廣西百色地區1例乙肝肝硬化患者血液非O1/非O139群霍亂弧菌感染的鑒定

【摘要】 目的 對一株從乙肝肝硬化患者血液中分離的病原菌進行鑒定。

方法 采用標準的霍亂弧菌鑒定方法對該病原菌的培養特性、形態學特征、生化鑒定、蛋白質譜分析、血清學鑒定及熒光PCR進行分析。

結果 根據乙肝肝硬化患者血液中分離的菌株培養特性、形態學特征、生化鑒定、蛋白質譜分析（在4279m/z、4367m/z、5123m/z、6165m/z、6277m/z、6453m/z和7160m/z采集到特征性質譜峰）、血清學鑒定及熒光PCR（霍亂弧菌O1群和O139群基因均為陰性）鑒定為非O1/非O139群霍亂弧菌。

結論 廣西百色地區首次在乙肝肝硬化患者血液中分離出非O1/非O139群霍亂弧菌。

【關鍵詞】 非O1/非O139；霍亂弧菌；乙型肝炎；肝硬化；血流感染

中圖分類號：R372 ""文獻標志碼：A ""DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.10.010

Identification of non O1/non O139 vibrio cholerae infection in the blood of

the first patient with hepatitis B cirrhosis in Baise， Guangxi

LIU Chunhong1a， 2， YI Xueli1a， LU Yulan1b， PANG Xiaoxia1a， LU Zhenrong1a，

JING Yuxin1a， YANG Shulin1a， WANG Chunfang1a， 2▲

（1a. Center for Medical Laboratory Science， 1b. Center for Reproductive Medicine， 1. Affiliated Hospital of Youjiang

Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 2. Key Laboratory of Research on Clinical

Molecular Diagnosis for High Incidence Diseases in Western Guangxi， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To identify a pathogen isolated from the blood of a patient with hepatitis B cirrhosis.

Methods Standard methods for identifying vibrio cholerae were used to analyze the culture characteristics， morphological characteristics， biochemical identification， protein mass spectrometry analysis， serological identification， and fluorescence PCR of the pathogen.

Results According to the culture characteristics， morphological characteristics， biochemical identification， protein mass spectrometry analysis （characteristic spectrum peaks were collected at 4279 m/z， 4367 m/z， 5123 m/z， 6165 m/z， 6277 m/z， 6453 m/z and 7160 m/z）， serological identification and fluorescent PCR （vibrio cholerae O1 and O139 genes were negative） of strains isolated from the blood of the patient with hepatitis B cirrhosis， they were identified as non O1/non O139 vibrio cholerae.

Conclusion Vibrio cholerae non O1/non O139 is isolated from the blood of patients with hepatitis B cirrhosis in Baise， Guangxi for the first time.

【Keywords】 non O1/non O139; vibrio cholerae; hepatitis B; cirrhosis; bloodstream infection

霍亂弧菌（vibrio cholerae， VIC）是一種兼性厭氧革蘭氏陰性桿菌，是導致急性霍亂性腹瀉的病原體，主要毒力因子是霍亂毒素，其中O1群和O139群霍亂弧菌是導致世界大流行的主要血清群［1］。非O1/非O139群霍亂弧菌是指除血清型為O1和O139群以外的其他霍亂弧菌［2］。非O1/非O139群霍亂弧菌是一群與O1/O139群霍亂弧菌生化相似，但菌體抗原不同的細菌，其廣泛存在于環境中，可從淡水、海水以及海產品中分離出來，一般為散發病例，可引起人類中重度腹瀉、食物性胃腸炎以及腸道外感染［3］。細菌感染是肝硬化患者死亡最常見的原因之一，其主要見于自發性腹膜炎、肺部感染、血液感染、皮膚感染以及尿路感染等，以埃希菌屬、克雷伯菌屬和弧菌屬等革蘭氏陰性細菌引起為主。目前國內外關于從血液中分離出非O1/非O139群霍亂弧菌的報道相對較少。2023年8月我院從1例乙肝肝硬化患者血液中分離出1株與O1/O139群霍亂弧菌診斷血清不凝集的霍亂弧菌疑似菌株，對其進行表型特征及生物學鑒定，現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 病例來源

患者，男，58歲，有乙型肝炎病史10余年，未經抗乙型肝炎病毒治療，因反復腹痛腹脹1年余，于2023年8月24日非急診收入我院。查體：體溫36.5 ℃，脈搏110次/min，呼吸20次/min，血壓133/81 mmHg，鞏膜黃染，顏面部無水腫，前胸壁未見蜘蛛痣，淺表淋巴結未觸及腫大，肺部檢查未見異常；心界不大，心率110次/min，律齊，各瓣膜區無異常雜音；腹部膨隆，未見腹壁靜脈曲張，腹稍軟，右腹部輕壓痛，無反跳痛，膽囊點無壓痛，未觸及異常包塊，肝脾肋下未觸及，肝區、腎區無叩擊痛，移動性濁音陽性，腸鳴音正常，4次/min，雙下肢水腫。神經系統查體未見明顯異常。實驗室檢查：血常規、肝功能、腎功能、電解質和凝血功能檢查結果見表1；乙肝五項檢查和HBV-DNA定量檢查結果見表2。影像學檢查：彩色超聲顯示腹腔內見最大直徑約111 mm液性暗區，如圖1A所示；CT檢查顯示肝臟輪廓不光整，體積縮小，各葉比例失調，如圖1B所示。胃鏡檢查結果如圖2所示，食管：距門齒31 cm起至賁門，食管四壁見靜脈曲張，共3條，稍隆起于黏膜表面，呈直線或串珠狀，直徑2～4 mm，藍白色，無紅色征，見一白色疤痕樣改變，未見活動性出血。胃底：黏膜彌漫充血，伴斑片狀糜爛。胃體：皺襞增粗水腫，呈“馬賽克”樣改變，大彎側黏膜條狀片狀糜爛。胃角：弧形，黏膜水腫。胃竇：蠕動好，黏膜水腫，皺襞頂端充血、糜爛。十二指腸球部及降段黏膜未見異常。

1.1.2 主要實驗試劑

微生物培養基為鄭州安圖生物工程股份有限公司的血瓊脂平板、廣州迪景微生物科技有限公司的玫紅酸中國藍乳糖平板和嗜血桿菌巧克力瓊脂選擇培養基以及法國梅里埃的需氧和兼性厭氧血培養瓶；革蘭氏染色液購于珠海貝索生物技術有限公司；革蘭氏陰性細菌鑒定卡和蛋白質譜樣品處理基質溶液（MS-CHCA）購于法國梅里埃公司；O1/O139群霍亂弧菌診斷血清購于寧波天潤生物藥業有限公司；霍亂弧菌（O139、O1、CTXAB、通用型）四重核酸檢測試劑盒購于深圳生科原生物有限公司。

1.1.3 主要儀器

BacT/ALERT 3D全自動血培養儀；梅里埃VITEK 2 COMPACT生化鑒定儀；梅里埃VITEK MS全自動微生物質譜檢測儀；ABI 7500實時熒光定量PCR儀。

1.1.4 標準質控菌株

標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎鏈球菌ATCC 49619由國家衛生部臨檢中心提供，用于細菌鑒定和藥敏質控。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養

用藥前，采集患者靜脈血2 mL，注入需氧和兼性厭氧血培養瓶中，混勻，全自動血培養儀BacT/ALERT 3D培養。血培養儀陽性報警后，取出陽性血培養瓶，取血直接涂片；同時轉種血瓊脂平板、玫紅酸中國藍乳糖平板和嗜血桿菌巧克力瓊脂選擇培養基，置于5%～10% CO2，35 ℃恒溫培養48 h。

1.2.2 顯微鏡檢查

取陽性血培養物直接涂片，分別采用懸滴法和革蘭氏染色法鏡檢，觀察細菌形態和動力特征。

1.2.3 生化鑒定及藥敏試驗

采用梅里埃微生物分析儀系統VITEK 2 COMPACT對病原微生物進行鑒定。制備3.0 mL 0.5麥氏單位的菌懸液用于革蘭氏陰性桿菌鑒定和革蘭氏陽性菌鑒定；吸取145 μL 0.5麥氏單位的菌懸液于3 mL生理鹽水中，混勻，用于革蘭氏陰性桿菌藥敏試驗；吸取280 μL 0.5麥氏單位的菌懸液于3 mL生理鹽水中，混勻，用于革蘭氏陽性球菌藥敏試驗。

1.2.4 質譜鑒定

采用梅里埃微生物質譜檢測系統VITEK MS對病原微生物進行鑒定。分別取純菌或單個菌落的目標菌及質控菌涂于靶板上，加1 μL VITEK MS-CHCA基質液，質譜儀鑒定。

1.2.5 診斷血清分型鑒定

取1～2滴診斷血清滴于潔凈玻片上，少許待檢菌與診斷血清混勻，輕輕搖動玻片，3分鐘內肉眼判讀結果，同時以生理鹽水作為陰性對照。

1.2.6 熒光PCR鑒定

采用霍亂弧菌（O139、O1、CTXAB、通用型）四重核酸檢測試劑盒中的DNA提取液提取待檢菌的DNA；PCR反應體系液（20 μL），由O139/O1/CTXAB/通用型PCR反應液（19.5 μL）和混合酶液（0.5 μL）組成，按照20 μL/管分裝量分裝至八連管PCR反應管中；分別吸取5 μL樣本模板、陽性質控和陰性質控于PCR反應管中；ABI 7500熒光定量PCR，熒光PCR參數（UNG處理：50 ℃ 2 min 循環1次；預變性：95 ℃ 3 min；PCR：95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，循環40次）。

2 結" 果

2.1 細菌分離培養及形態特征

患者血液培養24 h后報有菌生長，將陽性血培養物制成懸滴，顯微鏡暗視野下觀察呈快速飛鏢樣或流星樣運動細菌，如圖3A、3B所示；陽性培養物直接涂片，結果為革蘭氏陰性桿菌，呈弧形或逗點狀，無芽孢，如圖3C所示。轉種到血瓊脂平板、玫紅酸中國藍平板和嗜血桿菌巧克力瓊脂選擇培養基上生長良好，菌落特點為中等大小、圓形、邊緣整齊、扁平、光滑濕潤；血瓊脂平板上有β溶血環的菌落，玫紅酸中國藍平板上為玫瑰紅色背景的菌落，嗜血桿菌巧克力瓊脂平板上為邊緣灰黑色的菌落，血瓊脂平板、玫紅酸中國藍平板和嗜血桿菌巧克力瓊脂選擇培養基上24 h、48 h和72 h如圖4所示。

2.2 生化鑒定結果

分離培養的菌株氧化酶試驗陽性，采用梅里埃微生物分析儀系統VITEK 2 COMPACT對分離培養菌株進行鑒定，鑒定結果為霍亂弧菌。陽性反應的生化項目有：蔗糖、乳酸鹽產堿、D-麥芽、鳥氨酸脫羧酶、D-甘露醇、D-海藻糖、琥珀酸鹽產堿、賴氨酸脫羧酶、尿素酶、COURMARATE、葡萄糖發酵、D-葡萄糖、酪氨酸芳胺酶、檸檬酸鹽（鈉）、ELLMAN、β-N-乙酰葡萄糖苷酶，生化鑒定結果如表3所示。

2.3 質譜鑒定結果

梅里埃微生物質譜檢測系統VITEK MS分析，分離培養菌株在4279 m/z、4367 m/z、5123 m/z、6165 m/z、6277 m/z、6453 m/z和7160 m/z采集到特征性質譜峰，如圖5所示，鑒定結果提示為霍亂弧菌，與生化鑒定相吻合。

2.4 診斷血清分型鑒定結果

分離培養菌株分別與O1群多價血清、O1群分型血清和O139群單價血清反應均未見凝集，為非O1/非O139群霍亂弧菌。

2.5 熒光PCR結果

PCR結果顯示，分離培養菌株O1群和O139群基因分型結果均為陰性，與診斷血清分型鑒定結果一致，提示該分離菌株為非O1/非O139群霍亂弧菌。

2.6 藥敏試驗結果

梅里埃微生物分析儀系統VITEK 2 COMPACT對分離培養菌株進行藥敏試驗，結果顯示該分離菌株對阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、阿米卡星、左氧氟沙星、替加環素、復方新諾明、美羅培南、環丙沙星均為敏感，結果見表4。

3 討" 論

霍亂是由O1或O139血清群霍亂弧菌感染引起的急性分泌性腹瀉，其最早出現在孟加拉灣周圍地區，自1817年以來，已有七次霍亂疫情從亞洲蔓延到世界大部分地區［4］。第七次大流行始于1961年，每年影響300萬～500萬人，造成12萬人死亡［5］。霍亂的主要臨床表現為無痛性劇烈腹瀉、嘔吐或高熱，導致機體脫水，甚至出現休克。合理的病例管理方案是及時通過口服和靜脈補液治療，現已將霍亂的病死率從50%以上降至低于1%的水平。盡管水質、環境衛生和個人衛生以及霍亂的臨床治療有所改善，但據統計，該病每年仍會導致約10萬人死亡。因此，針對霍亂弧菌的監控，控制傳染源仍是該疾病所面臨的巨大衛生挑戰。霍亂弧菌為革蘭氏陰性桿菌，根據霍亂弧菌O抗原的不同，目前已經將其分為200多個血清群，僅O1或O139血清群霍亂弧菌會引起霍亂流行，其致病因子包括霍亂毒素和毒素共調菌毛［6］。而非O1/非O139群霍亂弧菌是指除血清型為O1和O139群以外的其他霍亂弧菌［7］。非O1/非O139群霍亂弧菌可廣泛存在于自然界中，尤其是水體和海產品中。與O1和O139群霍亂弧菌相比，非O1/非O139群霍亂弧菌缺乏霍亂毒素和毒素共調菌毛，其主要致病因子包括腸毒素、溶血素、外膜蛋白酶、脂多糖、蛋白酶三型分泌系統等［8-10］。非O1/非O139群霍亂弧菌可引起類似O1和O139群霍亂弧菌樣表現，其臨床癥狀主要為胃腸炎引起的嘔吐、腹痛和腹瀉等［11］。前期的研究表明，非O1/非O139群霍亂弧菌傳染性較弱，但也存在引起局部大流行的病例報道［12］。

本例患者有乙型肝炎病史10余年，未經抗乙型肝炎病毒治療，因反復腹痛腹脹1年余入院，患者自述一年前無明顯誘因開始出現腹痛和腹脹，呈持續性隱痛，全腹脹，無其他部位放射性疼痛及牽涉痛，無明顯加重或緩解因素，伴全身皮膚及鞏膜輕度黃染，伴乏力、納差、咳嗽、咳痰、胸悶、呼吸困難，伴腹瀉，呈水樣便。生命體征正常。CT檢查顯示肝臟輪廓不光整，體積縮小，各葉比例失調；彩色超聲顯示腹腔內見最大直徑約111 mm液性暗區，影像學檢查提示患者有肝硬化、脾增大和腹腔積液。胃鏡檢查結果提示食管靜脈曲張及門靜脈高壓性胃病。實驗室檢查顯示患者乙肝表面抗原、乙肝e抗體、乙肝核心抗體呈陽性，HBV-DNA定量檢查結果為7.02×106，表明患者為乙型肝炎小三陽型，乙肝病毒處于病毒復制活躍期。肝功能檢查異常，其中總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉肽酶、腺苷脫氨酶指標升高，白蛋白和前白蛋白指標降低。凝血功能異常，凝血酶時間延長。血常規檢查顯示紅細胞、血紅蛋白和血小板顯著低于參考范圍。綜合影像學、實驗室及胃鏡檢查結果，患者被診斷為乙肝肝硬化失代償期，伴有肝功能減退及門靜脈高壓。門靜脈高壓導致脾功能亢進及脾大，進而伴有紅細胞、血紅蛋白和血小板減少，此外，門靜脈高壓還導致側支循環開放，進而導致食管胃底靜脈曲張。

在本研究中，我們從乙肝肝硬化患者血液中分離培養出一株疑似霍亂弧菌。根據該菌株培養特性、形態學特征、生化鑒定、蛋白質譜分析（在4279 m/z、4367 m/z、5123 m/z、6165 m/z、6277 m/z、6453 m/z和7160 m/z采集到特征性質譜峰）、血清學鑒定（分離培養菌株分別與O1群多價血清、O1群分型血清和O139群單價血清反應均未見凝集）及熒光PCR（霍亂弧菌O1群和O139群基因均為陰性），綜合以上實驗結果該菌株被鑒定為非O1/非O139群霍亂弧菌。非O1/非O139群霍亂弧菌致病方式與O1/O139血清群霍亂弧菌不同，其常可導致軟組織感染、耳部感染及血流感染等腸外感染［13］。其中血流感染相對少見，其感染機制尚未明確。近年來，國內外報道過幾例非O1/非O139群霍亂弧菌引起的血流感染。2018年秘魯學者報道1例伴有感染性休克以及多器官衰竭的58歲肝硬化婦女，血液培養出非O1/非O139群霍亂弧菌［14］。TRUBIANO等［15］通過隊列研究非O1/非O139群霍亂弧菌菌血癥的危險因素、流行病學、臨床表現及死亡率，研究表明菌血癥與患者是否伴有慢性肝病或惡性腫瘤相關，此外，還與飲用受污染的供水和海產品相關。我國學者解鴻翔等［16］報道1例酒精性肝硬化患者院內感染非O1/非O139群霍亂弧菌菌血癥。本例乙肝肝硬化患者非O1/非O139群霍亂弧菌血流感染機制尚未明確，目前的研究表明，發生的血流感染不僅取決于感染菌株，還取決于患者的免疫狀態。肝硬化患者由于肝功能受損導致機體固有免疫和適應性免疫功能障礙，此外，肝硬化還導致脾大及脾臟功能亢進，進而伴隨有粒細胞、單核細胞及淋巴細胞等免疫細胞數量減少，患者機體免疫力低下，易伴發各種機會性感染，本例非O1/非O139群霍亂弧菌引起的血流感染原因可能與此相關。此外，霍亂弧菌感染呈季節性流行，主要發生在夏秋季，本院檢出的這株非O1/非O139群霍亂弧菌在7～8月，正處炎熱夏季。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2024-01-23 修回日期：2024-04-02）

（編輯：潘明志）