羅沙司他通過抑制凋亡和炎癥反應改善小鼠心肌缺血再灌注損傷

摘要：目的 探討羅沙司他對小鼠心肌缺血-再灌注（I/R）損傷的改善作用及相關機制。方法 24只雄性C57BL/6N小鼠隨機分為假手術組、對照組和羅沙司他組，每組8只。對照組灌胃含5%二甲基亞砜的生理鹽水100 μL，羅沙司他組灌胃25 mg/kg羅沙司他100 μL，將2組小鼠左冠狀動脈前降支結扎40 min，再灌注24 h，建立小鼠心肌I/R模型；假手術組僅對冠狀動脈左前穿針，不結扎。氯化三苯基四氮唑（TTC）染色檢測小鼠心肌梗死面積，原位末端標記法（TUNEL）染色檢測小鼠心肌細胞的凋亡情況，免疫組化染色檢測凋亡相關蛋白bcl-2相關X蛋白質（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase3）表達及炎性細胞標志物F4/80、髓過氧化物酶（MPO）浸潤情況，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠心肌細胞損傷情況。結果 羅沙司他組小鼠心肌梗死面積小于假手術組和對照組（P＜0.05）。對照組和羅沙司他組細胞凋亡數量多于假手術組，羅沙司他組細胞凋亡數量少于對照組（P＜0.05）。對照組和羅沙司他組心肌組織中Bax、Caspase3蛋白表達水平高于假手術組，羅沙司他組低于對照組（P＜0.05）。羅沙司他組心肌組織中F4/80和MPO蛋白表達水平低于對照組（P＜0.05）。對照組小鼠心肌組織排列紊亂、組織間隙空泡增多；與對照組相比，羅沙司他組心肌細胞排列較整齊，組織間隙空泡減少。結論 羅沙司他可縮小I/R損傷后心肌梗死面積，抑制心肌細胞凋亡，減輕心肌損傷，減少心肌巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，降低炎癥損傷。

關鍵詞：心肌再灌注損傷；細胞凋亡；炎癥；羅沙司他

中圖分類號：R541 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240445

Roxadustat improves myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by inhibiting

apoptosis and inflammatory response

CAI Dengta1， CHANG Jingyi2， JIA Shanshan2， TU Yinqiong3△

1 Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Henan University， Zhengzhou 450052， China; 2 Henan University Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering; 3 Laboratory of Medical Biology，

School of Basic Medical Science， Henan University

△Corresponding Author E-mail： 30070060@vip.henu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the improvement effect and related mechanism of roxadustat on myocardial ischemia-reperfusion （I/R） injury in mice. Methods Twenty four male C57BL/6N mice were randomly divided into the sham operation group， the control group and the roxadustat group， with eight mice in each group. A mouse myocardial I/R model was established. The control group was given 100 μL saline injection containing 5% dimethyl sulfoxide by gavage. The roxadustat group was given 25 mg/kg roxadustat by gavage. The left anterior descending coronary artery of mice in both groups was ligated for 40 minutes， and then reperfusion for 24 hours to establish the myocardial I/R model. In the sham operation group， only the left anterior coronary artery was pierced without ligation. The area of myocardial infarction in mice was detected by triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining. The apoptosis of mouse cardiomyocytes was detected by TdT-mediated dUTP nick and labeling （TUNEL） staining. The expression of apoptosis-related proteins bcl-2 associated X protein （Bax）， Caspase3 and inflammatory cell markers F4/80 and myeloperoxidase （MPO） were detected by immunohistochemistry staining. The damage of myocardial cells was observed by hematoxylin-eosin （HE） staining. Results The area of myocardial infarction after myocardial I/R was reduced in the roxadustat group compared to the control group and the sham operation group （P＜0.05）. The number of apoptotic cells was higher in the control group and the roxadustat group than that in the sham operation group， and the number of apoptotic cells was lower in the roxadustat group than that in the control group （P＜0.05）. The expression levels of Bax and Caspase3 proteins in myocardial tissue were higher in the control group and the roxadustat group than those in the sham operation group， while those of the roxadustat group was lower than those of the control group （P＜0.05）. The expression levels of F4/80 and MPO proteins in myocardial tissue were lower in the roxadustat group than those in the control group （P＜0.05）. In the control group， the myocardial tissue arrangement was disordered， and there was an increase in interstitial vacuoles. Compared with the control group， the myocardial cells were arranged more neatly in the roxadustat group， and the interstitial vacuoles were reduced. Conclusion Roxadustat can reduce the myocardial infarction area after I/R injury， inhibit myocardial cell apoptosis， alleviate myocardial injury， reduce infiltration of myocardial macrophages and neutrophils， and reduce inflammatory injury.

Key words： myocardial reperfusion injury; apoptosis; inflammation; Roxadustat

目前，心血管疾病的死亡率居全球范圍內疾病的首位［1］，而急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是心血管疾病致死的主要原因，且發(fā)病率和死亡率逐年升高［2］。臨床上通過溶栓、經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）和冠狀動脈旁路移植術等技術改善AMI缺血區(qū)的血流供應［3-4］，但重建血流會造成進一步的組織損傷，稱為缺血-再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷［5］。I/R損傷會對組織造成不可逆的損傷，嚴重時可能導致細胞凋亡、自噬、壞死和壞死性凋亡［6］，因此改善心肌I/R損傷中再灌注階段對心肌細胞的損傷已成為目前亟待解決的問題。羅沙司他是一種口服低氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIF）脯氨酰羥化酶抑制劑［7］，是我國新一代腎性貧血治療藥物，已在腎性疾病的臨床治療中取得巨大進展，多用于治療透析患者因慢性腎臟病引起的貧血［8-9］。有研究表明，羅沙司他可通過上調HIF-1α和低氧反應基因DNA損傷誘導轉錄因子4（DDIT4）和NADH氧化還原酶輔酶4樣蛋白2（NDUFA4L2）的表達，減輕小鼠心肌I/R損傷［10］。但羅沙司他緩解心肌I/R損傷的作用靶點及參與通路復雜且尚未明確。因此，本研究旨在探究羅沙司他對心肌I/R損傷小鼠心肌細胞凋亡和炎癥的作用及相關機制，為治療心肌缺血性損傷提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物及分組 選取24只SPF級6～8周齡雄性C57BL/6N小鼠，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2021-0011。小鼠飼養(yǎng)于河南大學動物房，動物使用許可證號：SYXK（豫）2016-0006，溫度16～20 ℃，濕度50%～60%，12 h/12 h光/暗環(huán)境，喂養(yǎng)5 d后開始實驗。采用隨機數字表法將小鼠分為假手術組、對照組和羅沙司他組，每組8只。本研究經河南大學醫(yī)學院醫(yī)學與科研倫理委員會批準（批準號：DWLL20220102）。

1.1.2 主要試劑和儀器 羅沙司他購自中國阿斯利康公司，二甲基亞砜（DMSO）、生理鹽水購自Sigma-Aldrich公司；Evans Blue/氯化三苯基四氮唑（TTC）染色劑購自美國Sigma公司，原位末端標記法（TUNEL）檢測試劑盒購自南京諾唯贊公司，DAB顯色試劑盒、即用型SABC-POD（F）試劑盒（兔IgG）購自武漢博士德生物工程有限公司，蘇木精-伊紅（HE）染色液購自上海源葉生物科技有限公司，兔抗小鼠單克隆抗體bcl-2相關X蛋白質（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase3）抗體、F4/80抗體、髓過氧化物酶（MPO）抗體購自ABclonal公司。IX53型光學顯微鏡（Olympus公司），NIKON A1R HD25型激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司），LEICA MUTLCUT型半自動旋轉式切片機（Leica公司），MSS-3型小動物麻醉機（上海任誼生物科技有限公司），照相機（Ganon EFS）。

1.2 方法

1.2.1 心肌I/R模型建立 小鼠提前禁食禁水1～2 h。實驗開始前2 h，對照組灌胃含體積分數5%DMSO的生理鹽水100 μL，羅沙司他組灌胃25 mg/kg羅沙司他100 μL，假手術組不注射任何藥物。全部小鼠用2%異氟烷氣體持續(xù)麻醉后以自然仰臥位將其固定于手術臺并用75%乙醇進行手術區(qū)域消毒，然后用剪刀在小鼠腋窩與胸骨下端第3、4肋間隙位置剪開皮膚，切口為1.5 cm左右；分離胸大肌與肋骨外肌肉，暴露肋間隙，將心臟擠出胸腔，剝離心包膜，暴露心臟，在心耳下方用5-0線對冠狀動脈左前降支結扎，注意不要刺破心臟。然后用鑷子迅速將心臟送回胸腔，擠出空氣，用3-0線快速縫合關胸；隨后將小鼠四肢放開，觀察呼吸狀態(tài)；待缺血40 min后松開結扎線，縫合皮膚，等小鼠蘇醒后觀察其狀態(tài)并將小鼠放回獨立通氣籠中常規(guī)飼養(yǎng)；24 h后，將小鼠再次麻醉固定在手術臺上，按照后續(xù)實驗需求處理小鼠。假手術組僅對冠狀動脈左前降支穿針，不結扎。

1.2.2 Evans Blue-TTC染色觀察小鼠心肌梗死面積 將1.2.1麻醉的小鼠（每組4只），開胸暴露心臟，夾住主動脈且結扎心臟的冠狀動脈左前降支，同時注射1% Evans Blue，剪下心臟用濾紙吸去多余的Evans Blue，迅速放到干冰上冷凍；然后平行房室溝將左室進行切片，每片厚為1.5～2.0 mm，切成5片；將切好的心臟片置于1%TTC染液中避光浸染10 min，37 ℃孵育，取出后將心臟切片按照順序擺放，拍照記錄。白色為心肌梗死區(qū)，紅色為心肌非梗死區(qū)，利用Image J 2.0軟件統(tǒng)計各組小鼠心肌梗死面積=梗死面積/（梗死面積+非梗死面積）×100%。

1.2.3 TUNEL染色觀察細胞凋亡情況 將1.2.1麻醉的小鼠（每組4只）從主動脈注射PBS沖洗心臟，剪下心臟，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚切片后備用。采用TUNEL染色試劑盒觀察小鼠心肌細胞凋亡情況，在激光共聚焦顯微鏡下統(tǒng)計小鼠陽性細胞數。結果判定：正常染色細胞核通常呈藍色，凋亡的細胞核呈紅色。利用Image J 2.0軟件統(tǒng)計各組小鼠心肌細胞凋亡數=（TUNEL陽性細胞數/細胞總數）×100%。

1.2.4 免疫組化染色檢測心肌組織中Bax、Caspase3、F4/80、MPO蛋白表達 取1.2.3中的組織切片，在二甲苯中脫蠟10 min并在分級乙醇系列中水化5 min，PBS沖洗3次，每次5 min。用3%H2O2室溫避光反應20 min去除內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，置于pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中修復15 min，PBS洗滌后5%BSA封閉30 min。滴加一抗Bax（1∶200）、Caspase3（1∶100）、F4/80（1∶100）、MPO（1∶200），4 ℃孵育過夜。次日PBS沖洗3次，使用即用型SABC-POD（F）試劑盒中的生物素標記的山羊抗兔IgG室溫孵育50 min。PBS沖洗3次，SABC 37 ℃孵育30 min。DAB顯色1 min，流水沖洗3 min，蘇木素復染，分級乙醇中脫水5 min，二甲苯中透明1 min，中性樹脂封片。于Olympus IX 53光學顯微鏡下獲得圖像并以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，隨機計數3個放大鏡視野（×200）下陽性細胞比例，用Image J 2.0軟件進行定量。

1.2.5 HE染色檢測心肌組織損傷情況 取1.2.3中的心臟組織切片，在二甲苯中脫蠟并在分級乙醇系列中復水，根據HE染色說明書進行組織切片染色，于Olympus IX 53光學顯微鏡下獲得圖像。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（[[x] ±s]）表示，2組之間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 羅沙司他對小鼠心肌I/R后心肌梗死面積的影響 Evans Blue-TTC染色結果顯示，對照組小鼠心肌梗死面積（70.33%±12.09%）與假手術組（66.63%±15.84%）差異無統(tǒng)計學意義，羅沙司他組小鼠心肌梗死面積（38.36%±7.87%）小于假手術組和對照組（F=14.750，n=4，P＜0.05），見圖1。

2.2 羅沙司他對小鼠心肌I/R后心肌細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示，假手術組、對照組和羅沙司他組細胞凋亡數量分別為（1.75±0.96）（83.40±6.27）和（37.00±2.16） mm2，3組差異有統(tǒng)計學意義（F=434.000，n=4，P＜0.05），其中對照組和羅沙司他組細胞凋亡數量多于假手術組，羅沙司他組細胞凋亡數量少于對照組（P＜0.05），見圖2。

2.3 羅沙司他對小鼠心肌I/R后心肌凋亡蛋白表達的影響 免疫組化染色結果顯示，與假手術組相比，對照組和羅沙司他組心肌組織中Bax、Caspase3蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與對照組相比，羅沙司他組心肌組織中Bax、Caspase3蛋白表達水平降低（P＜0.05），見表1、圖3。

2.4 羅沙司他對小鼠心肌I/R后心肌組織損傷的影響 HE染色結果顯示，與假手術組相比，對照組小鼠心肌組織排列更加紊亂、組織間隙空泡增多；與對照組相比，羅沙司他組心肌組織病理變化得到改善，心肌細胞排列較整齊，組織間隙空泡減少。免疫組化染色結果顯示，與假手術組相比，對照組心肌組織中巨噬細胞浸潤標志物F4/80和中性粒細胞浸潤標志物MPO蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與對照組相比，羅沙司他組心肌組織中F4/80和MPO蛋白表達水平降低（P＜0.05），見表2、圖4。

3 討論

AMI是指心肌血流急性中斷導致的缺血性心肌壞死，其發(fā)病機制基于破裂的動脈粥樣硬化斑塊上形成急性血栓［4］，目前的臨床治療方案（如溶栓、搭橋和PCI等）可能導致患者發(fā)生心肌I/R損傷［11］。心肌I/R損傷的發(fā)生涉及鈣超載、氧化應激、內皮功能障礙、鐵死亡、線粒體功能障礙、心肌細胞凋亡和自噬以及炎癥反應等一系列病理生理機制［12］。因此，亟需開發(fā)針對這些病理生理機制的新型治療方案。

機體在發(fā)生I/R損傷時處于低氧狀態(tài)，這不僅引發(fā)線粒體功能障礙，而且促使大量活性氧（ROS）的生成，兩者共同加劇氧化應激和細胞凋亡。HIF-1α是調控腫瘤微環(huán)境的關鍵因子，在缺血缺氧情況下不能被泛素化相關蛋白識別并降解，從而被轉運至細胞核內，導致其表達受到直接影響［13］。同時，研究發(fā)現HIF-1α可保護低氧微環(huán)境中的心肌細胞免于凋亡［14］。當機體處于缺氧狀態(tài)時，羅沙司他可通過刺激內源性促紅細胞生成素（EPO）的合成增加內源性紅細胞生長素，改善鐵調節(jié)和增高轉鐵蛋白受體活性，促進紅細胞的生成，從而改善機體內的氧合狀態(tài)，減輕炎癥反應，有助于逆轉心肌損傷［15-16］。此外，羅沙司他可抑制細胞內HIF-1α被降解。多項研究證實，該藥預處理可上調HIF-1α表達，進一步激活下游相關信號通路，從而發(fā)揮心肌保護作用［17-18］。本研究結果顯示，羅沙司他組小鼠心肌I/R損傷后心肌梗死面積較假手術組和對照組顯著減小；TUNEL染色結果顯示，羅沙司他組凋亡細胞數量較對照組明顯減少，與既往研究［10，19］結果一致。推測羅沙司他可能通過上調HIF-1α表達減少氧化應激對心肌細胞的損害，抑制心肌細胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護作用。

心肌細胞凋亡是心肌I/R損傷的主要病理機制。氧化應激反應在細胞凋亡進程中發(fā)揮關鍵作用，當I/R損傷發(fā)生時，過量的ROS累積會導致線粒體損傷，進而直接誘導細胞凋亡［20-21］。有研究發(fā)現，在缺氧缺血狀態(tài)下，ROS的大量生成可激發(fā)氧化應激反應，激活PI3K/Akt信號通路，從而調控促凋亡蛋白Bax及凋亡執(zhí)行因子Caspase3的表達［22］。Bax和Caspase3表達上調標志著細胞凋亡的加速，加劇了組織和細胞的損傷［23］。本研究結果顯示，與假手術組相比，對照組和羅沙司他組心肌組織中Bax、Caspase3蛋白表達水平升高；與對照組相比，羅沙司他組心肌組織中Bax、Caspase3蛋白表達水平降低，提示羅沙司他可通過下調Bax、Caspase3蛋白的表達緩解受損心肌細胞的氧化應激狀態(tài)，從而減輕心肌細胞的凋亡。

中性粒細胞和巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的核心組成部分，在機體抵御病原體和修復損傷過程中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，中性粒細胞和巨噬細胞參與I/R損傷的發(fā)生，其數量增多表明機體炎癥反應加劇［24］。本研究結果顯示，與假手術組相比，對照組心肌組織中巨噬細胞浸潤標志物F4/80和中性粒細胞浸潤標志物MPO蛋白表達水平升高；與對照組相比，羅沙司他組心肌組織中F4/80和MPO蛋白表達水平降低，提示羅沙司他能夠有效抑制心肌組織中巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤，從而減輕炎癥反應造成的損傷。

綜上所述，羅沙司他可縮小小鼠I/R損傷后心肌梗死面積，抑制心肌細胞凋亡，減輕心肌損傷，減少心肌巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤，降低炎癥損傷。本研究也為羅沙司他更廣泛地應用于臨床提供了實驗基礎。

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（2024-04-29收稿 2024-07-19修回）

（本文編輯 陳麗潔）