豬小腸脫細胞基質及生物相容性評價

摘 要：本文以豬小腸為原材料，通過病毒滅活、脫細胞、脫脂等一系列工藝制備得到低免疫原性的口腔修復膜產品，按照GB/T 16886醫療器械生物學評價標準對該產品進行致熱性、急性全身毒性、細胞毒性、皮膚致敏性以及皮內反應試驗。本研究證實了豬小腸脫細胞基質具有良好的生物相容性，為之后開展大動物試驗、臨床研究及產品上市奠定了基礎。

關鍵詞：豬小腸；脫細胞基質；生物相容性

豬小腸由內至外分別由黏膜層（上皮層）、黏膜下層、固有肌層和漿膜層[1]組成。通過物理刮除可將其他三層去除，只留下黏膜下層。將小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）經過脫細胞、脫脂等化學方法處理后形成一種天然的細胞外基質，主要成分為I型和Ⅲ型膠原蛋白，同時含有透明質酸、纖連蛋白等微量物質。利用該原材料可以制備多種廣泛應用于再生修復領域的產品，如在口腔種植時起物理阻隔作用的口腔修復膜便為其中之一。

口腔修復膜作為動物源性可降解的植入性醫療器械，一方面，有著諸多優勢，例如動物組織的使用可能會比金屬等非生物來源的材料使醫療器械具有更好的性能，可降解性能無須讓患者承受二次手術取出的痛苦，但是另一方面，它們應用到人體則又會增加病毒傳播和免疫原性等方面的安全風險，因此對于動物源性醫療器械安全性的評價，需要考慮比常規醫療器械更多方面的內容。生物學評價是針對直接和人體接觸或在體內使用的材料，提供一套系統、完整的評價程序和方法，來評價材料對細胞和動物體可能的潛在有害作用，通過試驗綜合評價并預測材料在臨床使用的安全性，將風險降至最低程度。本文依據 GB/T16886 系列標準的方法從致熱性、急性全身毒性、細胞毒性、皮膚致敏性以及皮內反應五個方面對其生物相容性進行研究，為后續動物試驗、臨床研究及產品上市提供理論基礎和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

第一，供試材料與試劑。

口腔修復膜試驗樣品來自蔓華（山東）醫學科技有限公司，型號規格：OBM-A 20 mm×30 mm，生產批號：2304001；新西蘭兔、Hartley白化豚鼠購自濟南金豐實驗動物有限公司；小鼠L929成纖維細胞系，購自昆明細胞庫；小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司； 0.9%氯化鈉注射液（SC），BA22102308和棉籽油（CSO），L240W74分別購自山東華魯制藥有限公司和河北百靈威超精細材料有限公司。

第二，主要儀器設備。

東富龍科技集團股份有限公司的LYO-1型號真空冷凍干燥機；上海標隆儀器有限公司的BLST-6G智能索式提取器；上海舍巖儀器有限公司的TR-C130S臺式全溫振蕩培養箱；帝肯（上海）貿易有限公司生產的INFINITE200PRO多功能酶標儀。

1.2 試驗方法

第一，致熱性分析。

根據國標 GB/T16886.11-2021醫療器械生物學評價和《中國藥典》2020年版四部通則的1142熱原檢查法進行試驗。用0.9%氯化鈉注射液（SC）按照6 cm2/mL的比例對試驗樣品進行浸提，試驗樣品浸沒在介質中恒溫（50±2）℃，60 rpm振蕩浸提（72±2）h用于制備試驗液。對三只新西蘭兔進行基礎體溫測試，然后將制備好的試驗液按10 mL/kg的劑量經耳緣靜脈注射，注射后每隔30 min測量新西蘭兔直腸溫度并記錄，需記錄3 h內共6次數據。將每只兔子6次溫度的最高值減去基礎體溫值即為該兔子的最高升溫值，計算三只兔子的最高升溫值總和。

第二，全身毒性試驗。

按照國標GB/T16886.11-2021方法，取6 cm2的實驗樣品分別浸沒于1 mL的0.9%生理鹽水（SC）和棉籽油（CSO）中，恒溫（50±2）℃，60 rpm振蕩浸提（72±2）h用于制備試驗液，同時不含樣品的介質設置為對照組。

根據小鼠體重，注射劑量體積為50 μL/g注射 ，SC試驗液和介質對照液采用尾靜脈注射法（IV），CSO的試驗液和介質對照液采用腹腔注射法（IP）。分別在注射后0 h、4 h、24 h、48 h以及72 h記錄所有小鼠狀態和死亡情況，并統計后3個時間點小鼠體重。

第三，細胞毒性試驗。

根據國標GB/T16886.5-2017中的體外細胞毒性試驗采用MTT法，按照6 cm2/mL的比例，將試驗樣品浸沒在細胞培養液中，于（50±2）℃條件下，60 rpm振蕩浸提（72±2）h制備試驗液，同時設置陰性對照（陰性對照為聚乙烯，其余同試驗組）和介質對照（介質對照為細胞培養液，其余同試驗組），分別將樣品試驗液、陰性對照（聚乙烯）、陽性對照（10% DMSO溶液）及介質對照（細胞培養液）置于6個含L929細胞系的細胞培養板內，培養24 h后，使用光學顯微鏡觀察各組的細胞形態。然后每孔加入50 μL MTT溶液，靜置2 h后，每孔先棄去孔內液體再加入100 μL異丙醇，使用酶標儀，在570 nm波長下測定每孔吸光度（參照波長為650 nm），按照下列公式計算細胞存活率（%）。

第四，皮膚致敏試驗。

本次試驗按照國標GB/T16886.10-2017中的刺激與皮膚致敏試驗，分別用0.9%生理鹽水（SC）和棉籽油（CSO），根據每毫升對應 6 cm2的比例對試驗樣品進行浸提，于（50±2）℃條件下，60 rpm振蕩浸提（72±2）h制備試驗液。選擇健康的豚鼠先進行背部剃毛，然后在豚鼠背部剃毛部位采用皮內注射方法分別注射兩種試驗液，接著封閉并固定，用于后續刺激與皮膚致敏試驗。經過誘導期，將兩種試驗液分別浸透濾紙片，封閉并固定在豚鼠的腹部毛區用來激發試驗動物。4 h后去除濾紙片，分別在去除濾紙片的第24 h和48 h觀察并記錄所有豚鼠激發部位皮膚情況，依據Magnusson和Kligman分級標準進行紅斑和水腫等情況的描述并分級。對照組動物相同處理。

第五，皮內反應試驗。

使用健康、初成年兔開展皮內反應試驗，以評估試驗樣品在試驗條件下產生刺激反應的潛能。本試驗根據國標 GB/T16886.10-2017中的刺激與皮膚致敏試驗部分，分別用0.9%生理鹽水（SC）和棉籽油（CSO），根據每毫升對應 6 cm2的比例對試驗樣品進行浸提，于（50±2）℃條件下，60 rpm振蕩浸提（72±2）h制備試驗液，同時不含試驗樣品設為空白對照液。將試驗液及空白對照液采用皮內注射法注射于脊椎兩側，在注射后的第（24±2）h、（48±2）h以及（72±2）h，對各注射部位進行紅斑評分和水腫評分，并統計兩組皮內反應的最終記分。

統計方法為：最后一次評分結束后，分別將每只兔3個時間點的所有紅斑評分和水腫評分求和后再除以15，統計出單只試驗兔和對照兔的記分。3只試驗兔或對照兔計分求和后分別除以3得出每只試驗兔或對照兔的總平均記分。試驗樣品最終記分為試驗兔記分－空白對照兔記分。若試驗兔最終記分不大于1.0，則該試驗樣品符合要求。

2 結果與分析

2.1 致熱性

三只新西蘭兔基礎體溫分別為39.0 ℃、39.2 ℃和39.3 ℃，注射試驗液后6次的體溫測量結果見表1，最高溫度分別為39.2 ℃、39.4 ℃和39.5 ℃，因此3只新西蘭兔的最高升溫值均為0.2 ℃，均低于0.6 ℃。3只新西蘭兔的升溫總和為0.6 ℃，低于1.3 ℃。因此，觀察3 h內，試驗兔的體溫變化均在《中國藥典》的可接受范圍內，說明該產品無致熱性。

2.2 急性全身毒性

注射試驗液前（0h）和注射后24 h、48 h、72 h分別對所有動物稱重，其體重均有增加，動物體重數據見表2。在整個試驗過程中，所有試驗動物均未見異常臨床癥狀，均未死亡，均未出現體重下降gt;10%的現象。試驗結果表明，試驗小鼠注射該試驗液后沒有出現急性全身毒性反應。

2.3 細胞毒性

通過MTT比色法借助L929細胞系體外培養進行細胞毒理學風險評估。顯微鏡下觀察，經過24 h后，試驗組和陰性對照組相似，絕大部分的細胞呈正常形態，少量細胞出現圓縮、貼壁疏松、無胞漿內顆粒或明顯的形態學方面改變，僅少數細胞溶解。但陽性對照組細胞幾乎完全損傷。

介質對照平均值為0.747，左、右兩列介質對照平均值與全部介質對照平均值相差為2%，符合介質對照平均值≥0.2，且左、右兩列介質對照平均值與全部介質對照平均值相差不大于15%的接受標準。24 h細胞毒性檢測結果顯示陰性對照、陽性對照和試驗組的OD值分別為0.733、0.131和0.569。經計算，三者對應的細胞存活率分別為98%、18%和76%。因此，該產品試驗液的細胞存活率為76%，符合大于70%的接受標準，無潛在的細胞毒性。

2.4 皮膚致敏

在整個試驗過程中，所有試驗動物均未出現異常癥狀，所有動物皮膚反應均未見異常表現。按照Magnusson 和Kligman 分級標準，所有試驗兔的分級均為0，且各試驗組兔激發部位皮膚沒有出現紅斑和水腫現象，沒有出現明顯的致敏反應。

因此，該產品SC 和CSO試驗液均未導致豚鼠出現皮膚致敏反應。

2.5 皮內反應

在整個試驗過程中，所有時間點的所有動物，其注射部位紅斑和水腫進行評分均為0，即均無紅斑和水腫現象發生。因此，按照計分方式計算，在整個試驗過程中，該產品 SC 和CSO 試驗液的免皮內反應最終記分全部都不大于1.0，符合要求。

結語

國標GB/T16886是衡量醫療器械安全性的基礎標準之一，對于保證醫療器械的安全性具有重要作用。經本文研究，口腔修復膜產品符合GB/T16886的相關要求，無致熱性、急性全身毒性、細胞毒性、皮膚致敏反應和皮內反應，具有良好的生物相容性，為預測在人體接觸使用過程中的潛在危害性提供理論基礎和技術支持。

參考文獻：

[1] 印遇龍，楊哲.豬腸道發育與營養調控應用的研究進展[J].飼料工業，2023，44（02）.