基于Keap1/Nrf2信號通路探討旋覆代赭湯含藥血清對食管癌細(xì)胞的調(diào)控作用

〔摘要〕 目的 探討旋覆代赭湯含藥血清對食管癌細(xì)胞的調(diào)控作用。方法 原代培養(yǎng)人食管癌TE-1、TE-10細(xì)胞7 d后，以不同濃度的旋覆代赭湯含藥血清（0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%）和不同濃度的多西他賽（0、0.1、1、5、10、50 nmol/L）處理細(xì)胞48 h。通過CCK-8實驗篩選旋覆代赭湯含藥血清最佳給藥濃度。將TE-1細(xì)胞和TE-10細(xì)胞隨機(jī)分為模型組、空白血清組、含藥血清組和多西他賽組，分組處理后采用CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力;Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力;流式細(xì)胞術(shù)和Tunnel法檢測細(xì)胞凋亡情況;免疫熒光檢測Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）、核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 旋覆代赭湯含藥血清最佳給藥濃度為30%、多西他賽最佳給藥濃度為1 nmol/L。與模型組和空白血清組比較，含藥血清組與多西他賽組TE-1、TE-10細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力以及Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)均降低（Plt;0.05），細(xì)胞凋亡率均升高（Plt;0.05）;與多西他賽組比較，含藥血清組TE-1、TE-10細(xì)胞的增殖能力，TE-1細(xì)胞Keap1蛋白以及TE-10細(xì)胞Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)均升高（Plt;0.05），TE-1細(xì)胞的凋亡率降低（Plt;0.05）。結(jié)論 旋覆代赭湯含藥血清可能通過調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路抑制食管癌細(xì)胞的增殖。

〔關(guān)鍵詞〕 食管癌;旋覆代赭湯;多西他賽;Keap1/Nrf2通路;增殖;凋亡

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.01.005

Regulatory effects of Xuanfu Daizhe Decoction-medicated serum on esophageal cancer cells based on Keap1/Nrf2 signaling pathway

TIAN Yanpeng， CHEN Weiwei， WANG Haifeng， ZHAO Zepeng， QIAO Zhu， LIU Shanjun*

Affiliated Hospital of Jining Medical University， Jining， Shandong 272029， China

〔Abstract〕 Objective To investigate the regulatory effects of Xuanfu Daizhe Decoction （XFDZD）-medicated serum on esophageal cancer cells. Methods Human esophageal cancer TE-1 and TE-10 cells were subjected to primary culture for seven days， followed by treatment with different concentrations of XFDZD-medicated serum （0%， 5%， 10%， 15%， 20%， 25%， and 30%） and different concentrations of polyene paclitaxel （0， 0.1， 1， 5， 10， and 50 nmol/L） for 48 hours. The CCK-8 experiment was used to screen the optimal administration concentration of XFDZD-medicated serum. TE-1 and TE-10 cells were randomly divided into model， blank serum， medicated serum， and polyene paclitaxel groups. After grouping， the CCK-8 assay was used to determine cell proliferation ability. The Transwell assay was used to measure cell migration and invasion abilities. Flow cytometry and Tunnel assay were conducted to examine cell apoptosis， and immunofluorescence was used to determine the protein expression levels of Kelch-like ECH-associated protein 1 （Keap1） and nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）. Results The optimal administration concentration of XFDZD-medicated serum was 30%， and the optimal concentration of polyene paclitaxel was 1 nmol/L. Compared with the model group and the blank serum group， the proliferation， migration， invasion abilities， and the protein expression levels of Keap1 and Nrf2 of TE-1 and TE-10 cells were reduced in both the medicated serum group and the polyene paclitaxel group （Plt;0.05）， while the cell apoptosis rates were elevated （Plt;0.05）. Compared with polyene paclitaxel group， the proliferation ability of TE-1 and TE-10 cells， the protein expression of Keap1 in TE-1 cells， and the protein expressions of Keap1 and Nrf2 in TE-10 cells were elevated in the medicated serum group （Plt;0.05）， whereas the apoptosis rates of TE-1 cells was reduced （Plt;0.05）. Conclusion XFDZD-medicated serum may inhibit the proliferation of esophageal cancer cells by regulating the Keap1/Nrf2 signaling pathway.

〔Keywords〕 esophageal cancer; Xuanfu Daizhe Decoction; polyene paclitaxel; Keap1/Nrf2 pathway; proliferation; apoptosis

食管癌是臨床常見的一類惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)常常導(dǎo)致嚴(yán)重的病變后果。2020年全球癌癥調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球食管癌新發(fā)病例超過60萬例，位居惡性腫瘤的第8位;死亡病例超過54萬例，位居惡性腫瘤的第6位[1]。隨著惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年升高，腫瘤相關(guān)基因信號通路的研究成為熱點。目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1， Keap1）/核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2， Nrf2）信號通路在人體細(xì)胞抵御外源性和內(nèi)源性氧化應(yīng)激的機(jī)制具有重要地位[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2和對應(yīng)的接頭蛋白Keapl是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Keap1/Nrf2信號通路在腫瘤發(fā)生和發(fā)展以及化學(xué)治療敏感等方面發(fā)揮重要作用[3]。Nrf2缺失或激活障礙，可提高細(xì)胞對氧化應(yīng)激的敏感性，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、炎癥修復(fù)進(jìn)程的延長以及細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常等情況發(fā)生[4]。Keap1是Nrf2因子的調(diào)節(jié)因子，起分子開關(guān)作用。通常情況下Keap1處于“關(guān)閉”狀態(tài)，維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2的降解，使Nrf2持續(xù)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到氧化壓力，或受到化學(xué)刺激時，Keap1轉(zhuǎn)為“開啟”狀態(tài)，促使Nrf2從細(xì)胞質(zhì)釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與下游靶基因啟動因子結(jié)合，促使靶基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生高表達(dá)的Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白，進(jìn)而抑制氧化損傷，并對異源性致癌物質(zhì)起解毒作用，從而預(yù)防腫瘤的發(fā)生[5-6]。

旋覆代赭湯出自東漢張仲景《傷寒論·辨太陽病脈證并治下》：“傷寒發(fā)汗，若吐若下，解后，心下痞硬，噫氣不除者，旋覆代赭湯主之。”該方由旋覆花、赭石、半夏、生姜、人參、炙甘草、大棗組成，具有降逆化痰、益氣和胃的作用，用于治療胃虛痰阻氣逆證[7]。前期臨床研究表明，旋覆代赭湯能通過抑制炎癥因子小鼠Toll樣受體4/核因子κB的表達(dá)，減輕食管黏膜的炎癥反應(yīng)，修復(fù)食管黏膜的損傷[8]。并且，旋覆代赭湯能明顯拮抗化學(xué)治療帶來的毒副作用，如有效降低嘔吐毒副作用[9-10]。此外，旋覆代赭湯具有抑制食管癌ECA-109細(xì)胞干性的作用，能抑制腫瘤的生長和大小[11]。本文以Keap1/Nrf2信號通路為切入點，研究旋覆代赭湯對食管癌細(xì)胞的影響，以探討其可能的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥臨床提供一定的借鑒和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1" 實驗動物

雄性SPF級7周齡SD大鼠12只，體質(zhì)量180～220 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，自由食水，每隔12 h開燈照明。本研究所設(shè)計的實驗操作均遵循實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定，并接受濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會的監(jiān)督，倫理審批號：2024-08-C023。

1.2" 主要試劑及儀器

CCK-8檢測試劑盒、DAPI染液（江西凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：KGA317、KGA215-50）;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號：AP101）;結(jié)晶紫染色液、4%組織細(xì)胞固定液、胎牛血清白蛋白V（BSA）（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1061、P1110、A8020）;Tunnel檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，批號：C1090）;Keap1一抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10503-2-AP）;Nrf2一抗（安諾倫生物科技有限公司，批號：AF0639）;Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（H+L）（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：AS007）;TE-1細(xì)胞、TE-10細(xì)胞（武漢賽普諾生命技術(shù)有限公司，批號：CL-0231、CL-0453）;多西他賽、DMSO（美國Sigma公司，批號：B20341、202302）。

NovoCyteTM流式細(xì)胞儀（杭州艾森生物有限公司，型號：NovoCyte 2060R）;全自動酶標(biāo)儀（北京六一生物科技有限公司，型號：WD-2012B）;熱恒溫培養(yǎng)箱（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，型號：DHP-9054）;顯微鏡、熒光顯微鏡（奧林巴斯光學(xué)技術(shù)公司，型號：CX41、CKX53）。

1.3" 主要試劑配制

旋覆代赭湯由旋覆花15 g、赭石12 g、姜半夏9 g、炙甘草9 g、大棗9 g、生姜6 g、黨參10 g組成，上述藥物購自濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，批號：220401、220401、220101、221001、221010、220401、221101。將上述中藥飲片置于煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材量5倍的冷水浸泡1 h，煎煮30 min后，將藥液倒出，再往藥渣中加入3倍量水，繼續(xù)煎煮20 min，將兩次煎煮后所得藥液混合濃縮成含生藥量0.729 g/mL的藥液，置冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

向20 mg多西他賽粉末中加入2.47 mL DMSO，溶解得到10 mmol/L的溶液，將其稀釋100倍得到100 μmol/L的母液，并根據(jù)需要將其進(jìn)行逐級稀釋，得到0、0.1、1、5、10、50 nmol/L共6個濃度。

1.4" 旋覆代赭湯含藥血清的制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白血清組和旋覆代赭湯含藥血清組，每組6只。依據(jù)人與動物體表面積折算方法[12]計算后，含藥血清組按照2 mL/100 g體質(zhì)量給予旋覆代赭湯藥液灌胃，每日2次，連續(xù)給藥3 d。空白血清組予等量生理鹽水灌胃。末次給藥1 h后腹主動脈取血，分離血清，經(jīng)水浴滅活、微孔膜過濾，分裝保存?zhèn)溆谩嶒炃皩⒑幯寮翱瞻籽宸謩e稀釋成0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%共7個濃度備用。

1.5" 細(xì)胞培養(yǎng)

人食管癌TE-1、TE-10細(xì)胞用含10%血清完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。用不同濃度含藥血清/空白血清（0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%）及多西他賽（0、0.1、1、5、10、50 nmol/L）處理細(xì)胞48 h，通過CCK-8實驗篩選最佳給藥濃度。

將細(xì)胞分為模型組、空白血清不同濃度組、旋覆代赭湯含藥血清不同濃度組和多西他賽不同濃度組，以篩選的最佳給藥濃度處理細(xì)胞48 h后進(jìn)行檢測，模型組不予處理。

1.6" 指標(biāo)檢測

1.6.1" CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力" 兩種細(xì)胞傳代2次后，于96孔板中進(jìn)行不同處理48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，向各孔中加入10 μL CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值。

1.6.2" 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況" 收集1×106個細(xì)胞，用PBS以1 500 r/min，4 ℃離心3 min離心半徑9 cm洗滌兩遍;取300 μL預(yù)冷的1×Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，向各孔中加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI;輕微混勻后，室溫避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6.3" Transwell檢測細(xì)胞侵襲及遷移能力" 培養(yǎng)細(xì)胞至狀態(tài)良好，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于Transwell小室上室中（侵襲使用帶基質(zhì)膠小室，遷移使用不帶膠小室），下室加入完全培養(yǎng)基。于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出小室，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫染色1 h。用棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，于顯微鏡下進(jìn)行觀察。拍照完成后，去除染色液，加入33%乙酸處理，在562 nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值。

1.6.4" Tunnel檢測細(xì)胞凋亡情況" 取處理后的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100通透5 min，每個培養(yǎng)皿中滴加足夠量配好的Tunnel檢測液，37 ℃避光孵育1.5 h，復(fù)染DAPI后封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6.5" 免疫熒光檢測Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)水平" 取處理后的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定30 min，0.5%Triton X-100通透20 min，經(jīng)5% BSA在37 ℃下封閉30 min后，分別用Keap1、Nrf2抗體在4 ℃下孵育過夜;洗滌后滴加Cy3熒光二抗，在復(fù)染DAPI后封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.7" 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件和Graph Pad Prism 8.3.0 繪圖軟件分析。計量資料服從正態(tài)分布者，數(shù)據(jù)以“x±s”表示。多組間差異比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 旋覆代赭湯含藥血清和多西他賽的濃度篩選

與陰性對照組比較，多西他賽濃度為0.1、1、5、10、50 nmol/L時，TE-1、TE-10細(xì)胞增殖能力均降低（Plt;0.05）;與陰性對照組比較，旋覆代赭湯含藥血清濃度為30%時，TE-1、TE-10細(xì)胞增殖能力降低（Plt;0.05），空白血清濃度為30%時TE-1、TE-10細(xì)胞增殖能力降低（Plt;0.05）。結(jié)合不同濃度時細(xì)胞的狀態(tài)情況，綜合分析，旋覆代赭湯濃度為30%、多西他賽濃度為1 nmol/L時效果最好。因此，多西他賽選擇1 nmol/L，空白血清和含藥血清均選擇30%的濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。詳見圖1。

2.2" 旋覆代赭湯含藥血清對食管癌細(xì)胞增殖能力的影響

與模型組和空白血清組比較，含藥血清組與多西他賽組TE-1、TE-10細(xì)胞的增殖能力均降低（Plt;0.05）;與多西他賽比較，含藥血清組TE-1、TE-10細(xì)胞的增殖能力升高（Plt;0.05）。詳見圖2。

2.3" 旋覆代赭湯含量血清對食管癌細(xì)胞凋亡情況的影響

與模型組和空白血清組比較，含藥血清組與多西他賽組TE-1、TE-10細(xì)胞凋亡率均升高（Plt;0.05）;與多西他賽組比較，含藥血清組TE-1細(xì)胞的凋亡率降低（Plt;0.05）。詳見圖3。

2.4" 旋覆代赭湯含量血清對食管癌細(xì)胞細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

與模型組比較，空白血清組TE-1細(xì)胞遷移和侵襲能力降低（Plt;0.05）、TE-10細(xì)胞遷移能力升高（Plt;0.05）;與模型組和空白血清組比較，含藥血清組與多西他賽組TE-1、TE-10細(xì)胞的遷移和侵襲能力均降低（Plt;0.05）;與多西他賽組比較，含藥血清組細(xì)胞的遷移和侵襲能力無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見圖4。

2.5" 旋覆代赭湯含藥血清對食管癌細(xì)胞凋亡情況的影響

與模型組和空白血清組比較，含藥血清組與多西他賽組TE-1、TE-10細(xì)胞凋亡率均升高（Plt;0.05）;與多西他賽組比較，含藥血清組TE-1細(xì)胞的凋亡率降低（Plt;0.05）。詳見圖5。

2.6" 旋覆代赭湯含藥血清對食管癌細(xì)胞Keap1/Nrf2通路影響

與模型組和空白血清組比較，含藥血清組和多西他賽組TE-1、TE-10細(xì)胞的Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)均降低（Plt;0.05）;與多西他賽組比較，含藥血清組TE-1細(xì)胞Keap1蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05），TE-10細(xì)胞Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)均升高（Plt;0.05）。詳見圖6。

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步和提升，食管癌的治療方式得到了改善，但食管癌的發(fā)病率和死亡率仍居高位[13]。目前，食管癌的治療措施主要為手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療等方法，但這些治療方法存在效果個體差異大，不良反應(yīng)明顯等弊端[14]。中醫(yī)藥在治療腫瘤方面發(fā)揮著重要作用，它在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、減毒增效、預(yù)防復(fù)發(fā)、提高生存質(zhì)量等方面具有獨特的優(yōu)勢[15-16]。因此，尋找治療食管癌效果好、毒副作用小的中藥值得深入研究。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，食管癌多為飲食不節(jié)、七情內(nèi)傷、久病體虛所導(dǎo)致的痰凝氣滯血瘀，而致食管窒塞不通，故在治療食管癌時應(yīng)以健脾理氣、降逆化痰、活血散結(jié)、滋陰清熱為治療原則。旋覆代赭湯為理氣劑，具有降逆化痰、益氣和胃的功效，主治胃虛痰阻氣逆證。癥見心下痞硬，噫氣不除，或見納差、呃逆、惡心，甚或嘔吐，舌苔白膩，脈緩或滑。根據(jù)中醫(yī)學(xué)異病同治理論，胃失和降、胃氣上逆者，應(yīng)用此方辨證論治均具有顯著療效，例如旋覆代赭湯在抗炎、鎮(zhèn)吐、促胃動力上療效顯著，臨床上常用于治療胃食管反流病、功能性消化不良、胃癱等疾病[7，17-19]。同時，旋覆代赭湯能減輕食管黏膜炎癥、修復(fù)損傷[8]，具有抑制食管癌的作用[11]。

多西他賽屬紫杉類，是一種抗腫瘤藥物，其作用靶標(biāo)在細(xì)胞微管，并與處于S分裂期的癌細(xì)胞中的微管蛋白異二聚體的β亞單位結(jié)合，加速微管蛋白聚合穩(wěn)定，抑制微管解聚，最終使得腫瘤細(xì)胞分裂周期的G2/M期被阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞分裂和增殖[20]。在癌癥實驗動物和癌細(xì)胞研究中可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，常被用于治療乳腺癌、肺癌、前列腺癌等癌癥的化療藥物，其能顯著抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移，延長患者的生命[21-22]。這類藥物用于治療惡性腫瘤能夠防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，延長患者的生存期，但其不良反應(yīng)明顯，嚴(yán)重?fù)p傷脾胃功能。本研究發(fā)現(xiàn)，旋覆代赭湯干預(yù)食管癌細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，凋亡率升高，同時Keap1/Nrf2信號通路中Keap1和Nrf2蛋白表達(dá)降低，據(jù)此推斷旋覆代赭湯可能通過抑制Keap1/Nrf2信號通路發(fā)揮抑制食管癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而控制食管癌進(jìn)展的作用。旋覆代赭湯含藥血清對細(xì)胞的增殖、遷移能力和侵襲能力以及Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用不及多西他賽，但旋覆代赭湯中旋覆花可消痰下氣降逆、降胃氣除嘔呃，赭石質(zhì)重沉降鎮(zhèn)逆止嘔，姜半夏辛開散結(jié)等，能改善食管癌化學(xué)治療過程中出現(xiàn)的常見不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、食欲不振等[9]，值得在臨床應(yīng)用推廣。

綜上所述，本研究證實了旋覆代赭湯通過調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路抑制食管癌細(xì)胞的增殖，為食管癌的中醫(yī)治療提供了一定的實驗依據(jù)，但具體的分子機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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〔收稿日期〕2024-07-07

〔基金項目〕濟(jì)寧市重點研發(fā)計劃項目（2023YXNS256）;濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院博士專項科研基金項目（2021-BS-020）。

〔通信作者〕*劉善軍，男，博士，主任醫(yī)師，E-mail：lsjsdjn@126.com。