工程化的PMN-MDSCs來源外泌體在膠原誘導性關節炎小鼠中的應用

［摘要］ 目的： 使用電穿孔方法對多形核髓源性抑制細胞（polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells，PMN-MDSCs）來源的外泌體（exosomes，Ex）進行工程化改造，觀察其對膠原誘導性關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型小鼠疾病進程的干預作用。方法： 構建CIA模型小鼠，磁珠分選PMN-MDSCs，運用超濾技術聯合試劑沉淀法制備培養上清液中的PMN-Ex，免疫印跡法檢測Ex標志性蛋白。使用電穿孔技術對PMN-Ex進行改造并設置分組，包括未處理的PMN-Ex組，電轉miR-93-5p mimics NC組（miR-93-5p mimics NC組）以及電轉miR-93-5p mimics組（miR-93-5p mimics組）。利用實時熒光定量PCR檢測miR-93-5p的裝載效率。流式細胞術檢測改造后的Ex對Th17細胞分化的影響。將不同組別的PMN-Ex尾靜脈注射到CIA小鼠體內，分別觀察足趾外觀情況、足趾HE染色切片情況，測定小鼠的平均關節炎指數（mean arthritic index，MAI）、腘窩淋巴結Th17的比例、血清IL-17A水平，以此判斷不同組別PMN-Ex對CIA小鼠的干預作用。結果： PMN-MDSCs被成功分選并制備了PMN-Ex。熒光定量PCR結果顯示，miR-93-5p mimics組中miR-93-5p的表達水平明顯高于miR-93-5p mimics NC組。相比miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics組處理的小鼠足趾紅腫輕微，關節結構較完整；MAI、腘窩淋巴結Th17細胞比例以及血清IL-17A水平明顯降低。結論： 使用miR-93-5p mimics工程化改造后的PMN-Ex可以更有效地延緩CIA小鼠的疾病進程。

［關鍵詞］ 膠原誘導性關節炎；髓源性抑制細胞；外泌體；miR-93-5p

［中圖分類號］ R392.9" ［文獻標志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2025）01-0001-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240130

［引用格式］陳玉梅， 戴錦東， 張一珂， 等. 工程化的PMN-MDSCs來源外泌體在膠原誘導性關節炎小鼠中的應用［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2025， 35（1）： 1-7.

［基金項目］國家自然科學基金青年基金資助項目（82202001）；儀征市衛生健康委2024年度醫學科研項目（Yxh2024-2-19）

［作者簡介］陳玉梅（1972—），女，主任技師，主要從事自身免疫性疾病的檢驗指標研究；朱棟煒（通訊作者），副教授，碩士生導師，E-mail： 1000005601@ujs.edu.cn；朱成棟（通訊作者），副主任醫師，E-mail： dongdong801208@163.com

Engineered PMN-MDSCs-derived exosomes delay the progression of collagen-induced arthritis in mice

CHEN Yumei¹ ， DAI Jindong² ， ZHANG Yike² ， LI Zelan² ， ZHU Dongwei² ， ZHU Chengdong³

（1. Department of Laboratory Medicine， Yizheng People′s "Hospital， Yizheng Jiangsu 211400; 2. School of Medicine， Jiangsu University， Jiangsu Key Laboratory of Laboratory Medicine， Zhenjiang Jiangsu 212013; 3. Department of Orthopedics， Yizheng People′s "Hospital， Yizheng Jiangsu 211400， China）

［Abstract］ Objective： To make engineered exosomes （Ex） derived from polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells （PMN-MDSCs） by electroporation， and evaluate the intervention effect on the progression of collagen-induced arthritis （CIA） mice model. Methods： Firstly， PMN-MDSCs were selected using magnetic beads from CIA mice， and PMN-Ex were prepared in the culture supernatant using ultrafiltration technology combined with reagent precipitation method. The surface marker proteins were detected by Western blotting. The PMN-Ex were modified by electroporation technology. The loading efficiency of miR-93-5p in PMN-Ex was detected by fluorescence quantitative PCR. The modified PMN-Ex were added to regulate the differentiation of Th17 cells. After injecting different PMN-Ex into the CIA mice， the appearance of the toes， the HE staining section of the toes， the mean arthritis index （MAI）， the proportion of Th17， and serum IL-17A level in mice were observed. Results： PMN-Ex were prepared successfully. The fluorescence quantitative PCR results showed that the expression level of miR-93-5p in PMN-Ex in the experimental group was significantly higher than that in the negative control group. Compared to the negative control group， the mice treated in the experimental group had mild toe redness and swelling and more complete joint structure. In addition， the proportion of Th17 cells in popliteal lymph node， and serum IL-17A level were significantly reduced. Conclusion： The miR-93-5p mimics-engineered PMN-Ex can alleviate the development of CIA mice more effectively.

［Key words］ collagen-induced arthritis; myeloid-derived suppressor cell; exosomes; miR-93-5p

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病^［1］ ，全球患病率約1%，我國患病率約0.5%，總患病人群大約500萬人，通常40～60歲開始發病^［2-3］ ，女性患RA的風險是男性的2～3倍^［4］ 。研究表明，RA患者的血清和關節滑液中均表達高水平的IL-17，并且患者外周血中Th17細胞數量增多^［5］ 。膠原誘導性關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠是研究RA的重要模型，1977年Trentham等^［6］ 通過皮內免疫誘導構建CIA模型，該模型的表型在臨床特征、病理變化和免疫學方面與RA十分相似。小鼠品系DBA/1（H-2q）有較高的CIA發病率，在關節病理變化方面與人類RA更為相似^［7］ 。

本課題組針對RA的治療進行了相關研究，結果發現多形核髓源性抑制細胞（polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells，PMN-MDSCs）來源的外泌體（exosomes，Ex）可以通過miR-29a-3p和miR-93-5p分別靶向T盒子轉錄因子TBX21（T-bet）和信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3），從而抑制Th1和Th17細胞分化，減弱CIA小鼠的關節炎癥狀^［8］ ；另一項研究表明，PMN-Ex能夠通過其內容物前列腺素E2增強IL-10⁺ "B細胞數量，從而改善CIA小鼠的關節炎癥狀^［9］ 。本研究試圖通過工程化改造PMN-Ex，以此增強PMN-Ex延緩CIA小鼠疾病進程的作用。據資料顯示，工程化改造Ex包括表面改造和內容物負載^［10］ 。目前關于MDSC-Ex的內容物負載方式主要采取轉染母細胞的方式進行，本課題組利用miR-29a-3p mimics轉染PMN-MDSCs^［8］ ，分離發現PMN-Ex內的miR-29a-3p表達也增加，進而研究PMN-Ex對初始CD4⁺ "T細胞分化的影響。電穿法是利用電場作用于懸浮在液體中的Ex，瞬間高強度電場產生的電脈沖能穿透Ex的薄膜，在薄膜上形成暫時的小孔，使藥物或類似物質能夠從小孔中向Ex內擴散^［11-12］ 。電穿孔技術的優點是沒有添加任何化學藥劑，在加載DNA和RNA等親水藥物時非常有效^［13］ 。Bai等^［14］ 將人工合成的siRNA通過電穿孔技術裝載進靶向腫瘤歸巢穿膜肽（tLyp-1）的Ex內，結果發現此Ex轉染肺癌和腫瘤干細胞的效率較高。本研究擬對PMN-Ex進行電穿法改造，并探究其對CIA小鼠疾病進程的影響，從而為RA的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

MDSCs磁珠分選試劑盒（德國美天旎公司）；新生小牛血清、DMEM、RPMI-1640、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；Ex分選試劑盒（美國SBI公司）；miR-93-5p mimics、mimics-NC（廣州銳博生物科技有限公司）；兔抗小鼠鈣黏蛋白（Calnexin）、CD63、CD9單克隆抗體（英國Abcam公司）；牛二型膠原、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司）；流式細胞儀（美國Beckman公司）；培養箱（上海力康公司）；凝膠成像系統（美國GE公司）。

1.2 建立CIA小鼠模型

DBA/1J小鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，6～8周齡，體重18～22 g。第1天，小鼠尾靜脈注射0.1 mL濃度為2 mg/mL的牛二型膠原和同體積的弗氏完全佐劑的混合液；第21天，小鼠尾靜脈注射0.1 mL濃度為2 mg/mL的牛二型膠原和同樣體積的弗氏不完全佐劑的混合液，實驗期間定期觀察小鼠的足趾，并拍照記錄。

1.3 磁珠分選PMN-MDSCs并測定其純度

摘取CIA小鼠的脾臟，將其研磨成細胞懸液，然后從MDSCs磁珠分選試劑盒中選擇FcR阻斷試劑、抗Ly-6G生物素和抗生物素磁珠加入細胞懸液，在冰盒中孵育后，將磁珠分選柱裝在分選器上，用PBS洗柱，重復3次，最后獲得的細胞懸液即為PMN-MDSCs，采用流式細胞儀對分選出的細胞進行純度檢測。

1.4 PMN-Ex的提取和蛋白濃度測定

將PMN-MDSCs用RPMI-1640培養液于細胞培養箱中培養，20 h后收集上清液，在超濾管中進行超濾，獲得濃縮液，然后用快速提取試劑盒提取Ex，PBS重懸Ex，于-80 ℃保存；再用等體積的裂解液（RIPA∶ PMSF=250∶1）裂解Ex，采用BCA法測定Ex裂解上清液中的蛋白濃度。

1.5 免疫印跡法檢測PMN-Ex的特異性蛋白

使用等體積的裂解液（RIPA∶PMSF=250∶1）裂 解Ex，冰上放置10 min并振蕩。4 ℃、12 000× "g ，離心15 min，吸取上清液，按體積比3∶1加 入4×SDS-PAGE混勻后，沸水煮10 min。常溫14 000× g 離心10 min，吸取上清液分裝于EP管內，備用；將制備的樣本進行SDS-PAGE電泳，然后轉膜，BSA封閉1 h，將兔抗小鼠Calnexin、CD63單克隆抗體、CD9單克隆抗體，完全覆蓋PVDF膜，4 ℃孵育12 h。第2天，用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體覆蓋PVDF膜，室溫孵育2 h后 ，用ECL顯色曝光，在凝膠成像系統下分析條帶。

1.6 工程化改造Ex

用電穿儀制備工程化的Ex，利用瞬時電場在Ex膜上穿孔，使外源性的miR-93-5p mimics進入PMN-Ex中，達到過表達miR-93-5p的目的。實驗分為未處理的PMN-Ex組、miR-93-5p mimics NC組 和miR-93-5p mimics組。miR-93-5p mimics、mimics NC粉末用 ddH2O溶解（終濃度1 μg/μL），將電極杯及專用長頭吸管置于超凈臺中紫外滅菌30 min以上；每個組別均含有20 μg/μL的PMN-Ex，其中miR-93-5p mimics組和miR-93-5p mimics NC組分別加入5 μL的miR-93-5p mimics和mimics NC，混勻后加入電極杯內；電穿參數設置：111 V電轉3.0 ms，間歇10.0 ms，25 V電轉10.0 ms，間歇50.0 ms，循環10次；最后將電穿好的PMN-Ex 37 ℃水浴1 h，使膜孔完全閉合。加入200 μL PBS后用100 kD超濾離心管洗滌，去除游離在Ex外部的miRNA；濾菌器除菌后，于-80 ℃保存備用。

1.7 檢測改造后的Ex裝載效率

用Trizol法提取各組Ex的總RNA，逆轉錄試劑盒（日本Toyobo公司）對相關miRNA進行逆轉錄，逆轉錄定量PCR檢測miR-93-5p的表達，PCR采用2720熱循環儀（美國ThermoFisher公司）進行，使用Bio-Rad SYBR green mix進行實時PCR，最后用ΔΔCt法對結果進行分析。

1.8 改造后的Ex體外對Th17細胞分化的影響

建立初始T細胞到Th17細胞的分化體系，使用CD4⁺ "T細胞分離試劑盒（德國美天旎公司）分離小鼠CD4⁺ "T細胞。在24孔板中預涂抗CD3單抗（2 μg/mL），每孔接種1×10⁶ 個細胞，每個孔內加入相應濃度的細胞因子：抗CD28單抗（2 μg/mL），TGF-β（5 ng/mL），IL-6（30 μg/mL），抗IL-4單抗（5 μg/mL） ，抗IFN-γ單抗（5 μg/mL）和IL-23（30 ng/mL） 。用含15%胎牛血清（經過100 000× g 離心16 h處理）、pH 7.2～7.4的RPMI-1640細胞培養液，37 ℃、5% CO2 "條件下培養72 h。在Th17細胞分化體系中加入各組Ex，檢測Th17細胞比例和IL-17A水平。

1.9 動物實驗分組

分別在免疫的第18和24天進行小鼠尾靜脈注射，每組6只。① PBS組：注射100 μL的PBS；② 未 處理的PMN-Ex組：注射100 μL用PBS溶解的未作處理的PMN-Ex；③ miR-93-5p mimics NC組：注射100 μL用PBS溶解的miR-93-5p mimics NC組的PMN-Ex；④ miR-93-5p mimics組：注射100 μL用PBS溶解的miR-93-5p mimics組的PMN-Ex。

1.10 小鼠疾病進程評價和足趾切片病理學觀察

在免疫21 d后，每3 d觀察小鼠關節狀況（4只爪子關節炎得分之和）：0分，無紅腫；1分，關節發紅但無腫脹；2分，局限于足趾或踝關節的輕度紅腫；3分 ，足趾至踝關節的輕度紅腫；4分，嚴重的關節腫脹和運動障礙。平均關節炎指數（mean arthritic index，MAI）=每組關節炎得分之和/小鼠總數。于免疫后第42天，取每只小鼠具有代表性的前爪和后爪，將其分別置于10%福爾馬林中；用石蠟包埋，切片4 μm，HE染色，顯微鏡下觀察，拍照記錄。評估關節間隙大小、骨質破壞程度和浸潤性淋巴細胞數量。

1.11 各組模型小鼠腘窩淋巴結中Th17細胞和血清IL-17A水平檢測

在免疫小鼠第42天，摘取小鼠兩側腘窩淋巴結，研磨制備單細胞懸液，加入FITC標記的抗小鼠CD4單克隆抗體，在24孔培養板上培養5 h后用流體細胞儀檢測并分析數據。收集各組小鼠的眼球血，至1.5 mL的EP管中，37 ℃金屬浴30 min，離心后吸取上層血清，用IL-17A檢測試劑盒（上海碧云天公司）進行檢測，測量光密度值，建立標準曲線，分析樣本IL-17A的含量。

1.12 統計學分析

應用GraphPad Prism 8.0軟件繪制統計圖。符合正態分布計量資料用均值±標準差表示，兩組均數比較采用兩樣本 t 檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用Turkey檢驗。 P lt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PMN-Ex的提取與鑒定

PMN-MDSCs為CD11b和Ly-6G雙陽性細胞，通過流式細胞儀測定磁珠分選的PMN-MDSCs，結果顯示PMN-MDSCs的純度達到90%以上（圖1A）。通過超濾法制備PMN-MDSCs培養上清液中的Ex，透射電鏡觀察結果顯示（圖1B），具有典型的茶托樣結構。NTA粒徑分析結果顯示（圖1C），PMN-Ex的直徑為50～120 nm。免疫印跡法檢測結果顯示（圖1D），PMN-Ex高表達CD9、CD63、CD81和HSP60分子，不表達Calnexin蛋白和GAPDH蛋白。

2.2 工程化改造PMN-Ex的裝載效率

利用電穿孔技術制備工程化的Ex，結果顯示，miR-93-5p mimics組PMN-Ex中miR-93-5p的表達水平明顯高于miR-93-5p mimics NC組，并且相比于miR-93-5p mimics細胞轉染組，miR-93-5p mimics組的miR-93-5p水平顯著升高（圖2），表明相比干細胞轉染的方法，電穿孔技術能有效地將miR-93-5p mimics裝載進Ex內。

2.3 改造后的Ex對Th17細胞分化的影響

在Th17細胞誘導分化體系中，加入不同組別的PMN-Ex，流式細胞儀檢測Th17細胞的比例（圖3A）。未處理的PMN-Ex組和miR-93-5p mimics NC組沒有明顯差異，相較于miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics組Th17細胞的比例明顯降低（圖3B）。

2.4 各組小鼠關節炎疾病進程

使用不同組別的PMN-Ex處理CIA小鼠，結果發現PBS組小鼠的MAI水平最高，未處理的PMN-Ex組與miR-93-5p mimics NC組相比，MAI無明顯差異；而與miR-93-5p mimics NC組相比，miR-93-5p mimics組小鼠MAI水平則明顯下降（ P lt;0.05），見圖4。

2.5 各組小鼠足趾外觀及關節活動情況

在免疫第42天對CIA模型小鼠進行拍照，發現PBS組的小鼠足趾嚴重紅腫，miR-93-5p mimics NC組和未處理的PMN-Ex組內小鼠足趾輕微紅腫，miR-93-5p mimics組小鼠的足趾外觀幾乎沒有紅腫（圖5） 。

2.6 各組小鼠足趾切片HE染色情況

對各組別PMN-Ex處理后的CIA小鼠足趾進行切片及HE染色，結果顯示，PBS組小鼠關節結構遭到破壞，關節腔縮小，并可見大量炎性細胞浸潤。未處理的PMN-Ex組和miR-93-5p mimics NC組小鼠足趾關節顯示淋巴細胞浸潤較少，關節結構相對完整。相較于miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics組小鼠的足趾關節結構更為完整，保護作用更強（圖6）。

2.7 各處理組小鼠腘窩淋巴結中的Th17細胞比例

流式細胞儀檢測各處理組小鼠腘窩淋巴結內Th17細胞的比例（圖7A），未處理的PMN-Ex組與miR-93-5p mimics NC組比較，小鼠腘窩淋巴結內Th17細胞的比例無明顯差異；而相較于miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics組小鼠腘窩淋巴結內Th17細胞的比例明顯下降（ P lt;0.01），見圖7B。

2.8 各處理組小鼠血清IL-17A的水平

ELISA測定各處理組小鼠血清中IL-17A水平，結果顯示，未處理的PMN-Ex組與miR-93-5p mimics NC組比較，小鼠血清IL-17A水平無明顯差異；而相較于miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics處理組小鼠血清IL-17A水平明顯下降（ P lt;0.01），見圖8。

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，其主要特點是免疫功能紊亂^［15］ 。目前對RA的治療主要是對癥治療，即控制疾病的發展，緩解關節疼痛感，維持受累關節的功能，盡可能減少對骨的破壞，然而非靶向性療法不可避免地會對RA患者產生顯著的不良反應，也會誘發系統性并發癥，并且非靶向性療法的價格昂貴^［5，16］ 。因此，找到一種更安全有效的治療方式顯得格外重要。

Ex屬于內源性囊泡，包裹各種脂質、蛋白質、核酸，并能將其裝載的物質運輸至受體細胞而發揮生物學作用，它可以通過生物屏障，具有低免疫原性和低毒性的特點，在機體內難以被降解或清除^［17］ 。相對其來源細胞，利用Ex調節受體細胞生物學功能來治療疾病具有很大優勢^［18-19］ 。研究發現，在自身免疫性斑禿（alopecia areata，AA）小鼠模型中，使用MDSC-Ex治療AA小鼠后，MDSC-Ex主要被Treg細胞攝取，隨后Treg細胞比例大幅增加，輔助性T細胞則減少，淋巴細胞凋亡增加，小鼠斑禿癥狀得到明顯改善^［20］ 。但是，天然Ex在體內沒有足夠的靶向性，很容易被機體清除，或者被其他非目的細胞吸收，并且Ex與細胞膜的相互作用使得Ex的半衰期縮短，這也會使Ex的治療效果大打折扣^［21］ 。為了增強Ex在靶向治療疾病方面的效果，越來越多的研究開始著手改造Ex，一般將改造后的Ex稱為工程化Ex。目前，對于工程化改造Ex的研究主要集中在來源于間充質干細胞和免疫細胞的Ex，對于MDSCs來源Ex的改造研究較少。因此本實驗試圖對MDSCs-Ex進行內容物的裝載，即主要聚焦于篩選Ex內有效“貨物”，進而采取不同的方法將有效的“貨物”裝載入Ex內。miR-93-5p作為一種微小RNA，在多種疾病中通過不同的機制發揮作用，例如直接靶向基因、調節信號通路、影響細胞行為等。本課題組在前期的研究中發現，裝載外源性miR-93-5p可以靶向初始T細胞內的STAT3，從而抑制Th17細胞的分化，因此本研究通過工程化改造PMN-Ex，將miR-93-5p裝載到PMN-Ex中，觀察其對CIA模型小鼠疾病進程的干預作用。結果發現工程化改造的PMN-Ex在CIA小鼠體內展現了強大的免疫抑制作用，實驗結果表明工程化的PMN-Ex可以顯著降低小鼠腘窩淋巴結中Th17的比例以及降低血清IL-17A的水平，并且延緩小鼠的疾病進程。

下一步的研究可以從三方面進行，第一，增加更多有效內容物的裝載，如課題組前期發現的miR-29a-3p，并且可以拓寬對有效內容物的尋找，比如有效的蛋白質和其他非編碼RNA成分。第二，可以著手對PMN-Ex進行表面改造，使其可以靶向重要的目的細胞，進而增加目的細胞對Ex的攝取，進一步提高Ex的干預作用。第三，從Ex的來源考慮，目前通過細胞分泌Ex這種方法來獲取Ex的量還太有限，可以考慮用納米材料取代囊泡結構，包裹已知的有效成分，從而達到批量、大量生產的條件，為Ex的臨床生物治療提供可行性方案。此外，PMN-Ex也被證實對CIA等其他自身免疫性疾病模型小鼠具有重要的免疫抑制作用^［22］ ，所以對PMN-Ex進行工程化改造將大有可為，有望為治療自身免疫性疾病提供新的方法。

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［收稿日期］ 2024-08-06" ［編輯］ 郭 欣