基于PI3K/Akt/mTOR信號通路探討LINC00173對多囊卵巢綜合征顆粒細胞自噬的影響

摘要：目的 探討長鏈非編碼RNA 00173（LINC00173）對多囊卵巢綜合征（PCOS）顆粒細胞（GCs）自噬的影響及其機制。方法 選取行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的PCOS患者（PCOS組）和因輸卵管因素行助孕治療的非PCOS患者（對照組）各40例，采用實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測LINC00173在PCOS GCs中的表達。另擇人卵巢顆粒細胞KGN為實驗對象，根據是否過表達LINC00173或敲低LINC00173將KGN細胞分為Vector組和pcLINC00173組，siNC組和siLINC00173組。單丹磺酰尸胺（MDC）染色檢測過表達LINC00173對KGN細胞自噬的影響，Western blot法檢測KGN細胞微管相關蛋白1輕鏈3B（LC3B）、p62及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路相關蛋白磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、PI3K、Akt及mTOR表達的影響。另設siNC組、siLINC00173組、siLINC00173+DMSO組和siLINC00173+LY294002組，檢測LY294002對LC3B和p62蛋白表達的影響。結果 PCOS組LINC00173表達水平高于對照組（P＜0.05）。LINC00173過表達后KGN細胞自噬體含量增加。與Vector組比較，pcLINC00173組自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達上調，p62表達下調，PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR表達下調。與siNC組比較，siLINC00173組上述蛋白表達變化相反。siLINC00173+LY294002組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平高于siLINC00173組和siLINC00173+DMSO組，p62蛋白表達水平低于siLINC00173組和siLINC00173+DMSO組（P＜0.05）。結論 LINC00173可誘導PCOS GCs自噬，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

關鍵詞：多囊卵巢綜合征；RNA，長鏈非編碼；自噬；LINC00173；顆粒細胞

中圖分類號：R711.75 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240511

The effect of LINC00173 regulating autophagy of PCOS granulosa cells based on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

ZHAO Yuanyuan， WU Xiaohua△

Center for Reproductive Medicine， the Fourth Hospital of Shijiazhuang （Gynecology and Obstetrics Hospital Affiliated to Hebei Medical University）; Key Laboratory of Maternal and Fetal Medicine of Hebei Province; Provincial Key Medical Discipline of Hebei Province; the Institute of Reproductive Health and Infertility， Shijiazhuang 050011， China

△Corresponding Author E-mail： wuxiaohua1965@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of long non-coding RNA 00173 （LINC00173） on autophagy of granulosa cells （GCs） in polycystic ovary syndrome （PCOS）. Methods A total of 40 PCOS patients and 40 patients （non-PCOS） treated with tubal factors who underwent in vitro fertilization-embryo transfer （IVF-ET） were selected. The expression levels of LINC00173 in GCs of PCOS were detected by qPCR. Human ovarian granulosa cells KGN were selected as the experimental subject. The cells were divided into the Vector group， the pcLINC00173 group， the siNC group and the siLINC00173 group based on their over-expression or interference with LINC00173. Dansylcadaverine （MDC） staining was employed to assess the impact of LINC00173 on autophagy of KGN cells. Western blot assay was conducted to investigate the effect of LINC00173 on autophagy and the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in KGN cells， focusing on expression levels of key pathway-related proteins including LC3B-Ⅱ/Ⅰ， p62， p-PI3K， p-Akt， p-mTOR， PI3K， Akt and mTOR. The effects of LY294002 on the expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰ and p62 proteins were detected in the siNC group， the siLINC00173 group， the siLINC00173+DMSO group and the siLINC00173+LY294002 group. Results LINC00173 was significantly upregulated in GCs of PCOS patients （P＜0.05）. The overexpression of LINC00173 in KGN cells resulted in the presence of autophagosomes and autophagolysosomes in cytoplasm （P＜0.05）. Compared with the vector group，" there was an increased expression of autophagy-related proteins LC3B-Ⅱ/Ⅰ and a decreased expression in p62 in the pcLINC00173 group （P＜0.05）. Additionally， there was a decreased expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR. Conversely， in the siLINC00173 group， the expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰ decreased while p62 expression increased compared to the siNC group （P＜0.05）， along with alterations in PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins. Compared to the siLINC00173+DMSO group or the siLINC00173 group，" PI3K/Akt/mTOR signaling pathway inhibitor LY294002 was found to alleviate the inhibitory effect of siLINC00173 on LC3B-Ⅱ/Ⅰ protein expression in KGN cells" in the siLINC00173 group （P＜0.05） and to reduce the impact of siLINC00173 on up-regulation of p62 protein expression （P＜0.05）. Conclusion Results reveal that LINC00173 can induce autophagy activation in PCOS GCs， and the mechanism of the action may be related to the inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Key words： polycystic ovary syndrome; RNA， long noncoding; autophagy; LINC00173; granulosa cells

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性常見的內分泌及代謝異常性疾病，其臨床特征主要表現為稀發排卵或無排卵、高雄激素血癥和卵巢多囊樣改變。其中，卵泡發育異常是PCOS患者的普遍特征，嚴重影響女性的生殖健康。顆粒細胞（granulosa cells，GCs）是卵泡中最大的細胞群及主要功能單位。卵泡發育成熟及排卵主要依賴于卵泡微環境中GCs功能的正常運行，其功能障礙可引起卵泡閉鎖，最終排卵受阻導致不孕［1］。有研究顯示，PCOS患者GCs自噬異常激活，細胞自噬蛋白Beclin1及微管相關蛋白1輕鏈3B-Ⅱ/Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ/Ⅰ，LC3BⅡ/Ⅰ）在GCs中表達升高，自噬底物蛋白（sequestosome-1/protein 62，SQSTM/p62）表達降低，干擾了卵泡的正常發育［2］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指長度超過200個核苷酸的RNA分子［3］，可通過影響卵巢GCs的功能參與調控人卵母細胞的成熟、受精和胚胎發育等生理過程［4-5］。本課題組前期研究通過生物信息數據庫分析發現非編碼RNA 00173（LINC00173）在PCOS GCs中異常高表達，但LINC00173對PCOS GCs自噬的影響及作用機制尚不清楚。本研究對此進行探討，旨在為PCOS的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 臨床組織樣本 選取2023年1月—12月于石家莊市第四醫院生殖醫學科行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transform，IVF-ET）助孕治療的PCOS患者40例為PCOS組，年齡22～35歲，平均（28.80±3.55）歲。納入標準：（1）年齡≤35歲。（2）PCOS診斷符合2003年鹿特丹專家共識。排除標準：（1）伴甲狀腺疾病、糖尿病等其他內分泌疾病。（2）女方染色體異常。（3）伴子宮內膜異位癥、卵巢良惡性腫瘤等其他婦科疾病。另擇同期因輸卵管因素而卵巢功能正常行IVF-ET助孕治療的非PCOS患者40例為對照組，年齡23～35歲，平均（30.08±2.97）歲。2組年齡差異無統計學意義（t=1.743，P＞0.05）。本研究根據世界醫學協會赫爾辛基宣言進行，經石家莊市第四醫院倫理委員會批準（倫理號：20220112），患者知情并簽署知情同意書。

1.1.2 細胞、試劑及藥物 人卵巢顆粒細胞KGN購自上海中喬新舟生物技術有限公司。DMEM/F-12培養基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、單丹磺酰尸胺（Dansylcadaverine，MDC）購自北京索萊寶生物科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；樣本密度分離液購自天津灝洋華科生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；PVDF膜購自美國密理博公司；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）和兔抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；LC3B、p62、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）兔抗人多克隆抗體和PI3K鼠抗人單克隆抗體購自中國成都正能生物科技有限公司；內參β-肌動蛋白（β-actin）鼠抗人單克隆抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG山羊抗兔/鼠抗體購自美國KPL公司，LY294002抑制劑購自美國MedChemExpress生物科技公司。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜（SW-CS-ⅠFD，蘇州凈化設備公司）；細胞培養箱（ROC-3000TVBB，美國REVCO公司）；實時熒光定量PCR儀（qTOWER3G，德國耶拿分析儀器股份公司）；蛋白電泳系統（Bio-Rad，美國伯樂公司）；化學發光成像系統（FUSIONFX7.EDGE，法國VILBER公司）；倒置顯微鏡（Nikon，日本尼康公司）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 GEO數據庫分析LINC00173在PCOS GCs中的表" 達 利用美國國家生物技術信息中心高通量基因表達（gene expression omnibus，GEO）數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載關于PCOS GCs的lncRNAs數據集（GSE95728），分析LINC00173在PCOS GCs中的表達。

1.2.2 人原代GCs提取 收集患者第1管卵泡液，提取卵泡液中的GCs。將收集的卵泡液置于50 mL無菌離心管中，" " " 2 000×g離心10 min，去除上清液后，將沉淀重懸于5 mL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中，緩慢加入等量的樣本密度分離液，1 500×g離心10 min；取中間白膜層，PBS清洗后，加入紅細胞裂解液室溫裂解2 min，隨后1 000×g離心5 min。將所得的沉淀加入TRIzol，暫存于-80 ℃冰箱，用于qPCR檢測LINC00173的表達。

1.2.3 KGN細胞培養、分組及轉染 將凍存的KGN細胞放置在37 ℃恒溫水浴鍋中復蘇，1 000×g室溫離心5 min，將所得的沉淀用DMEM/F-12細胞培養液（含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）重懸，置于10 cm2的細胞培養皿中，37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，24 h后更換為新鮮培養基，待細胞匯合至80%～90%時傳代處理。將對數生長期的KGN細胞以2×105個/孔接種于6孔板，按照Lipofectamine 2000TM轉染試劑盒說明書進行轉染。轉染分組：Vector組（轉染LINC00173的對照質粒pcDNA3.1）和pcLINC00173組（轉染LINC00173的過表達質粒pcDNA3.1-LINC00173），siNC組（轉染siRNA的陰性對照siNC）和siLINC00173組（轉染LINC00173的小干擾RNA siLINC00173），48 h后收集細胞，用于后續實驗。siNC和siLINC00173的核苷酸序列見表1。[基因名稱 核苷酸序列（5'→3'） siNC 上游：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 下游：ACGUGACACGUUCGGAGAATT siLINC00173 上游：GGAACGUUCAGCGGAAUAUTT 上游：AUAUUCCGCUGAACGUUCCTT ][Tab.1 The sequences for siRNAs

1.2.4 qPCR檢測LINC00173的過表達和干擾效果 將各組細胞培養48 h后，TRIzol法提取總RNA，按照Hieff? 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書操作：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min反轉錄為cDNA，隨后以cDNA為模板，Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）試劑盒進行PCR反應。反應體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR premix Ex Taq 10 μL，滅菌水7.4 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算LINC00173相對表達量，以β-actin為內參，引物序列見表2。[基因名稱 引物序列（5′→3′） 產物大小/bp LINC00173 上游：GCATCCAGCTACCCAGACTC 133 下游：CCTGCAGCACGCAATTAGAC β-actin 上游：CAGAGCAAGAGAGGCATCC 217 上游：CTGGGGTGTTGAAGGTCTC ][Tab.2 Primers for qRT-PCR

1.2.5 MDC染色檢測LINC00173對KGN細胞自噬的影響 取對數生長期的KGN細胞，以2×105個/孔接種于24孔板。在KGN細胞中轉染Vector 和pcLINC00173質粒，培養48 h后，棄掉24孔板中液體，每孔加入300 μL 1× wash buffer洗1次，棄上清液。然后每孔加入600 μL MDC工作液，室溫避光染色30 min，棄掉染色液，以300 μL 1×wash buffer清洗細胞。用含DAPI的封片劑封片，置于共聚焦顯微鏡下觀察細胞自噬體生成情況，激發濾光片波長355 nm，阻斷濾光片波長512 nm。

1.2.6 Western blot檢測LC3B和p62蛋白的表達 將轉染的Vector組、pcLINC00173組、siNC組和siLINC00173組細胞培養48 h后，使用預冷的PBS清洗細胞2～3次，每孔加入等量的RIPA裂解緩沖液裂解細胞，30 min后，12 000×g離心10 min，去除沉淀。采用Nanodrop 2000檢測蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE，然后轉移至0.22 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉孵育1 h，加入一抗LC3B（1∶1 000）、p62（1∶1 000）及內參β-actin（1∶10 000），4 ℃冰箱孵育過夜。TBST漂洗3次后，加入1∶5 000稀釋的山羊抗兔/鼠二抗，室溫孵育1 h，采用增強型化學發光檢測蛋白條帶，重復3次。Image J軟件進行定量分析。

1.2.7 Western blot檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達 方法及分組同1.2.6，所用一抗分別為p-PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000），二抗為山羊抗兔/鼠IgG（1∶5 000）。

1.2.8 Western blot檢測LY294002對LC3B和p62的蛋白表達的影響 實驗設siNC組和siLINC00173組，siLINC00173+DMSO組和siLINC00173+LY294002組（LY294002濃度為" " 10 μmol/L）。檢測方法同1.2.6。

1.3 統計學方法 數據采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。所有數據采用Shapiro-Wilk（S-W）方法進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料以[[x] ±s]表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCOS GCs中LINC00173的表達情況 GSE95728臨床樣本數據分析結果顯示，LINC00173在PCOS GCs中高表達（4.43±0.26 vs. 2.95±0.68），差異有統計學意義（n=7，t=5.391，P＜0.05），見圖1。qPCR結果顯示，PCOS組LINC00173表達水平2.17（0.91，7.78）高于對照組0.84（0.47，2.66），差異有統計學意義（n=40，Z=2.935，P＜0.05）。

2.2 LINC00173在KGN細胞中的過表達及干擾效果 與Vector組相比，pcLINC00173組細胞中LINC00173相對表達水平升高（P＜0.05）；與siNC組相比，siLINC00173組細胞中LINC00173相對表達水平降低（P＜0.01）。見圖2。

2.3 LINC00173過表達對KGN細胞自噬水平的影響 MDC染色結果顯示，pcLINC00173組細胞內綠色點狀熒光強度（4.67±0.88）較Vector組（1.00±0.35）增強（n=3，t=6.691，P＜0.05），見圖3。

2.4 各組KGN細胞自噬相關蛋白LC3B及p62蛋白的表達變化 與Vector組相比，pcLINC00173組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與siNC組相比，siLINC00173組細胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平降低，p62蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖4、表3。

2.5 PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達變" 化 與Vector組相比，pcLINC00173組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與siNC組相比，siLINC00173組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達水平升高（P＜0.05），見表4、圖5。[組別 p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt p-mTOR/mTOR Vector組 0.69±0.06 0.77±0.10 1.63±0.19 pcLINC00173組 0.30±0.01 0.11±0.01 0.85±0.08 t 11.105＊ 11.375＊ 6.553＊ siNC組 0.46±0.16 1.47±0.16 0.15±0.04 siLINC00173組 1.43±0.08 2.73±0.14 0.82±0.03 t 9.392＊ 10.265＊ 23.210＊ ][Tab.4 Comparison of relative expression levels of PI3K/Akt/mTOR signaling in KGN cells between the four groups

2.6 LY294002對LC3B和p62蛋白表達的影響 與siNC組相比，siLINC00173組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平降低，p62蛋白表達水平升高（P＜0.05）；siLINC00173+LY294002組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平高于siLINC00173組和siLINC00173+DMSO組，p62蛋白表達水平低于siLINC00173組和siLINC00173+DMSO組（P＜0.05），見圖6、表5。

3 討論

PCOS是引起育齡期女性排卵障礙性不孕的重要原因［6］。研究發現，GCs功能障礙可能是PCOS患者出現卵泡發育異常、降低育齡期女性生育能力的重要因素［7］。GCs有凋亡和自噬雙重功能，筆者前期研究已證實PCOS患者GCs凋亡水平明顯高于健康對照組［8-9］。而自噬是真核細胞在自噬相關蛋白的調控下，通過形成自噬體經溶酶體途徑降解胞內有害成分或受損細胞器的過程，從而維持細胞、組織和生物體的穩態［10］。正常情況下，GCs通過自噬穩態維持卵巢功能，進而調控卵泡發育［10-11］。研究表明，在卵泡閉鎖過程中，自噬體積累到一定程度可誘導GCs凋亡，PCOS患者GCs自噬異常活躍，自噬蛋白Beclin1表達水平升高，且Beclin1與血清睪酮T、抗苗勒氏管激素（AMH）呈正相關，提示GCs自噬異常活躍可能與PCOS患者雄激素水平升高、卵泡發育異常密切相關［2］。

近年來，lncRNA在PCOS中的作用逐漸受到關注。本研究結果顯示，PCOS患者GCs中LINC00173異常高表達。有研究表明，LINC00173可通過miR-124-3p/JAG1通路促進卵巢GCs凋亡，進而調控PCOS的進展［12］。然而，LINC00173是否影響PCOS GCs自噬鮮見報道。本研究結果顯示，LINC00173高表達后自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達水平升高，自噬底物p62表達水平降低；干擾LINC00173表達后，得到相反的結果。MDC染色結果顯示，LINC00173高表達后，KGN細胞自噬體數量明顯增加。以上結果提示LINC00173可誘導GCs發生自噬，促進PCOS進展，但具體機制尚待探究。

有研究顯示，PI3K/Akt/mTOR信號通路可通過調控GCs的增殖、分化及凋亡過程參與調節卵泡生長、發育及成熟，對維持卵泡內環境的穩態至關重要［13］。另有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路亦參與調控卵巢GCs和卵母細胞的自噬過程，是自噬的負向調控通路，該通路以磷酸化形式激活時，自噬受到抑制［14］。本研究結果顯示，LINC00173過表達可抑制KGN細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的表達；反之，干擾LINC00173的表達后，PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活。在干擾LINC00173的KGN細胞中加入PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑LY294002后，與單獨干擾LINC00173或加溶劑組比較，解除了siLINC00173對KGN細胞自噬的抑制作用。提示LINC00173通過誘導GCs自噬抑制PCOS卵泡GCs發育，其作用機制可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

綜上所述，LINC00173可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路促進PCOS GCs自噬，參與PCOS的發生及發展，進而影響卵巢功能和內環境穩態的建立。然而，LINC00173調控PI3K/Akt/mTOR信號通路的具體機制尚待進一步探究。

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（2024-04-28收稿 2024-06-21修回）

（本文編輯 陳麗潔）