巨噬細胞來源的瘦素促進Th17分化參與心肌炎性損傷

［摘要］ 目的： 探究瘦素（Leptin）與輔助性T細胞17（T helper 17，Th17）在心肌炎性損傷過程中的作用。方法： 采用柯薩奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）構建病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）模型；將小鼠分為對照組和VMC組，通過HE染色檢測心肌炎性浸潤情況，流式細胞術（FACS）檢測脾臟組織Th17的表達，定量實時PCR（qRT- PCR）檢測心臟組織中 IL-17A "mRNA的表達，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測外周血血清中IL-17A的含量。分離正常以及db/db（Leptin受體缺陷）小鼠脾臟組織中初始CD4⁺ T細胞，分為對照組、Th17組以及Leptin+Th17組，分化培養后檢測Th17細胞比例和培養上清液中IL-17A含量。最后，運用氯膦酸鹽脂質體去除巨噬細胞（macrophage ，Mφ）后構建VMC小鼠模型，分為對照組、VMC組和VMC+脂質體組，檢測脾臟和腹腔巨噬細胞比例、心肌炎性浸潤情況、心臟組織中 Leptin "mRNA表達以及外周血中Leptin和IL-17A含量。結果： 與對照組相比，VMC組心肌炎性浸潤增加，脾臟Th17比例上調，心臟組織 IL-17A "mRNA表達和血清IL-17A含量明顯增加（ P lt;0.05）。體外分離正常小鼠CD4⁺ T細胞后，Leptin+Th17組Th17比例及培養上清液IL-17A含量較Th17組顯著增加（ P lt;0.05），而Lepr^-/- CD4⁺ T細胞中兩組Th17比例、IL-17A含量無明顯差異。體內敲除巨噬細胞后，VMC+脂質體組小鼠脾臟與腹腔巨噬細胞（CD11b⁺ F4/80⁺ ）比例較VMC組明顯減低，心肌炎性浸潤緩解，心臟組織 Leptin "mRNA表達、脾臟組織Th17比例及外周血Leptin和IL-17A含量較VMC組顯著減低。結論： 巨噬細胞來源的Leptin通過調控Th17分化參與心肌炎性損傷發生。

［關鍵詞］ 巨噬細胞；瘦素；病毒性心肌炎；Th17

［中圖分類號］ R392.6" ［文獻標志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2025）01-0021-05

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240148

［引用格式］趙文君， 湯德發. 巨噬細胞來源的瘦素促進Th17分化參與心肌炎性損傷［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2025， 35（1）： 21-25， 38.

［作者簡介］趙文君（1987—），女，江蘇盱眙人，主管技師，碩士，主要從事臨床免疫檢驗。

Leptin from macrophages promotes Th17 differentiation and participates in inflammatory myocardial injury

ZHAO Wenjun， TANG Defa

（Department of Clinical Laboratory， Affiliated People′s "Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212002， China）

［Abstract］ Objective： To explore the role of Leptin and Th17 in the process of myocarditis injury. Methods： CVB3 was used to construct a viral myocarditis （VMC） model. First， the mice were divided into control group and VMC group. HE staining was used to detect myocardial inflammatory infiltration. The expression of Th17 in spleen tissue was measured by FACS. qRT-PCR was used to detect the expression of "IL-17A "mRNA in cardiac tissue. The level of IL-17A in serum was detected by ELISA. Secondly， Nave CD4⁺ T cells in the spleen tissues of normal and db/db （Leptin receptor deficiency） mice were isolated and divided into control group， Th17 group and Leptin+Th17 group， and the proportion of Th17 cells and the content of IL-17A in the culture supernatant were detected after differentiation culture. Finally， a VMC model was established after the removal of macrophages （Mφ） by clodronate liposome. The mice was divided into control group， VMC group and VMC+Liposome group. FACS was used to detect the proportion of Mφ （CD11b⁺ F4/80⁺ ） in spleen and abdominal cavity and the proportion of Th17 in spleen. HE staining was used to detect myocardial inflammatory infiltration again. "Leptin "mRNA expression in cardiac tissue was detected by qRT-PCR. The level of Leptin and IL-17A in serum was detected by ELISA. Results： Compared "with control group， myocardial inflammatory infiltration was increased in VMC group， the proportion of Th17 in spleen was up-regulated， and the expression of "IL-17A "mRNA in cardiac tissue and serum IL-17A were significantly increased （ P lt;0.05）. After isolation of CD4⁺ T cells from normal mice "in vitro ， compared with Th17 group， the proportion of Th17 cells and the level of IL-17A in the culture supernatant were significantly increased in Leptin+Th17 group （ P lt;0.05）， while there was no significant difference in the proportion of Th17 and IL-17A content in the Lepr^-/- CD4⁺ T cells. In addition， after Mφ was knocked out "in vivo ， compared with the VMC group， the proportion of Mφ （CD11b⁺ F4/80⁺ ） in spleen and abdominal cavity of mice in the VMC+Liposome group was significantly reduced， HE staining showed that myocardial inflammatory infiltration was relieved， "Leptin "mRNA expression in cardiac tissue， the proportion of Th17 in spleen and serum level of Leptin and IL-17A were significantly decreased. Conclusion： Mφ-derived Leptin is involved in myocarditis injury by regulating Th17 differentiation.

［Key words］ macrophage; leptin; viral myocarditis; Th17

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）主要是由柯薩奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）引起的炎性心肌疾病，表現為CVB3病毒在心肌細胞內的大量復制，引發以免疫細胞浸潤和炎性因子分泌為特征的宿主免疫反應，從而導致心肌損傷^［1-2］ 。由于對VMC的發病機制缺乏充分的了解，目前尚缺乏有效的治療方法。已有文獻表明，巨噬細胞（macrophage ，Mφ）作為一群高度異質性的細胞群體，可根據局部微環境的改變將自身重新編程為具有促炎作用的M1型炎性巨噬細胞并分泌炎性介質參與炎癥損傷，也可將自身編程為抑炎促進組織修復的M2型巨噬細胞參與VMC的發展進程^［3-4］ ，但具體機制不明。亦有文獻證實Th17細胞通過分泌炎性介質IL-17A促進VMC的炎性損傷^［5］ 。瘦素（Leptin） 由肥胖相關基因編碼，主要由脂肪細胞分泌，控制能量消耗和代謝^［5-6］ 。已有研究發現Leptin能夠參與免疫應答以及炎性疾病的進展，例如：Leptin能夠促進Th17分化參與系統性紅斑狼瘡的發生^［7］ ；Leptin促進炎性介質分泌參與克羅恩腸炎發生^［8］ 。本研究旨在探討VMC發生過程中巨噬細胞、Leptin以及Th17三者的聯系，為臨床治療VMC提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 VMC小鼠模型構建

6周齡雄性Balb/c以及Leptin受體缺陷（Lepr^-/- ）db/db小鼠購買于常州卡文斯生物科技有限公司，在SPF條件下飼養1周。取6周齡Balb/c小鼠10只，分為對照組、VMC組，每組5只。將10³ "50%組織培養感染劑量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）的柯薩奇病毒B3溶于0.1 mL PBS或無血清培養基，腹腔注射至VMC組小鼠；對照組小鼠腹腔注射0.1 mL生理鹽水。db/db小鼠用于Leptin體外誘導Lepr^-/- "CD4⁺ T的Th17分化相關實驗；其余體內模型構建以及體外誘導小鼠均為Balb/c。

1.2 氯膦酸鹽脂質體敲除巨噬細胞

取6周齡Balb/c小鼠，腹腔注射脂質體，200 μL/只 ，注射2 d，48 h后FACS檢測腹腔和脾臟組織中CD11b⁺ F4/80⁺ 的表達，驗證巨噬細胞敲除后，進行VMC模型的構建。實驗分為對照組（腹腔注射等體積的培養基）、VMC組以及VMC+脂質體組，用于驗證Leptin的來源以及對Th17分化的影響。

1.3 HE染色觀察心臟組織炎性浸潤

取各組小鼠心臟組織多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片并進行梯度脫蠟，最后進行中性樹脂封片，顯微鏡下觀察炎性浸潤。根據心臟組織HE切片取5個視野，計算每個視野中炎性細胞浸潤及壞死區域面積與整個視野面積之比，無病變計0分、lt;25%計1分、25%～50%計2分、50%～75%計3分、gt;75%計4分。

1.4 初始CD4⁺ T細胞分選

① 分離正常以及db/db小鼠脾臟細胞懸液：小鼠處死后，在無菌環境下摘取脾臟組織，置于篩網中研磨，加入2 mL PBS后收取細胞懸液；4 ℃、500× g 離心5 min，棄上清液后加入紅細胞裂解液，充分混勻并室溫靜置3 min后加入等體積的PBS，4 ℃、500× g 離心5 min，棄上清液，加入PBS洗滌2遍后，進行細胞學計數。② 磁珠分選CD4⁺ T細胞：將收集的脾細胞加入400 μL磁珠分離緩沖液，按照10⁸ 個細胞/100 μL加 入CD4⁺ T細胞生物素標記抗體Ⅱ充分混勻，置于冰上10 min，隨后加入200 μL抗 生物素微球以及300 μL緩沖液，充分混勻后置于冰上15 min 。4 ℃、300× g 離心10 min洗滌細胞，棄上清液，重懸并置于LS柱進行磁珠吸附分選，收集從LS柱中流出的懸液，最后再用緩沖液洗滌分離株，收集剩余懸液并計數。

1.5 體外誘導Th17分化

將分選好的CD4⁺ T細胞和Lepr^-/- CD4⁺ T細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640中。Th17誘導體系：CD3單抗（1 μg/mL）4 ℃過夜后，加入CD28單 抗（500 ng/mL）、TGF-β（2.5 ng/mL ）、IL-6（20 ng/mL） 、IL-23（20 ng/mL）。本實驗分為對照組（CD3單抗和CD28單抗）、Th17組以及Leptin（10 μg/mL）+Th17組。FACS通過雙染CD4和IL-17A檢測Th17比例。

1.6 FACS檢測Th17細胞比例

取小鼠脾臟組織細胞懸液經紅細胞裂解液處理，洗滌、棄上清液并加入PBS重懸。體外誘導Th17分化以及不同模型組Th17比例均以流式抗體FITC-CD4以及APC-IL-17A進行染色，20 min后洗滌2遍，加入300 μL PBS重懸后經流式細胞儀檢測Th17比例。

1.7 qRT-PCR檢測 IL-17A 與 Leptin "mRNA表達

體外收集對照組、Th17組以及Leptin+Th17組初始CD4⁺ T細胞并用1.0 mL PBS重懸；體內收集對照組、VMC組以及經脂質體敲除巨噬細胞后設置的對照組、VMC組、VMC+脂質體組小鼠心臟組織。RNA抽提試劑盒提取RNA后，根據說明書逆轉錄成cDNA后進行擴增。qRT-PCR檢測 IL-17A 與 Leptin "mRNA的表達，GAPDH為內參。循環條件：95 ℃預變性15 s，90 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延 伸15 s。相對表達量用2^-ΔΔCt 方法計算。

1.8 ELISA檢測IL-17A與Leptin的含量

取制備好的小鼠外周血血清（1 000× g 離心10 min ）以及各分化組細胞上清液（300× g 離心10 min ）進行IL-17A測定。取100 μL細胞上清液或20 μL血清樣本加入反應孔；隨后加入檢測抗體，室溫孵育2 h，洗滌拍板后加入HRP反應30 min；重復洗滌步驟后加入顯色液顯色5～30 min后加終止液，酶標儀讀數分析。

1.9 統計學分析

應用GraphPad Prism 6.0統計軟件進行統計學分析。兩獨立樣本間比較采用 t 檢驗，多組均數間比較采用單因素方差分析及SNK- q 檢驗進行兩兩比較，以 P lt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VMC小鼠模型中Th17的表達增加

相較于對照組小鼠，VMC小鼠心臟組織中炎性細胞浸潤增加（圖1A），脾臟組織Th17比例明顯增加（圖1B），心臟組織中 IL-17A "mRNA表達明顯上升（圖1C），血清中IL-17A含量明顯增加（圖1D）， P 均lt;0.05。

2.2 Leptin體外誘導CD4⁺ T細胞向Th17分化

在正常CD4⁺ T細胞中，FACS結果顯示，體外誘導的Th17組的Th17細胞比例明顯高于對照組（ P lt;0.01），而Leptin+Th17組Th17細胞比例較Th17組升高顯著（ P lt;0.05）。ELISA檢測結果顯示3組細胞上清液中IL-17A的含量與FACS檢測結果一致（圖2）。

2.3 Leptin體外誘導Lepr^-/- "CD4⁺ T細胞向Th17分化

Lepr^-/- "CD4⁺ T細胞中，FACS結果顯示，體外誘導的Th17組Th17細胞比例明顯高于對照組（ P lt;0.05），而Leptin+Th17組與Th17組相比Th17比例無明顯變化（圖3A）。3組細胞上清液中IL-17A的含量與FACS檢測結果一致（圖3B）。

2.4 敲減巨噬細胞減輕VMC小鼠心肌炎性損傷

FACS結果顯示，相較于對照組，脂質體注射后小鼠脾臟與腹腔巨噬細胞比例顯著減少（圖4A， P 均lt;0.001）；HE染色結果顯示，相較于VMC組，VMC+脂質體組心臟組織中炎性細胞浸潤緩解，炎癥評分減低（圖4B， P lt;0.05）；qRT-PCR與ELISA分別顯示，與VMC組比較，VMC+脂質體組心臟組織與外周血血清中Leptin水平下調（圖4C-D， P 均lt;0.05）。此外，FACS結果也證實，Leptin表達下調后脾臟組織Th17比例明顯降低（圖4E， P lt;0.05），外周血血清中IL-17A水平也同樣下調（圖4F， P lt;0.001）。

3 討論

心肌炎是由多種感染或非感染因素引起的心肌炎癥損傷，包括病毒、免疫系統激活或暴露于毒素/藥物等^［9］ 。而VMC是一種傳染性心肌疾病，主要是由CVB3病毒對心肌的直接損害導致自身免疫反應引起的心肌細胞退化和壞死。其特征是免疫細胞的浸潤和炎癥因子的分泌，從而導致心肌損傷^［10］ 。根據臨床特點，VMC可分為暴發性、急性、亞急性、慢性心肌炎，心肌病理中可見局限性或彌漫性炎癥浸潤^［11］ 。已有學者證實除了B細胞和單核巨噬細胞浸潤心肌外，T細胞也是炎癥病變中必不可少的參與者^［12］ 。在一些VMC患者中由于疾病的持續發展或心肌損傷可導致擴張型心肌病甚至心力衰竭。盡管如此，VMC的發病機制尚未得到很好的證實。

初始CD4⁺ T細胞在特定細胞因子的刺激下可以分化成多種CD4⁺ Th細胞亞型。這些CD4⁺ Th細胞在調控免疫反應中發揮核心作用，它們在抵抗致病性感染、慢性炎癥、自身免疫性疾病以及腫瘤的發展中都至關重要。研究已經確認，CD4⁺ Th細胞能夠分化成Th1、Th2、Th9以及調節性T細胞（Treg）等多種亞型^［13］ 。Th17細胞與多種自身免疫性疾病^［14］ 、感染性疾病^［15］ 和腫瘤^［16］ 的發生發展密切相關。Th17細胞能夠招募并激活中性粒細胞，參與宿主的防御反應，在對抗細胞外細菌和真菌感染中發揮重要作用。然而，Th17細胞的過度活化也可能引發組織炎癥，促進多種自身免疫性疾病的發展^［17］ 。研究表明，Th17細胞亞群及其效應因子IL-17參與VMC的發病過程，它們在整個VMC病程中積累，并在促進TNF-α、IL-1β和IL-6在內的多種炎癥因子的產生中發揮作用^［18］ 。因此，深入研究Th17細胞的分化調控機制，不僅有助于全面地理解其在免疫應答和疾病發展中的作用，還可能揭示治療相關疾病的新策略。本研究結果表明Leptin能夠促進Th17細胞的分化，并參與心肌炎的進展，但其具體的細胞來源尚未明確。

Leptin是一種由脂肪組織產生的肽類激素，在促進能量代謝、生長發育以及維持內分泌系統中發揮關鍵作用^［5］ 。Leptin在調節自身免疫反應中也發揮著重要作用。它能夠促進T細胞、B細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞的增殖和分化，并刺激促炎細胞因子的產生。研究表明Leptin與系統性紅斑狼瘡^［19］ 、多發性硬化病^［20］ 和實驗性自身免疫性腦脊髓炎^［21］ 的發病機制密切相關，主要通過促進CD4⁺ T細胞的增殖分化來影響疾病的發生和發展。Leptin的生物學功能依賴于細胞表面的受體表達，而db/db模型小鼠是針對Leptin受體缺陷的特異性小鼠，其受體的缺失明顯抑制Leptin的功能發揮。本研究顯示，Leptin能夠與CD4⁺ T細胞表面的受體結合發揮其生物學活性，應用Lepr^-/- CD4⁺ T細胞其促進Th17分化的特性消失。本研究還發現，在心肌炎的發展過程中，Leptin的主要來源是巨噬細胞。通過使用脂質體敲除小鼠體內的巨噬細胞，VMC小鼠的心肌炎癥得到緩解，脾臟Th17細胞比例下降，心肌組織及血清Leptin的水平也顯著降低。這些結果表明，促進Th17細胞分化并分泌炎癥介質IL-17A、從而加劇心肌炎損傷的Leptin主要來源于巨噬細胞。

本研究證實了巨噬細胞來源的Leptin能夠促進Th17分化，加劇VMC的炎性損傷，為心肌炎的治療提供了新的候選靶點。但巨噬細胞在VMC中的具體作用機制以及如何通過調節巨噬細胞的功能狀態來控制Th17細胞分化和炎癥反應尚需進一步研究。

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［收稿日期］ 2024-09-24" ［編輯］ 何承志