甘孜州白玉縣馬麝源大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析

摘 要：馬麝是我國特有種，為了解野生馬麝的腸道菌群，并對其耐藥性特點進行檢測分析，本試驗采集甘孜州白玉縣野外馬麝糞便進行大腸埃希菌的分離鑒定，并獲取了16株大腸埃希菌；藥敏試驗發現，菌株對諾氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、多粘菌素B高度敏感，對頭孢唑啉、復方新諾明、呋喃妥因低度敏感、對青霉素、氯霉素、四環素和紅霉素有耐藥性。

關鍵詞：大腸埃希菌；分離鑒定；馬麝；耐藥性分析

大腸埃希菌存在于哺乳動物的腸道中，在特定條件下可引起胃腸道感染，也可引起腸外感染，如人和動物的尿道等[1]。目前我國針對畜禽等食品動物來源的大腸埃希菌文獻豐富，但對野生動物源大腸埃希菌的相關研究卻相對較少。本研究對甘孜州白玉縣野外馬麝進行大腸埃希菌的分離鑒定、耐藥性分析等初步研究，為深入研究耐藥性及其機制和防治馬麝源大腸埃希菌病提供了一定的科學依據。

白玉縣位于四川西部，農牧業發展迅速，尤其是反芻動物的養殖業不斷擴大。然而，隨著養殖密度的增加，動物之間的疾病傳播風險和耐藥性問題也逐漸顯現，因此，對野生馬麝體內大腸埃希菌的研究，尤其是其耐藥性特征，將為生態保護和公共衛生提供重要依據。且相較于中國西北和青藏高原東北部，目前關于馬麝在青藏高原東南緣和川西北地區棲息地的研究較少[2]。本研究對馬麝糞便中的大腸埃希菌進行分離鑒定，進一步豐富了該地區馬麝源大腸埃希菌流行病學調查的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

第一，樣品來源。

2023年7月至8月從甘孜州白玉縣野外無菌采集共16份馬麝糞便樣本。

第二，主要試劑及材料。

營養肉湯液體培養基、抗生素藥敏紙片、普通肉湯瓊脂培養基、伊紅美藍培養基、革蘭氏染色試劑盒、麥康凱瓊脂培養基、細菌微量生化鑒定管、香柏油、麥氏比濁管。

第三，主要儀器設備。

高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養箱、一次性無菌90 mm塑料培養皿、電子天平、無菌超凈工作臺、顯微鏡、燒杯、試管、試管架、玻璃棒。

第四，藥敏紙片。

氯霉素、諾氟沙星、頭孢唑啉、阿米卡星、四環素、復方新諾明、呋喃妥因、慶大霉素、青霉素G、多粘菌素B、紅霉素11種藥敏紙片。

1.2 方法

第一，大腸埃希菌的分離鑒定

從采集的16份糞便樣本增菌培養后，在麥康凱培養基上純化培養，并將疑似大腸埃希菌的菌落采用革蘭氏染色法，進一步顯微鏡下檢查。初步鑒定后使用16SrRNA通用引物，對提取的細菌基因組DNA進行PCR擴增，上游引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。將PCR產物進行16S rRNA測序并與大腸埃希菌菌株進行對比。

第二，藥敏試驗。

用紙片擴散法（Kirby-Bauer，K—B）[3]對分離菌進行藥物敏感性試驗，參照美國臨床和實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標準[4]進行。判定結果參考最新版CLSI手冊中藥物敏感性標準以敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）作出判定[5]，記錄結果。

2 結果與分析

2.1 馬麝源大腸埃希菌的鑒定結果

本實驗分離到的菌落形態在麥凱瓊脂平板為圓形菌落，表面粉紅色且光滑，結合革蘭氏染色結果，初步確定分離的菌株為大腸埃希菌。

利用DNA提取試劑盒提取菌株基因組，使用通用引物對細菌基因組DNA瓊脂糖凝膠檢測，得到的產物在1 500 bp左右，與預期結果一致，經測序分析均為大腸埃希菌。

2.2 藥敏試驗

選用青霉素、頭孢唑啉、阿米卡星等12種抗菌藥物進行藥敏試驗，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。大腸埃希菌對不同抗生素的藥敏試驗結果見表1。分離得到的大腸埃希菌對諾氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、多粘菌素B高度敏感，對頭孢唑啉、復方新諾明、呋喃妥因低度敏感、對青霉素、氯霉素、四環素和紅霉素有耐藥性。

3 分析和討論

本試驗從甘孜州白玉縣野外馬麝采集的16份糞樣中分離出16株大腸埃希菌，普遍對青霉素、氯霉素、四環素和紅霉素有耐藥性，而對諾氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、多粘菌素B等較為敏感。從耐藥率來看，這16株大腸埃希菌有87.5%對青霉素G耐藥，還有氯霉素、四環素、紅霉素等耐藥率較高。在世界范圍內，幾乎所有重要類別的抗生素廣泛且頻繁地在養殖業中使用，不僅用于預防和治療疾病，還可用于促進食用動物的生長[6]。因此，對于馬麝大腸埃希菌的防治，可首選以上敏感藥物治療，但須規范應用抗菌藥物，科學選擇多種較敏感的藥物聯合或交替使用，以減少單個藥物的使用劑量或使用時間，可減緩耐藥菌株的產生[7]。因此，對不同地區馬麝中流行的大腸埃希菌的耐藥性進行了持續監測。這對甘孜州野外環境的藥物使用的健康持續發展、公共衛生都有重要現實意義。

細菌耐藥性對野生動物的健康存在潛在危害性，使其在環境領域、微生物學領域以及公共衛生領域成為國際上關注的焦點問題[8]。野生動物體內耐藥菌經動物糞便進入周圍環境中引起細菌耐藥性產生和傳播[9]。定期篩查和監測與大腸埃希菌分離株相關的抗生素的耐藥性對于降低馬麝大腸埃希菌疾病風險極為重要。從甘孜州馬麝的生存狀況來看，生產環境復雜，清潔消毒不易。在甘孜州采取生態防控的方法最適合結合當地實際，主張以預防為主、治療為輔，嚴格控制傳染源，采取綜合防控措施，確保馬麝生活環境無抗生素污染，持續檢測保護馬麝棲息地的生態環境。

參考文獻：

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