耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生物膜形成與外排泵基因AdeABC表達的相關性研究

摘要：目的 研究鮑曼不動桿菌的生物膜形成，以及浮游態(tài)和生物膜狀態(tài)下對外排泵基因AdeABC的相對表達量作用于碳青霉烯類抗生素耐藥機制的影響。方法 將菌株經(jīng)藥物敏感性試驗分為碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌（CRAB）組和碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌（CSAB）組，采用結晶紫染色法檢測兩組生物膜形成能力；通過微量肉湯稀釋法分別測定兩組對亞胺培南的MIC、MBIC值，并計算MBIC/MIC的比值進一步比較分析生物膜菌和浮游菌的耐藥性；同時提取CRAB組浮游態(tài)和生物膜態(tài)的RNA，通過RT-qPCR檢測外排泵基因AdeABC相對表達量。結果 35株標本的生物膜陽性率為91.43%，其中CRAB組生物膜的陽性檢出率為92%，生物膜陰性、弱陽性、陽性和強陽性分別占8%、48%、36%和8%。MBIC/MIC比值顯示，形成生物膜后，鮑曼不動桿菌的耐藥能力呈現(xiàn)不同程度的增加，CSAB組的耐藥增加幅度以2倍的菌株最多；CRAB組的增加幅度以4倍的菌株最多。同時CRAB組RT-qPCR結果顯示，生物膜較浮游態(tài)相比，外排泵基因adeA和adeB的相對表達量明顯增高（Plt;0.01），外排泵基因adeC相對表達量則無差異（P＞0.05）。結論 鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥與生物膜密切相關，且生物膜態(tài)的鮑曼不動桿菌較浮游態(tài)可促進外排泵基因AdeABC的表達從而增強碳青霉烯類抗生素的耐藥性。

關鍵詞：鮑曼不動桿菌；亞胺培南；生物膜；外排泵

中圖分類號：R446.5 文獻標志碼：A

Correlation between biofilm formation and efflux pump gene AdeABC expression in carbapenem resistant Acinetobacter baumannii

Abstract Objective To study the formation of biofilm in Acinetobacter baumannii and the effect of the relative expression level of the efflux pump gene AdeABC on the resistance mechanism of carbapenem antibiotics in both planktonic and biofilm states. Methods The strains were divided into the carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii （CRAB） group and the carbapenem-sensitive Acinetobacter baumannii （CSAB） group by drug sensitivity testing， and the biofilm formation ability of the two groups was detected using the crystal violet staining method. The MIC and MBIC values of two groups of imipenem using the micro broth dilution method were measured， and the MBIC/MIC ratio was calculated to further compare and analyze the drug resistance of biofilm bacteria compared to planktonic bacteria. Simultaneously， RNA from both planktonic and biofilm states of the CRAB group was extracted， and the relative expression level of the efflux pump gene AdeABC through RT-qPCR was detected. Results The positive rate of biofilm in 35 specimens was 91.43%， of which the positive detection rate of biofilm in the CRAB group was 92%. The negative， weakly positive， positive， and strongly positive biofilms accounted for 8%， 48%， 36%， and 8%， respectively. The MBIC/MIC ratio showed that after the formation of biofilm， the resistance of Acinetobacter baumannii increased to varying degrees， with the CSAB group showing the most significant increase in resistance compared to strains with a 2-fold increase; The increase in CRAB group was highest among strains with a 4-fold increase. At the same time， the RT-qPCR results of the CRAB group showed that the relative expression levels of the efflux pump genes adeA and adeB were significantly increased compared to the planktonic state of the biofilm （Plt;0.01）， while the relative expression levels of the efflux pump gene adeC were not significantly different （Pgt;0.05）. Conclusion The carbapenem resistance of Acinetobacter baumannii was closely related to biofilm， and the biofilm state of Acinetobacter baumannii could promote the expression of the efflux pump gene AdeABC compared to the floating state， thereby enhancing the resistance of carbapenem antibiotics.

Key words Acinetobacter baumannii; Imipenem; Biofilm; Efflux pump

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii， Ab）是最常見的一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于醫(yī)療器械表面，故常引起醫(yī)院感染，主要是感染呼吸道，是免疫功能低下人群感染的重要病原菌之一[1]?？股厥悄壳皬V泛應用于臨床治療細菌感染的重要手段，碳青霉烯類抗生素[2]因有著廣譜、高效、毒性低等優(yōu)點，已成為治療革蘭陰性桿菌感染一線抗菌藥物之一，然因其臨床使用量和強度的增加，碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌（carbapenem-sensitive Acinetobacter baumannii，CSAB）逐漸減少，相反，碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）逐漸呈現(xiàn)上升趨勢[3-4]。據(jù)2021年吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院細菌耐藥性監(jiān)測顯示，鮑曼不動桿菌對美羅培南和亞胺培南的耐藥率高達68.7%[5]，耐藥形勢十分嚴重，甚至CRAB被世界衛(wèi)生組織列為優(yōu)先一級耐藥菌之一。引起鮑曼不動桿菌的耐藥機制[6-8]主要包括產生碳青霉烯酶、外排泵的過度表達、外膜蛋白的缺失及突變以及生物膜的形成等。故本研究從生物膜維度著手，聯(lián)合表型（生物膜形成能力、MBIC/MIC值）和基因型（外排泵基因AdeABC mRNA相對表達量）兩方面探討鮑曼不動桿菌與碳青霉烯類抗生素耐藥間的相關性，為臨床鮑曼不動桿菌感染治療的研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1 標準菌株與標本來源

標準菌株ATCC19606保存于本實驗室，35株鮑曼不動桿菌均來自北華大學附屬醫(yī)院檢驗科痰液標本。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

霉菌培養(yǎng)箱（MJX-160B-Z）（上海博迅實業(yè)有限公司）；生物安全柜（BSC-1600ⅡB2）（上海蘇凈實業(yè)有限公司）；細菌濁度儀（WGZ-2XJ）（上海昕瑞儀器儀表有限公司）；酶標儀（SPARK 10M）（TECAN）；Piko Real實時定量PCR儀（TCR0024）（美國Thermo Fisher Scientific）。

1.2.2 主要試劑

GelredTM 核酸凝膠染料，10，000X （美國 Biotium公司）；PBS、TBS和0.1%結晶紫溶液均由本實驗室自行配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株復蘇及分離培養(yǎng)

將Ab標本于LB平板進行復蘇、分離培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況。

1.3.2 亞胺培南MIC值的測定[9]

在無菌96孔板中加入100 μL LB液體、10 μL過夜振蕩的菌液和100 μL梯度稀釋過的亞胺培南溶液（最終濃度梯度為128、64、32、16、8、4、2、1和

0.5 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察細菌生長情況，以澄清孔的最低濃度為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。參照CLSI標準判定[10]。

1.3.3 生物膜構建及測定

于無菌96孔板加入100 μL LB液體和10 μL過夜振蕩的菌液， 37 ℃孵育48 h后，棄孔內培養(yǎng)液并用無菌PBS洗滌，加入150 μL甲醇固定，再加入100 μL 0.1%的結晶紫溶液染色，染色結束后吸出染液干燥，用雙蒸水洗滌3次，每隔8、12、24、48、72和96 h用光學顯微鏡觀察生物膜形成情況。最后加入100 μL 33%冰醋酸溶解，酶標儀測定A570值。A值為陰性對照均值與3倍標準偏差之和。生物膜判定標準[11]：A570≤A，不產生生物膜即陰性（-）；A＜A570≤2A，產生弱生物膜即弱陽性（±）；2A＜A570≤4A，產生中等生物膜即陽性（+）；A570＞4A，產生強生物膜即強陽性（++）。

1.3.4 亞胺培南對臨床鮑曼不動桿菌的MBIC值測定

同“1.3.3”構建生物膜，吸取孔內培養(yǎng)液并棄去，用無菌PBS洗滌3次，向各孔分別加入200 μL倍比稀釋過的亞胺培南溶液（1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC和16×MIC），37 ℃培養(yǎng)18～24 h，每個標本對每個藥物濃度設置3個復孔，肉眼觀察細菌生長情況，以未見孔內渾濁的最低藥物濃度為最小生物膜抑菌濃度（minimal biofilm inhibitory concentration，MBIC）。

1.3.5 外排泵基因AdeABC的相對表達量

采用改良Trizol法[12]提取CRAB組浮游態(tài)和生物膜狀態(tài)的RNA，以cDNA為模板，16S rRNA 為內參基因，RT-qPCR法檢測并計算外排泵基因AdeABC的相對表達量，每個菌株重復測定3次。其反應體系：RealStar Mixture 10 μL，引物各0.4 μL，cDNA 0.4 μL，用ddH2O補齊至20 μL；反應條件為95 ℃

10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對CRAB組浮游態(tài)和生物膜態(tài)的外排泵基因AdeABC相對表達量比較采用兩獨立樣本t檢驗，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義，Plt;0.01為明顯差異；組間生物膜形成能力采用χ2檢驗；MIC和MBIC相關性分析采用Sperman秩相關；以Plt;0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物膜半定量測定

本研究采用了結晶紫染色法測定35株鮑曼不動桿菌的生物膜，光學顯微鏡下可見培養(yǎng)24 h后已形成網(wǎng)狀結構呈現(xiàn)初步生物膜狀態(tài)，隨著時間的延長，發(fā)現(xiàn)已形成厚厚的生物膜，遍布整個視野（圖1）。酶標儀A570結果顯示，35株標本的生物膜陽性檢出率高達91.43%，有3株（8.57%）不產生生物膜，其中生物膜陰性、弱陽性、陽性和強陽性分別占8.57%、45.71%、31.43%和14.29%。其中CRAB組和CSAB組具體生物膜形成構成比見表1，且耐藥菌株以產生弱生物膜和中等生物膜為主。

2.2 MIC和MBIC值的測定

亞胺培南對35株鮑曼不動桿菌標本的MIC值為0.5～16 μg/mL，MBIC值為0.5～128 μg/mL。具體的分布株數(shù)見表2。MIC值與MBIC值呈正相關（rs=0.933，P＜0.0001）。結果表明，形成生物膜后，鮑曼不動桿菌的耐藥能力呈現(xiàn)不同程度的增加，其耐藥增幅以MBIC/MIC值表示，CSAB組的增加幅度以2倍（55.56%）的菌株最多；CRAB組的增加幅度以4倍（52.17%）的菌株最多。

2.3 外排泵基因AdeABC的相對表達量

16S rRNA作為內參基因，對CRAB組浮游態(tài)和生物膜的RNA提取，比較兩組外排泵基因AdeABC mRNA相對表達量，發(fā)現(xiàn)生物膜組的adeA和adeB基因的相對表達量較浮游態(tài)顯著增高，其差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01），adeC相對表達量則無差異（P＞0.05）。應用GraphPad Prism 9軟件繪制柱形圖，其相對定量結果見圖2。

3 討論

近年來，臨床鮑曼不動桿菌檢出率不斷增加，使用過多種抗菌藥物治療，發(fā)現(xiàn)其耐藥率居高不下。碳青霉烯類抗菌藥物作為臨床治療的最后一道防線，因不合理使用，發(fā)現(xiàn)臨床鮑曼不動桿菌分離菌對該抗生素耐藥率呈現(xiàn)增長趨勢。因此，對于碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥機制的研究已引起人們廣泛的重視和關注。

生物膜是CRAB中重要的耐藥機制之一，細菌生物膜是被生物大分子包裹的細菌聚集體[13]。除了可在固體表面定植外，其還對抗生素有與生俱來的抵抗能力從而增強耐藥性難以治療[14]。生物膜不僅限制了抗菌藥物進入體內的作用靶點以使得抗生素濃度顯著降低不足以發(fā)揮抗菌作用，而且也可影響外排泵基因相對表達從而引起耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，外排基因A1S-1751（可編碼adeA膜融合蛋白基因）在生物膜細胞中顯著表達[15]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，生物膜狀態(tài)的adeB的相對表達量顯著增高[16]；故生物膜形成促進外排泵基因表達從而加強耐藥。

本研究通過結晶紫半定量檢測CSAB和CRAB組的生物膜，實驗結果顯示CRAB組生物膜陽性檢出率高達92%，說明臨床鮑曼不動桿菌所引起的感染大多與生物膜的形成相關，提示是鮑曼不動桿菌引起慢性感染的原因。這一結果與方甜甜等[17]收集的36株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生物膜陽性率為100%相類似，都存在著較高水平，這可能與地域、臨床科室以及bap基因多態(tài)性相關。微量肉湯稀釋法檢測MIC值、MBIC值，結果顯示，其MBIC值與MIC值呈正相關，耐藥增幅在1～8倍之間。CSAB組以2倍為主，而CRAB組主要以4倍最多，提示同一標本從浮游態(tài)轉變?yōu)樯锬B(tài)時，耐藥能力也相應增強，其MIC值會升高2～4倍。造成MIC值增高的原因可能是由于生物膜，形成了天然的屏障阻礙了抗生素的滲入或是誘發(fā)細菌中的某個系統(tǒng)的適應性應答增強了耐藥性[18]。另外通過RT-qPCR對CRAB組浮游態(tài)和生物膜的外排泵基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)生物膜較浮游態(tài)外排泵基因adeA和adeB的相對表達量顯著增高，而外排泵基因adeC相對表達量則是無差異。證明了生物膜的形成可引起部分外排泵基因的上調從而增強細菌耐藥性。綜上，生物膜狀態(tài)的細菌對抗生素耐藥、宿主免疫防御系統(tǒng)的抵抗以及外界環(huán)境都有著其重要的影響，故望通過對生物膜形成能力與耐藥表型間關系的研究，找到相應的作用靶點，為臨床鮑曼不動桿菌生物膜所引起的感染的治療提供新思路。

參 考 文 獻

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