一株山羊源產氣莢膜梭菌的分離鑒定及全基因組測序分析

摘 要：本研究采集一嚴重腹瀉、血便急性死亡的山羊心包積液進行厭氧培養，通過特異性培養基篩選、革蘭氏染色鏡檢初步鑒定為產氣莢膜梭菌；采用PCR對毒素進行分析，鑒定為A型。全基因組測序顯示基因組大小為3 239 894 bp，平均G+C含量為28.23%。多位點序列分析（MLST）顯示該ST型尚未報道。共檢測到10種染色體毒力基因和87種耐藥基因亞型。泛基因組分析顯示核心基因組占55.76%，附屬基因數占19.64%，特有基因數占24.59%，在系統進化分析中與JXJA17 GCA_003350945.1株處于同一分支，同源性高。

關鍵詞：山羊；產氣莢膜梭菌；全基因組測序

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是一種革蘭陽性厭氧桿狀細菌[1]，主要引起動物壞死性腸炎、腸毒血癥，由于其產芽孢的特性，對環境具有極強的適應能力，廣泛存在于土壤、污水、飼料和糞便中，并在環境中水平傳播[1-2]。產氣莢膜梭菌菌株可分泌20種以上的毒素或酶，這些毒素和酶類能夠單獨或協同作用，破壞宿主細胞和組織正常的生理結構功能。根據其對主要毒素α、β、ε、ι、CPE 和 NetB 的產生能力差異，分為7種毒素型（A～G），其中A型是主要流行毒素型[3-4]，分布最為廣泛。本研究從死亡山羊心包積液中分離到1株A型產氣莢膜梭菌，通過全基因組測序與生物信息學分析，明確菌株與流行株的親緣關系，為產氣莢膜梭菌感染的來源和防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2023年冬季，1頭圈養山羊突然出現腹瀉而后血便的癥狀，隔離治療無好轉，2 d后死亡。剖檢可見皺胃及全部腸壁彌漫性出血，以空腸最為嚴重；心包積液約100 mL，其他臟器未見明顯異常。取心包積液立即送回實驗室進行檢測。

1.2 試驗方法

一是產氣莢膜梭菌分離。

適量濃度的心包積液離心沉淀物劃線涂布在含50%卵黃液的卵黃瓊脂培養基中，37 ℃厭氧培養 24 h。可見乳白至淡黃色并有較大渾濁帶的菌落，挑取進行純化，革蘭氏染色鏡檢。

二是分離菌株毒素分型。

產氣莢膜梭菌毒素基因引物見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 采用25 μL體系：12.5 μL 2×Taq Mix預混液，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水補至25 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。

三是全基因組測序。

按細菌 DNA 提取試劑盒說明書方法提取分離菌株基因組，并進行全基因組測序，對測序的原始數據通過Fastp進行數據統計以及質量評估，同時進行質量剪切，得到相對準確的有效數據，對毒力因子和耐藥基因進行檢索分析。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定

分離株革蘭染色鏡檢為革蘭染色陽性的大直短桿狀（圖1）。PCR電泳結果可見plc基因陽性，其他陰性（圖2），參照分型標準（圖3）[5]，判定分離菌株為A型產氣莢膜梭菌，并命名為5-1。

2.2 分離菌株基因組信息

將分離菌株進行全基因測序，分離菌株的基因組大小3 239 894 bp，平均G+C含量為28.23%，含2 849個蛋白質編碼序列、91個轉移RNA以及10個核糖體RNA。多位點序列分析（MLST）顯示該ST型尚未被報道：colA（74）、groEL（82）、sodA（1）、plc（80）、gyrB（49）、sigK（57）、pgk（3）、nadA（88）。

2.3 分離株毒力因子與耐藥基因分析

在本研究分離株共檢測到10種毒力因子：plc（編碼α毒素的磷脂酶C）、nagH、nagI、nagK、nagL、nagJ（透明質酸酶相關的毒力因子）、colA（膠原酶A）、nanI、nanH（唾液酸酶基因）、cloSI（α-clostripain基因）。耐藥基因共檢測到84種亞型，包括四環素耐藥基因tet（A）、tet（B），惡唑烷酮類耐藥基因cfr（D）、optrA，氨基糖苷類耐藥基因ant（6）-Ia，大環內酯類耐藥基因erm、msr（E）、macB，桿菌肽鋅耐藥基因bcrA、糖肽類耐藥基因van（A）、van（D）、磺胺類耐藥基因sul4、β-內酰胺類耐藥基因mecA、喹諾酮類耐藥基因patA以及編碼多肽抗性因子F的mprF基因等。

3 討論

全基因組分析可以從基因水平闡述病原菌毒力、耐藥性等表型特征。特別是核心基因組MLST分型，已成功并廣泛用于各種細菌物種的流行病學研究[6-7]。產氣莢膜梭菌MLST分型基于八個關鍵基因（colA、groEL、sodA、plc、gyrB、sigK、pgk和nadA）的組合，創建獨特的等位基因譜或序列類型，對已確定毒素型的產氣莢膜梭菌進行了二次分型，成為產氣莢膜梭菌分型的替代方法，為不同研究機構之間數據的比較提供支持，這對研究產氣莢膜梭菌的分子流行病學研究具有重要意義。

分離菌株檢測到的毒力基因特異性位于產氣莢膜梭菌染色體的保守區域，其中plc基因是組織溶血感染中最重要的毒力因子，其能夠水解細胞膜磷脂，所有產氣莢膜梭菌均可以產生。colA基因編碼微生物膠原酶（也稱為κ－毒素），可以降解膠原蛋白。膠原蛋白是膠原酶的底物，是人類和動物宿主腸道結締組織基底膜的主要成分，如被破可能會導致腸道感染和組織壞死。產氣莢膜梭菌的毒力是保持相對穩定的，但其抗生素耐藥性卻穩步增加，一些研究表明，大多數動物源性產氣莢膜梭菌菌株具有多重耐藥性。本研究中檢測到的耐藥基因中有6大類未在臨床中使用，特別是仍屬于非獸用抗生素惡唑烷酮類耐藥基因，這類耐藥基因在羊源、雞源和牛源產氣莢膜梭菌中均被檢出[8]，其來源和傳播方式需進一步探究。此外產氣莢膜梭菌的耐藥基因，可以很容易地與其他細菌物種，甚至是系統發育上遙遠的物種交換，使得耐藥性的傳播變得更加容易和復雜。因此對產氣莢膜梭菌全基因組的分析，有助于更好地控制耐藥性的傳播，保障公共衛生和動物健康的安全。

參考文獻：

[1] 吳克，馮航，王娟，等.關中奶山羊源D型產氣莢膜梭菌全基因組序列測定及其分子特征分析[J].畜牧獸醫學報.2022，53（11）：8.

[2] 吳克，馮航，王娟，等.動物源產氣莢膜梭菌的流行率與耐藥性分析[J].國外醫藥：抗生素分冊.2022，43（1）：5.

[3] 王潘龍，程佳佳，尹月，等.動物源A型產氣莢膜梭菌流行情況調查及α毒素基因分析[J].中國獸醫雜志.2023，59（7）：47-53.

[4] 羅潤波，吳丹，黃家旗，等.青藏高原地區牦牛源產氣莢膜梭菌流行病學調查及耐藥性分析[J].中國獸醫學報.2023（9）：1851-8.

[5] 任偉欣，王潘龍，秦一峰，等.海蘭褐蛋雞產氣莢膜梭菌的分離鑒定[J].黑龍江八一農墾大學學報，2022，34（01）：50-56.

[6] 羅柳，湯德元，曾智勇，等.梅花鹿感染產氣莢膜梭菌的診斷及中西醫結合治療[J].野生動物.2022：043-001.

[7] 董秀梅，李秀云，劉念，等.狼源產氣莢膜梭菌的分離鑒定及分子分型[J].中國預防獸醫學報.2022，44（8）：6.

[8] 王曉婷，喬軍，孟慶玲，等.反芻動物源產氣莢膜梭菌新疆流行株的分離鑒定及分型研究[J].中國動物傳染病學報.2019，27（6）：7.