腫瘤微環境響應性GO-DOX載體的制備及其在小鼠移植瘤診斷和治療中的應用

［摘要］ 目的： 制備具有環境響應性能的光熱藥物載體，實現藥物在腫瘤組織的可控釋放，達到在體內精準定位及殺傷腫瘤細胞的目的。方法： 將化療藥物多柔比星（doxorubicin，DOX）附載到氧化石墨烯（graphene oxide，GO）載體表面，制備GO-DOX納米粒子，并檢測DOX的熒光信號變化。首先，GO-DOX分別與小鼠乳腺癌4T1細胞和人胃上皮GES-1細胞共孵育，通過共聚焦顯微鏡觀察兩種細胞在不同時間點的熒光強度；隨后，建立4T1小鼠移植瘤模型，觀察小鼠移植瘤體積變化評價GO-DOX納米粒子聯合近紅外光對小鼠移植瘤的抑制作用，并收集小鼠腫瘤組織制作病理切片。結果： GO-DOX納米粒子不僅具有環境響應釋放性能，且能實現對腫瘤細胞熒光成像。GO-DOX納米粒子聯合近紅外光治療不僅能抑制腫瘤生長，而且能緩解DOX對機體的毒副作用。結論： 成功制備了具有環境響應性能的GO-DOX納米粒子，不僅能抑制腫瘤生長，而且能實現對腫瘤細胞的實時示蹤成像。

［關鍵詞］ 環境響應；可控釋放；熒光成像；氧化石墨烯多柔比星納米載體

［中圖分類號］ R73-36" ［文獻標志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2025）01-0039-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230201

［引用格式］程文驍， 王德強， 唐宇， 等. 腫瘤微環境響應性GO-DOX載體的制備及其在小鼠移植瘤診斷和治療中的應用［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2025， 35（1）： 39-45.

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81370889）

［作者簡介］程文驍（1990—），男，檢驗師；毛朝明（通訊作者），副教授，主任醫師，博士生導師，E-mail： mcm20040901@126.com

Preparation of tumor microenvironment-responsive GO-DOX nanocarriers and their application in tumor diagnosis and treatment of mouse transplanted tumor

CHENG Wenxiao， WANG Deqiang， TANG Yu， MAO Chaoming

（Department of Laboratory Medicine， Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212001， China）

［Abstract］ Objective： To prepare a photothermal drug carrier capable of responding to the tumor environment， enabling controlled drug release within tumor tissues for precise targeting and destruction of tumor cells "in vivo . Methods： Chemotherapeutic drug doxorubicin （DOX） "was loaded into the surface of graphene oxide （GO） "carriers to produce GO-DOX nanoparticles， and the change of DOX fluorescence signal was monitored. First， GO-DOX was respectively incubated with mouse breast cancer 4T1 cells and human gastric epithelial GES-1 cells， and the fluorescence intensity of the two cell types was observed at different time points by confocal microscope. Then， the tumor xenograft model of 4T1 mouse was established and the changes of tumor volume of mice were observed. Last， tumor tissues were collected to prepare pathological sections， and the inhibitory effect of GO-DOX nanoparticles combined with near infrared light on xenografts in mice was evaluated. Results： GO-DOX nanoparticles not only had the environmental responsiveness to control drug release， but also were used to fluorescently image tumor cells. The combination of GO-DOX nanoparticles and near-infrared light effectively inhibited tumor growth and reduced the toxic and side effects of DOX on human body. Conclusion： Environment-responsive GO-DOX nanoparticles were successfully prepared， and can be used to effectively inhibite the growth of tumor and realize real-time imaging of tumor cells.

［Key words］ environment response; controlling release; fluorescence imaging; GO-DOX nanocarrier

腫瘤是危害人類健康的疾病之一，目前臨床上治療腫瘤的方法以放療、化療和手術切除為主^［1］ 。雖然上述治療手段能有效抑制腫瘤的進展，但無法徹底根除腫瘤且給正常組織帶來了損傷作用^［2］ 。因此開發新型高效的腫瘤治療方案，同時降低對機體正常組織的損傷迫在眉睫。

正常組織通過神經調節來控制血流量及血流速度以保持機體溫度恒定，然而腫瘤組織缺乏自主調節功能，使腫瘤組織成為一個天然的熱量存儲庫，為腫瘤光熱治療提供了得天獨厚的優勢^［3］ 。由于單一的光熱治療需要較高的溫度來殺傷腫瘤細胞，因此易對腫瘤周邊正常組織造成損傷；以光敏劑和光熱材料為基礎的近紅外光（near-infrared light，NIR）激發的光熱治療，能有效克服單一光熱治療所引起的缺陷^［4］ 。因此，各種光熱材料被廣泛開發并用于腫瘤光熱治療，然而NIR激發的光熱效應對組織滲透性有限，從而影響其對深部腫瘤組織的殺傷^［5］ 。

為克服上述缺陷，近年來基于NIR激發的腫瘤光熱聯合治療能有效彌補單一治療方法的缺陷，從而有效殺傷腫瘤細胞，以達到抑制腫瘤生長的目的，其中以光熱/化療為主^［6］ 。然而此方法無法實現對體內腫瘤細胞的定位，以實時監測腫瘤細胞在體內的分布而實現腫瘤的精準殺傷。本研究利用具有熒光淬滅性能的光熱材料氧化石墨烯（graphene oxide，GO）裝載抗腫瘤藥物多柔比星（doxorubicin，DOX），制備GO-DOX納米粒子，合成過程見圖1A。在體內運輸過程中，GO能有效淬滅DOX的熒光信號，當其通過滯留性與滲透性到達腫瘤組織后，腫瘤組織中高濃度谷胱甘肽（glutathione，GSH）將GO還原成還原型氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO），迫使DOX主動從GO表面解離，實現DOX的環境響應釋放，致使DOX的熒光信號恢復，實現對腫瘤細胞的精準定位及殺傷。此外，GO具有優越的光熱轉換性能，當其在NIR的激發下，將光能轉換成熱能，實現光熱/化療聯合治療，從而有效抑制腫瘤生長，GO-DOX納米粒子在體內的抗腫瘤機制見圖1B。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

SPF級BALB/c雌性小鼠（6周齡）購自南京卡文斯生物技術有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2022-0009。石墨、CCK8試劑盒、濃硫酸、硝酸鈉和DOX購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，高錳酸鉀（KMnO 4 ）和過氧化氫（H2O2 ）購自北京國藥化學試劑公司。

1.2 GO的制備

① 17 mL濃硫酸和0.37 g硝酸鈉加入250 mL錐 形瓶中，將此錐形瓶置于4 ℃環境中攪拌（1 000 r/min ，10 min），使硝酸鈉完全溶解；② 0.5 g石 墨加入上述溶液中，使其充分溶解；③ 稱 取2.5 g KMnO4 ，每次向上述溶液中加入0.1 g KMnO4 ，直至KMnO4 全部加完，并使整個體系的溫度保持在20 ℃以下；④ 將裝有混合物的錐形瓶置于35 ℃的水浴中，繼續攪拌3 h，并加入125 mL超純水；⑤ 將2 mL H2O2 加入上述混合體系，中和體系中未反應的KMnO4 ；⑥ 將上述體系分別加入50 mL離心管中，15 000 r/min離心10 min，棄上清液，并用稀鹽酸清洗5遍，棄去殘留的Mn²⁺ 及其氧化物；⑦ 收集沉淀，冷凍干燥，真空保存備用。

1.3 GO-DOX納米粒子的制備

10 mg GO加入10 mL超純水中，攪拌均勻，接著加入10 mg DOX，在室溫下攪拌24 h，15 000 r/min離心10 min，收集沉淀，并用超純水清洗3遍。

1.4 DOX從GO-DOX納米粒子表面釋放

將GO-DOX（100 mg/mL）納米粒子置于體外模擬高濃度GSH（10 mmol/L）溶液中，在設計好的時間點（0、3、6 h），用熒光光譜儀檢測DOX熒光信號強度，分析DOX從GO-DOX納米粒子表面釋放情況。

1.5 GO-DOX納米粒子在腫瘤細胞內熒光成像

人胃上皮細胞（GES-1）和小鼠乳腺癌細胞（4T1）分別接種到細胞培養皿中，置于37 ℃、5% CO2 培養箱中孵育12 h；將GO-DOX納米粒子（1 mg/mL）分別加入GES-1和4T1細胞中，共孵育3 h；棄去上清液，用4%多聚甲醛固定10 min，并用PBS清洗數次，最后用共聚焦顯微鏡觀察4T1細胞及GES-1細胞內DOX的熒光強度。

1.6 GO-DOX納米粒子光熱轉換效率

將不同濃度GO-DOX納米粒子（100 mg/mL和200 mg/mL）分別用不同功率（1.0 W/cm² 、1.5 W/cm ² 和2.0 W/cm² ）NIR激發，通過近紅外成像儀記錄各處理組溫度變化^［7］ 。

1.7 GO-DOX納米粒子協同NIR對4T1細胞殺傷效果

首先將4T1細胞接種于96孔板中（1×10⁵ /孔），置于37 ℃、5% CO2 細胞培養箱中孵育12 h；隨后取出96孔板，棄去培養基，并用PBS清洗3遍，將GO-DOX納米粒子配置成0、50、100、150 mg/mL，分別加入96孔板中，每孔100 μL，置于細胞培養箱中孵育3 h，將96孔板置于NIR下，照射10 min，接著孵育24 h；最后，棄去細胞培養液，用PBS清洗3遍 ，將CCK-8試劑加入上述培養基中，置于細胞培養箱中孵育3 h；然后用酶標儀在450 nm激發波長下，檢測96孔板各孔的光密度（ D ），計算4T1細胞存活率。

1.8 4T1小鼠皮下移植瘤模型的構建

將培養好的4T1細胞用PBS清洗3遍，隨后用胰酶消化，獲得的4T1細胞用PBS重懸并充分混勻；固定Balb/c小鼠，用75%乙醇擦拭Balb/c小鼠左下側乳腺處；吸取的4T1（5×10⁶ ）細胞懸液200 μL注射到Balb/c小鼠左下側乳腺處；每天觀察小鼠腫瘤生長情況，測量腫瘤組織長邊（a）及短邊（b） 的直徑（mm），根據以下公式計算出腫瘤大小^［8］ ：腫瘤體積（ V ）=0.5×a×b² 。

1.9 移植瘤小鼠體內GO-DOX納米粒子抗腫瘤治療

待4T1移植瘤小鼠腫瘤大小長到100 mm³ 左右時，將移植瘤小鼠隨機分成4組，每組6只；每隔3 d ，各治療組小鼠分別通過尾靜脈給予200 μL PBS，DOX+NIR（1 mg/mL），GO+NIR（1.5 mg/mL），GO-DOX+NIR（1.5 mg/mL，濃度為1 mg/mL DOX）處理，每天測量小鼠移植瘤體積及小鼠體重變化（體重下降超過小鼠自身體重的15%，處死小鼠）。15 d后，收集各治療組小鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）和腫瘤組織進行HE染色；此外，對腫瘤組織進行原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）染色，觀察腫瘤細胞凋亡情況。

1.10 統計學分析

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，采用Shapiro-Wilk法對各連續變量進行正態性檢驗，符合正態分布用均數±標準差（ x±s ）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD- t 檢驗。 P lt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GO-DOX納米粒子物理表征

制備的GO-DOX納米粒子粒徑大約為180 nm（圖2A）。當DOX通過π-π堆積作用，裝載到GO表面后，GO-DOX納米粒子的電勢電位由-20.5 mV（GO）變為-12.5 mV（GO-DOX），見圖2B。

2.2 GO-DOX納米粒子熒光特性

圖3A結果顯示，當DOX成功附載到GO表面后，DOX的熒光信號明顯降低，說明GO不僅能有效附載DOX，而且能淬滅DOX的熒光信號。隨后，將制備的GO-DOX納米粒子置于10 mmol/L GSH溶液中，隨著時間的推移，DOX的熒光信號強度逐漸增強，且在240 min時，DOX熒光信號并沒有明顯變化，說明DOX從GO-DOX納米粒子表面逐漸釋放，在240 min后，DOX完全從GO-DOX納米粒子表面解離（圖3B）。基于腫瘤組織內含有高濃度GSH，為實現GO-DOX納米粒子對腫瘤細胞的實時示蹤成像，將GO-DOX納米粒子分別與GES-1細胞和4T1細胞共孵育，當GO-DOX納米粒子與4T1細胞共孵育時，分別在0、3、6 h通過共聚焦熒光顯微鏡觀察DOX（紅色）的熒光強度，結果顯示熒光信號逐漸增強；而GO-DOX納米粒子與GES-1細胞共孵育時，DOX的熒光信號并沒有明顯的變化（圖3C） 。

2.3 GO-DOX納米粒子光熱轉換性能

不同濃度的GO-DOX分散液置于不同NIR功率照射10 min，GO-DOX分散液的溫度可上升至55 ℃ ，結果顯示GO-DOX分散液的光熱轉換率與時間、濃度及功率呈正相關（圖4A、4B）。GO-DOX分散液經過NIR多次激發后，GO-DOX分散液的溫度呈逐步上升趨勢（圖4C），主要由于GO-DOX分散液經過NIR激發后，溫度上升引起水分蒸發所致。因此，GO-DOX納米粒子可作為理想的光熱材料用于NIR激發的腫瘤光熱治療。

2.4 GO-DOX納米粒子誘導的光熱治療

將GO-DOX納米粒子與4T1細胞共孵育，共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，當NIR功率逐漸增強時，4T1細胞對GO-DOX納米粒子的攝取率逐漸增強，當NIR功率為2.0 W/cm² 時，4T1細胞中DOX的熒光強度是未經NIR處理的2倍，NIR激發能有效促進4T1細胞對GO-DOX納米粒子的攝取，見圖5A。為促進GO-DOX納米粒子對腫瘤細胞的殺傷，DOX的有效釋放是抑制腫瘤細胞生長的關鍵因素。因此，GO-DOX納米粒子浸入到體外模擬腫瘤微環境中（pH=5.5，10 mmol/L GSH，30 μmol/L H2O2）驗證其能否實現腫瘤細胞內高效釋放。將GO-DOX納米粒子浸入到體外模擬腫瘤微環境中，300 min后，大約有97.8%的DOX從GO-DOX納米粒子表面釋放，見圖5B。隨后，將不同濃度的GO-DOX納米粒子分別與4T1細胞共孵育，經過NIR激發后，4T1細胞的存活率隨著GO-DOX納米粒子濃度及NIR功率的增加而逐漸下降，見圖5C。

2.5 GO-DOX納米粒子對4T1小鼠移植瘤的抑制作用

如圖6A所示，與PBS+NIR治療組比較，DOX+NIR治療組和GO+NIR治療組腫瘤體積有明顯下降趨勢（ P lt;0.05），而GO-DOX+NIR治療組腫瘤體積下降得尤為顯著（ P lt;0.01）。說明與PBS+NIR治療相比，其余治療組均能有效抑制腫瘤生長。15 d后，處死小鼠，收集各組小鼠皮下移植瘤并拍照（圖6B）。當移植瘤小鼠經過GO-DOX+NIR（1.5 W/cm² ，10 min）聯合治療15 d后，小鼠移植瘤大小僅為316.5 mm³ （圖6C）。隨后，收集各治療組小鼠腫瘤組織做病理切片；HE染色結果顯示，經過GO-DOX+NIR聯合治療后，腫瘤組織中大量的腫瘤細胞發生核破裂、核溶解、核固縮等；且TUNEL結果顯示，GO-DOX+NIR聯合治療組可見大量綠色熒光信號（圖6D）。然而，經過GO+NIR治療后，僅在腫瘤組織表面觀察到大量死亡的腫瘤細胞。因此，GO-DOX+NIR聯合治療能有效彌補NIR的滲透缺陷，促進對深部腫瘤細胞的殺傷，從而抑制腫瘤生長。

與PBS+NIR治療相比，GO-DOX+NIR聯合治療對正常組織沒有明顯的損傷，且GO-DOX納米粒子能有效緩解DOX對心臟組織的損傷，見圖7。

3 討論

本研究以GO為藥物載體，通過π-π堆積作用裝載DOX，成功制備了GO-DOX納米粒子。GO-DOX納米粒子不僅能淬滅DOX的熒光信號，而且通過滯留性和滲透性在腫瘤組織聚集，減少DOX在體內的非特異性分布；且腫瘤組織中高濃度GSH作為觸發器，將GO還原成rGO，引發DOX從GO-DOX納米粒子表面解離，導致DOX熒光信號恢復，從而利用DOX的熒光信號，實現對腫瘤細胞的精準定位及殺傷，進而減少對正常組織及器官的毒副作用^［9-10］ 。此外，GO-DOX納米粒子具有優越的光熱轉換性能，在NIR的激發下，將光能轉換為熱能，進而在腫瘤組織產生大量的熱量，從而誘導腫瘤細胞凋亡。且隨著溫度的升高，能有效增加腫瘤細胞的細胞膜通透性，進而增加腫瘤細胞對DOX的攝取，實現腫瘤治療的級聯效應^［11］ 。當NIR的開關關閉后，GO-DOX納米粒子懸濁液的溫度可迅速恢復至室溫，而再次照射后，GO-DOX納米粒子懸濁液的溫度又可迅速上升至55 ℃，經過4次反復操作后，在相同的條件下就能達到之前的溫度，此結果說明，NIR反復間斷照射后，不會影響GO-DOX的光熱轉換效果，具有可重復利用性能^［12］ 。然而當NIR的功率過大時，產生的熱量易對腫瘤周圍正常組織產生損傷，因此，本實驗采用100 mg/mL GO-DOX聯合1.5 W/cm² 的NIR激發，用于小鼠皮下移植瘤模型的聯合治療，結果顯示GO-DOX納米粒子結合NIR（1.5 W/cm² ，10 min ）不僅能殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長，而且能降低DOX對機體正常組織的損傷，并彌補NIR滲透不足的缺陷，有效殺傷腫瘤組織深部的腫瘤細胞。

綜上所述，本研究設計的GO-DOX納米粒子不僅具有優越的生物相容性，而且具有環境相應釋放性能，有效降低DOX對機體正常組織的損傷。因此，GO-DOX納米粒子集診斷與治療于一體的設計思路，能有效彌補各單一治療方法的缺陷，并為后期開發更智能、更靈敏與特異的納米診療平臺提供思路與理論基礎，實現腫瘤早發現、早治療的目的。

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［收稿日期］ 2023-09-02" ［編輯］ 郭 欣