新型環狀單羰姜黃素類似物的合成及其抗乳腺癌活性研究

中圖分類號 R914；R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）05-0563-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.05.10

摘要 目的 設計并合成單羰基姜黃素類似物，并考察其抗乳腺癌活性。方法 通過羥醛縮合反應獲得單羰基姜黃素類似物F1、F2 和F3，采用MTT法檢測其抗腫瘤（包括人乳腺癌細胞MCF-7 和人肺癌細胞A549）活性[以半數抑制濃度（IC50）評估]，并與姜黃素進行比較。根據生物信息學分析方法分別獲取F1、F2 和F3 作用于乳腺癌的第一核心蛋白，并進行分子對接驗證。采用細胞實驗進一步考察高、中、低濃度（16、8、4 μmol/L）的F1、F2 和F3 對MCF-7 細胞中對應第一核心蛋白以及中濃度的F1、F2 和F3 對細胞中剪切型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）表達的影響。結果 與姜黃素相比，F1、F2和F3對A549、MCF-7細胞的IC5（0 F2對A549 細胞的IC50除外）均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中F2 對MCF-7 細胞的IC50最小，為（9.67±1.27）μmol/L。生物信息學分析結果顯示，F1、F2 和F3 與其對應第一核心蛋白表皮生長因子受體（EGFR）、蛋白激酶B（AKT）、AKT的親和力指數分別為5.909 2、8.402 5 和6.486 6。高濃度的F1 可顯著降低MCF-7 細胞中EGFR蛋白磷酸化水平（P＜0.01），低、中、高濃度的F2 和高濃度的F3 均可顯著降低MCF-7 細胞中AKT蛋白磷酸化水平（P＜0.05 或P＜0.01），中濃度的F1、F2、F3 均可顯著升高MCF-7 細胞中cleaved-caspase-3 蛋白表達水平（P＜0.01）。結論 設計合成的單羰基姜黃素類似物F1、F2、F3 均具有良好的抗乳腺癌活性，其中F2 的抗乳腺癌活性更好。

關鍵詞 姜黃素；單羰基姜黃素類似物；乳腺癌；羥醛縮合反應；生物信息學；分子對接；細胞凋亡

乳腺癌是一個全球性的健康問題，也是癌癥死亡的主要原因之一[1]。當前，乳腺癌的治療方式除了早期手術切除外，化療依然是其主要治療方式[2]。然而傳統化療藥物在乳腺癌治療過程中，仍然面臨著不良反應嚴重和患者易耐藥、易復發以及中位生存率低等問題。近年來，從天然植物或者傳統中藥中尋找抗腫瘤活性單體越來越受到研究人員的關注[3]。據統計，1981－2019 年美國FDA 批準的247 種抗癌藥物中，有18 種來自天然產物，有44 種為天然產物衍生物[4]。因此，從天然植物或傳統中藥中尋找抗腫瘤活性單體對開展新藥研究意義重大。

姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種活性單體，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗衰老等藥理作用，是一種極具潛力的中藥活性單體[5]。研究發現，姜黃素可通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和新生血管形成、逆轉耐藥以及免疫調節等多種機制干預腫瘤進程[6―7]。但是姜黃素存在不穩定、生物利用度低的問題，這主要與其β-二酮結構有關。相關研究發現，通過單羰基取代不穩定的β-二酮可以獲得更穩定的單羰基姜黃素類似物[8]。早在1992 年，Markaverich 等[9]研究發現，使用環己酮來取代β-二酮的單羰基姜黃素類似物能夠顯著抑制乳腺癌MCF-7 細胞的增殖。此外，通過N-取代哌啶酮、S-取代噻喃酮來取代β-二酮的單羰基姜黃素類似物能夠進一步增強抗腫瘤活性，并顯著改善類似物的藥代動力學參數[10―11]。因此，以姜黃素為母體結構合成單羰基姜黃素類似物是改善姜黃素不穩定性的重要手段。基于此，本研究以姜黃素β-二酮為研究切入點，結合前期研究設計合成一系列新型小分子化合物，篩選其抗腫瘤活性并初步揭示其抗乳腺癌的作用機制，以期為進一步開發抗乳腺癌藥物和研究同類型單羰基姜黃素類似物提供優良的先導化合物。

1 材料

1.1 細胞株

人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549 分別由四川大學臨床醫學院及西南醫科大學附屬醫院腫瘤科提供。

1.2 主要藥品與試劑

四氫噻喃-4-酮、四氫吡喃酮、環戊酮、4-羥基-3，5-二甲基苯甲醛（批號分別為T121984、T107483、C108567、H1929182，純度≥97%）均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；冰醋酸（批號C15026336，純度99.5%）購自成都市科隆化學品有限公司；MTT（批號ST1537，純度98%）購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI 1640 培養基、胎牛血清（批號分別為6124112、BS-1101-2）均購自美國Gibco 公司；兔源蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor，EGFR）、磷酸化EGFR（p-EGFR）、剪切型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號分別為4691T、4060、4267T、3777、WL01992、8457）均購自美國CST公司。

1.3 主要儀器

8045 型液相色譜-質譜聯用儀購自日本Shimadzu 公司；Bruker AV Ⅲ 400 型核磁共振儀購自布魯克（北京）科技有限公司；i160 型CO2細胞孵箱、Synergy H1 酶標儀均購自美國Bio-Tek 公司；CKX53 型倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；5702 型低速離心機購自德國Eppendorf公司。

2 方法

2.1 單羰基姜黃素類似物的合成與表征

根據羥醛縮合反應合成單羰基姜黃素類似物。將硫酸與氯化鈉制備成的氯化氫氣體通入無水冰醋酸中，得飽和氯化氫醋酸溶液。將4-羥基-3，5-二甲基苯甲醛（3.47 mmol）分別與四氫噻喃-4-酮、四氫吡喃酮、環戊酮（1.735 mmol）溶解在飽和氯化氫醋酸溶液中，室溫下攪拌反應12 h，靜置24 h 后，過濾；濾渣用純水和無水乙醇先后洗滌3 次，洗滌物經真空干燥后，分別得到化合物F1、F2 和F3，具體合成路線見圖1。配制化合物F1、F2和F3 的氘代二甲基亞砜（DMSO）溶液，采用核磁共振儀測定其氫譜；配制化合物F1、F2、F3 的甲醇溶液，采用液相色譜-質譜聯用儀測定3 種化合物的分子量。

2.2 單羰基姜黃素類似物的抗腫瘤活性測定

采用RPMI 1640 培養基對人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549 進行培養（培養條件為5%CO2、37 ℃）。將處于對數生長期的MCF-7、A549 細胞以每孔3×103～4×103個的密度接種在96 孔板中，孵育24 h；分別加入不同濃度（3.75、7.5、15、30、60 μmol/L，濃度根據預實驗結果設置）的F1、F2、F3 和姜黃素，每個濃度平行4 個復孔；培養24 h 或48 h 后，向每個孔中加入5 mg/mL MTT試劑，采用比色法測定各孔光密度值并計算半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），以評估F1、F2、F3和姜黃素的抗腫瘤活性。IC50值越小，抗腫瘤活性越強。

2.3 生物信息學分析

采用ChemDraw 軟件分別構建化合物F1、F2 和F3的化學結構式以及SMILES 結構式，利用SwissTarget‐Prediction（http：//swisstargetprediction. ch/）、PharmMapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）數據庫分別檢索F1、F2 和F3 的靶點，并通過UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/）獲得靶點基因，去除重復項后獲得化合物F1、F2和F3的靶點信息。

利用GeneCards（https：//www. genecards. org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）和OMIM（https：//omim.org/）數據庫，以關鍵詞“breast cancer”進行檢索；在GeneCards 數據庫中，設置疾病靶點的篩選條件為相關性得分值≥2 倍中位數，去除重復項后得到乳腺癌相關靶點信息。將各化合物的靶點與乳腺癌靶點進行比對，取交集靶點，然后將交集靶點分別導入STRING 數據庫，采用Cytoscape 軟件進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并以節點度值大于2 倍中位數、中介中心性和接近中心性均大于中位數篩選各化合物的核心靶點。在PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）中下載度排名第1 位的核心蛋白（簡稱“第一核心蛋白”）的3D結構PDB格式文件，與F1、F2 和F3 分別進行分子對接，經能量最小化處理后，進行虛擬復合蛋白相互作用成像，并計算親和力指數，當親和力指數大于7.00 時，表明化合物與蛋白的結合活性較強。

2.4 細胞實驗驗證

采用高、中、低濃度（16、8、4 μmol/L，濃度根據預實驗結果設置）的F1、F2 和F3 處理MCF-7 細胞（密度為3×103～4×103個/mL）24 h，另設不加藥物處理的對照組，每個濃度平行3 個復孔。采用RIPA裂解液對MCF-7細胞進行裂解，離心后收集總蛋白，蛋白變性處理后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，以5%脫脂奶粉孵育2 h，加入AKT、EGFR、p-AKT、p-EGFR、β-actin 一抗（稀釋度分別為1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜；采用TBST 洗滌3次，加入相應二抗（稀釋度為1∶5 000）在室溫下孵育3 h。采用ECL試劑對蛋白曝光成像，采用凝膠圖像分析成像系統進行分析，以目的蛋白與磷酸化蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的磷酸化水平，以考察F1、F2 和F3 對細胞中其對應第一核心蛋白表達的影響。另外，采用F1、F2和F3（8 μmol/L，濃度根據預實驗結果設置）處理MCF-7細胞（密度為3×103～4×103個/mL）24 h，另設不加藥物處理的對照組，每個濃度平行3 個復孔，同上述方法檢測細胞中cleaved-caspase-3 的表達水平，以cleavedcaspase-3 與內參蛋白β-actin 的灰度值比值表示cleavedcaspase-3 的蛋白表達水平，以考察各化合物對凋亡下游蛋白的影響。

2.5 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析。數據以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 單羰基姜黃素類似物結構表征

F1 產率為12.2%，分子式為C23H24O3，C23H24O3[M+H] +-MS 實驗值為349.176 7，計算值為349.179 8；1HNMR（400 MHz，DMSO）δ 8.90（s，2H），7.27（s，2H），7.27（s，4H），3.02（t，4H），2.22（s，12H），推測其為2，5- 雙（（E）-4-羥基-3，5-二甲基亞芐基）環戊-1-酮。

F2 產率為25%，分子式為C23H24O3S，C23H24O3 S[M+H] +-MS 實驗值為381.149 9，計算值為381.151 9；1HNMR（400 MHz，DMSO）δ 8.83（s，2H），7.48（s，2H），7.14（s，4H），3.36（s，4H），2.20（s，12H），推測其為3，5-雙（（Z）-4-羥基-3，5-二甲基亞芐基）四氫-4H-硫吡喃-4-酮。

F3 產率為15%，分子式為C23H24O4，C23H24O4 [M+H]+-MS 實驗值為365.171 9，計算值為365.174 7；1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ 8.94（s，2H），7.52（s，2H），7.04（s，4H），4.87（s，4H），2.20（s，12H），推測其為3，5-雙（（E）-4-羥基-3，5-二甲基亞芐基）四氫-4H-吡喃-4-酮。

3.2 單羰基姜黃素類似物抗腫瘤活性測定結果

作用24、48 h 后，與姜黃素相比，F1、F2 和F3 對A549、MCF-7 細胞的IC50（F2 作用于A549 細胞24 h 的IC50除外）均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），具有一定時間依賴趨勢，且對MCF-7 細胞的抗腫瘤活性更明顯，其中F2 對MCF-7 細胞的IC50最小（作用48 h），為（9.67±1.27） μmol/L。結果見表1。

3.3 生物信息學分析結果

將F1、F2 和F3 的靶點分別與乳腺癌靶點進行比對，分別得到124、154、127 個交集靶點（圖2）。利用Cytoscape軟件建立PPI 網絡，篩選出F1、F2 和F3 治療乳腺癌的核心靶點分別有28、33、24（去除孤立靶點）個，各化合物對應的第一核心蛋白分別是EGFR、AKT、AKT。各化合物與核心靶點的PPI 網絡圖見圖3。

3.4 分子對接結果

分子對接結果顯示，F1 與EGFR 的親和力指數為5.909 2，F2 與AKT 的親和力指數為8.402 5，F3 與AKT的親和力指數為6.486 6，姜黃素與EGFR、AKT 的親和力指數為6.107 9、6.889 7。具體分子對接模擬圖見圖4。

3.5 細胞實驗驗證結果

由圖5 可知，與對照組相比，高濃度的F1 可顯著降低MCF-7 細胞中EGFR蛋白磷酸化水平（P＜0.01），低、中、高濃度的F2 和高濃度的F3 均可顯著降低MCF-7細胞中AKT 蛋白磷酸化水平（P＜0.05 或P＜0.01），中濃度的F1、F2、F3 均可顯著升高MCF-7 細胞中cleavedcaspase-3 蛋白表達水平（P＜0.01）。

4 討論

姜黃素具有良好的抗腫瘤活性，但因其存在水溶性差、生物利用度低和結構不穩定等缺點，導致其在臨床上的開發受到限制。因此，研究如何改善姜黃素的不穩定性具有重要意義。姜黃素的母核為β-二酮結構，存在酮和烯醇式兩種狀態，并于酸堿環境下呈動態平衡[12]；同時，姜黃素的化學結構主要由芳基側鏈、β-二酮、亞甲基以及不飽和碳鏈4 個活性部分構成。因此，目前采用單羰基替換β-二酮設計、合成的單羰基姜黃素類似物具有較好的穩定性[13]。本課題組前期研究發現，以4-羥基-3，5-二甲基苯基為遠端環設計的單羰基姜黃素類似物具有良好抗腫瘤活性[14]。因此，本研究以姜黃素為母體、4-羥基-3，5-二甲基苯基為遠端環、單羰基為碳鏈進一步優化合成姜黃素類似物，得到F1、F2 和F3 化合物；進一步考察這3 種化合物的抗腫瘤活性發現，相較于姜黃素，這3 種化合物對人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549 的抗腫瘤活性更強，其中F3 對A549 細胞的抗腫瘤活性最強，F2 對MCF-7 細胞的抗腫瘤活性最強，這提示F2 和F3 的體內生物利用度可能更高。

生物信息學分析對化合物的藥理作用篩選具有重要的意義，本研究篩選出F1、F2 和F3 作用于乳腺癌排名第1 位的核心靶點分別是EGFR、AKT、AKT。EGFR 主要參與調控細胞的生長、增殖和分化，其異常的高表達與惡性腫瘤的增殖、血管生成、侵襲、轉移及凋亡密切相關[15]。AKT在惡性腫瘤的發生、發展中具有重要作用，其可能機制包括促進腫瘤細胞增殖、調節自噬、影響腫瘤微環境等，因此，調控AKT活性可為臨床治療腫瘤提供途徑[16]。本研究結果顯示，F1 與EGFR蛋白的親和力指數雖然小于7.00，但高濃度F1 仍可顯著抑制MCF-7細胞中EGFR 蛋白的磷酸化。這可能是由于分子對接時，F1 未能取得與受體相互作用最有利的構象，導致親和力指數較低。F2 和F3 同為六圓環單羰基取代母核，不同的是F2 的4 號位被硫基取代，F3 的4 號位被氧原子取代，其中F2 與AKT 的親和力指數大于7.00，而F3 與AKT的親和力指數小于7.00，這可能是由于增加電子云密度或降低取代原子的電負性能夠提高藥物與AKT蛋白的結合能力。進一步的細胞驗證實驗發現，低、中、高濃度F2 和高濃度F3 均可顯著抑制MCF-7 細胞中AKT蛋白的磷酸化。caspase 家族在細胞凋亡途徑中具有重要調控作用，其中caspase-3 是多種凋亡途徑的共同下游效應部分[17]。因此，測定腫瘤細胞中活化的cleavedcaspase-3 表達水平可考察藥物對腫瘤細胞凋亡程度的影響。本研究結果顯示，F1、F2 和F3 均可顯著升高MCF-7 細胞中cleaved-caspase-3 蛋白表達水平，提示這3種化合物可能具有促進MCF-7細胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究以姜黃素為先導化合物設計合成了3 種具有環狀單羰基結構的姜黃素類似物F1、F2 和F3，且這3種化合物均具有良好的抗乳腺癌活性。

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（收稿日期：2024-07-10 修回日期：2024-12-31）

（編輯：唐曉蓮）

基金項目四川省自然科學基金項目（No.2022NSFSC0711）；南充市科技項目（市?？萍紤鹇院献鲗ｍ棧∟o.22SXQT0166）