顯抑制hvKP菌株的CPS生成，且抑制程度隨RFP濃度增高而增強，差異具有統計學意義（圖4）。以細菌生長曲線和RFP作用后CPS含量變化綜合判斷，1/4 MIC RFP可明顯減少CPS生成并且幾乎不抑制hvKP的生長。

2.5 墨汁染色觀察莢膜直徑

使用墨汁負染法對RFP作用前后細菌菌體進行染色，發現1/4 MIC RFP作用后菌體莢膜直徑明顯減低，差異具有統計學意義（圖5～6）。

2.6 實時熒光定量PCR基因表達情況分析

1/4 MIC RFP作用前后相關基因的相對表達量經RT-qPCR檢測，結果顯示，RFP作用后的菌株莢膜多糖結構基因galF、manC、wzi和黏液表型調節基因rmpA和rmpA2表達明顯下調，差異具有統計學意義，鐵載體相關基因iucA和iroB表達無明顯變化（圖7）。

2.7 聯合藥敏試驗結果

經微量肉湯稀釋法測定，10號菌株CRO的MIC值為0.015 μg/mL，12、35、96號菌株CRO的MIC值均為0.03 μg/mL。棋盤稀釋法聯合藥敏試驗結果顯示，10號菌株FICI為0.5，96號菌株FICI為0.375，12和35號菌株FICI均為0.75，4個菌株RFP和CRO聯合藥敏試驗結果FIC指數均表現為協同或部分協同效應。

2.8 大蠟螟感染模型體內藥敏試驗生存率分析

大蠟螟毒力試驗結果顯示，10號和35號菌株的LD80為105 CFU/mL，12號和96號菌株的LD80為

107 CFU/mL。體內藥敏試驗結果顯示，1/4 MIC RFP與CRO聯合用藥時大蠟螟幼蟲的生存率明顯高于單用CRO時的生存率，差異具有統計學意義（Plt;0.05），見圖8。

3 討論

CPS由直鏈或支鏈低聚糖組成[11]，能對抗中性粒細胞和血清補體對細菌的吞噬和殺傷作用，可與宿主產生的抗菌肽相結合，降低宿主的免疫應答[12]，在細菌的黏附和遠處定植中發揮重要作用，因此CPS是hvKP重要的毒力因子[13]。本研究以具備高黏液表型且rmpA、rmpA2、iroB、iucA和peg-344 5種毒力基因陽性作為hvKP的判定標準，分析了RFP作用前后細菌CPS含量、莢膜直徑以及莢膜合成相關基因的相對表達量。結果發現1/4 MIC的RFP可以在不明顯影響細菌生長的情況下顯著降低CPS含量，減小莢膜直徑并下調莢膜合成相關基因的轉錄水平，表明RFP具有減少hvKP莢膜多糖的抗黏液能力從而表現出顯著的抗毒力能力。

CPS編碼基因位于染色體操縱子cps基因簇上，參與CPS合成、聚合、裝配等，KP的cps簇通常包含3個啟動子，分別位于galF、wzi和manC的上游[14]。轉錄調控因子rmpA上調cps簇中啟動子的活性，調控莢膜合成，促進黏液表型形成并增強菌株毒力[15]。rmpA2與rmpA同源，具有80%的同一性，二者均可促進莢膜生成[16]。除莢膜合成相關基因外，鐵載體也是hvKP重要的毒力因子，hvKP能產生4種鐵載體：腸桿菌素、耶爾森菌素、沙門菌素和氣桿菌素，其中編碼氣桿菌素和沙門菌素的基因存在于pLVPK毒力質粒上，是hvKP特有的毒力因子，氣桿菌素由iucABCD編碼，沙門菌素由iroBCDN編碼[17]。本研究測定了1/4 MIC利福平作用后上述幾種毒力基因的相對表達量，結果顯示，RFP作用后的菌株CPS結構基因galF、manC、wzi和黏液表型調節基因rmpA、rmpA2表達明顯下調，鐵載體相關基因iucA、iroB表達無明顯變化。這表明RFP可能通過抑制rmpA和rmpA2轉錄，使cps基因表達水平降低，從而降低黏液黏度和莢膜的產生，進而降低菌株毒力，但RFP對于鐵載體無抑制作用。

HvKP除對氨芐西林天然耐藥外，在體外藥敏試驗中通常對其他抗生素敏感，但往往臨床治療效果不佳。莢膜過表達形成的物理屏障能夠阻礙hvKP菌株獲得耐藥質粒而使其抗生素敏感[18]，但同時也阻礙了藥物的滲透，使得抗菌藥物難以進入菌體內部發揮殺菌作用。近年來，隨著hvKP菌株分離率的增高及廣譜抗生素長時間的暴露，CR-hvKP甚至MDR-hvKP的檢出也有所報道，并呈現逐年增多的趨勢，高毒力與耐藥性的重疊勢必會給hvKP的臨床治療帶來重大挑戰[19]。

RFP為利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，對結核分枝桿菌和部分非結核分枝桿菌在宿主細胞內外均有明顯的殺菌作用，但對KP通常無抗菌作用。Namikawa等[5]發現RFP能夠減少hvKP莢膜多糖合成，本研究前期證實了RFP確實具有抑制hvKP莢膜生成，降低菌株黏度的作用，所以猜測通過RFP與其他常用于治療KP感染的抗菌藥物聯合應用或可提高臨床中hvKP的治療效果。CRO為半合成第三代注射用頭孢菌素，對需氧革蘭陽性菌、革蘭陰性桿菌及部分厭氧菌具有高度抗菌活性，它具有半衰期長、不良反應少、價格適中、組織分布廣、易透過血腦屏障等優點，是臨床治療克雷伯菌感染的常用抗菌藥物。因此進行了RFP與CRO聯合應用的體外及體內藥物敏感性試驗，體外試驗表明，4個菌株RFP和CRO聯合藥敏試驗結果FIC指數均表現為協同或部分協同效應。

大蠟螟是大蠟蛾的幼蟲，它們價格低廉、容易獲得，并且操作簡單、無需特殊實驗室設備，使用不需要倫理批準[20]。近年來，它作為哺乳動物感染模型的理想替代品而用于研究各種人類病原微生

物[21-22]。此外，大蠟螟感染模型用于研究抗菌藥物在體內的毒性和有效性能夠提供快速、廉價和可靠的評估[21]。本研究中大蠟螟感染模型體內藥敏試驗結果顯示，hvKP感染后的大蠟螟幼蟲經CRO+1/4 MIC RFP治療后，生存率明顯高于CRO單藥治療時的生存率，表明這種聯合用藥模式可能對于治療hvKP引起的感染具有更佳的治療效果。

本課題以hvKP菌株的高黏液表型作為研究核心，研究了RFP對hvKP菌株的抗黏液能力及RFP與CRO聯合治療hvKP的體內外抗菌效果，驗證了利福平抑制hvKP莢膜合成的抗毒力能力并通過減少黏液生成增強CRO藥物滲透性而提高抗菌藥物療效的能力，為hvKP的臨床治療提供了新的思路和方案。但本研究仍存在很多局限性，比如，本研究的實驗結果表明，采用RFP與CRO聯合使用治療hvKP在體內外均具有優于CRO單用的治療效果，但具體如何用于臨床治療仍需要進一步的臨床試驗證實。由于RFP具有肝毒性，因此肝功能不良的患者需謹慎使用，RFP可作為肝功能正常患者hvKP感染治療效果不佳時的備選治療方案；另外有相關資料顯示[23]，RFP與其他藥物合用時可能降低聯用藥物的濃度，雖未檢索到RFP與頭孢類藥物聯合使用導致后者濃度降低的相關報道及資料，但仍需進一步證實，本課題組將在后續研究中通過小鼠實驗檢測血藥濃度進行驗證；此外，RFP導致rmpA和rmpA2轉錄水平降低的機制尚不清楚，有報道稱RFP與某些未知靶點結合可能導致基因轉錄水平的改變[5]；大蠟螟體內藥敏試驗結果以蟲體的死亡數量進行療效判斷，無法排除幼蟲因其他原因死亡的可能性，具有不穩定性[20]；RFP只對具備高黏液表型的hvKP菌株有抗黏液作用，對拉絲試驗陰性的hvKP菌株無法進行抗毒力治療。因此，雖RFP可以作為治療hvKP感染的潛在抗毒力藥物，但如何應用于臨床仍需進一步探索。

參 考 文 獻

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