在家畜精液冷凍保存中應(yīng)用抗氧化劑的研究進(jìn)展

摘 要：精液冷凍保存技術(shù)在畜牧養(yǎng)殖中具有不可替代的作用，它不僅提高繁殖效率、降低養(yǎng)殖成本，還為優(yōu)良種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供了重要支持。但是冷凍保存過(guò)程會(huì)出現(xiàn)冷凍損傷和氧化應(yīng)激從而影響精液質(zhì)量，因此，需要添加保護(hù)劑、抗氧化劑等外源物質(zhì)以減少冷凍保存對(duì)精子細(xì)胞的有害影響。本文對(duì)精液冷凍保存技術(shù)、精子冷凍損傷、抗氧化劑的應(yīng)用作一綜述，為精液冷凍保存技術(shù)的深入研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：家畜精液；冷凍保存；抗氧化劑

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，畜牧業(yè)正逐漸趨向規(guī)模化、集約化及高效化養(yǎng)殖，人工授精技術(shù)廣泛用于畜牧養(yǎng)殖，該技術(shù)的關(guān)鍵步驟是存有優(yōu)質(zhì)種公畜精液。在過(guò)去的七十年里，使用冷凍保存的精液進(jìn)行人工授精在畜牧業(yè)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。近些年來(lái)，在一些農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物中，使用冷凍保存的精子進(jìn)行人工授精表現(xiàn)出了很多優(yōu)勢(shì)，其相關(guān)性變得更加明顯。精液冷凍保存是一種保存種質(zhì)資源的常用方法，在牲畜優(yōu)質(zhì)種質(zhì)的傳播中起著至關(guān)重要的作用。因此，深入研究家畜的精液冷凍保存技術(shù)對(duì)于精液的保存和精子存活率具有重要的意義，對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展也具有積極的促進(jìn)作用。

1 精液冷凍保存技術(shù)

精液冷凍保存是人工育種、物種保護(hù)和人類生殖醫(yī)學(xué)的重要工具。精液冷凍保存是將按照一定比例混合于冷凍保護(hù)劑的精液保存至0 ℃以下的技術(shù)，通常是利用液氮或其他冷源將其迅速冷凍至極低溫度（-196 ℃），該過(guò)程中精子進(jìn)入休眠狀態(tài)，代謝活動(dòng)完全停止，從而實(shí)現(xiàn)精子細(xì)胞的長(zhǎng)期保存。在進(jìn)行人工授精時(shí)，通過(guò)適當(dāng)?shù)慕鈨龀绦驅(qū)⒕夯謴?fù)液態(tài)化，使精子恢復(fù)活力。冷凍保存過(guò)程會(huì)添加冷凍保護(hù)劑以減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。此外，降溫速率對(duì)冷凍效果至關(guān)重要，快速冷凍可以避免冰晶形成，減少對(duì)精子的損傷，而慢速冷凍則需要更精確的溫度控制和保護(hù)劑組合，更易對(duì)精子細(xì)胞造成損傷。雖然精液冷凍保存可以延長(zhǎng)精子細(xì)胞的儲(chǔ)存時(shí)間，但在不同的物種中，需根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的精液冷凍保護(hù)劑，并制定規(guī)范的冷凍－解凍程序以達(dá)到最佳冷凍效果。

2 精子冷凍保存損傷

2.1 氧化應(yīng)激與精子冷凍損傷

精液冷凍保存會(huì)導(dǎo)致精子質(zhì)膜的各種物理、生化和氧化損傷，導(dǎo)致精子的活力和受精能力下降，這些冷凍損傷主要導(dǎo)致精子的運(yùn)動(dòng)能力、質(zhì)膜功能和頂體完整性的喪失。氧化應(yīng)激反應(yīng)是精子冷凍損傷的重要因素之一，氧化應(yīng)激的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致精子活力和受精能力降低。細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，可確保細(xì)胞內(nèi)還原反應(yīng)和氧化反應(yīng)之間的平衡，在生理?xiàng)l件下，活性氧（ROS）是正常的細(xì)胞代謝產(chǎn)物，并作為信號(hào)介質(zhì)調(diào)節(jié)精子的產(chǎn)生、獲能和受精。然而，在非生理環(huán)境中進(jìn)行精液冷凍保存，精子細(xì)胞維持生理氧化還原平衡的能力會(huì)受損，產(chǎn)生過(guò)量的ROS，損傷精子細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、形態(tài)、DNA完整性和活力。冷凍保存過(guò)程中的氧化應(yīng)激是由細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡引起的，當(dāng)氧化劑超過(guò)抗氧化劑時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS。與新鮮精子相比，在冷卻至5 ℃和冷凍保存期間，人類、反芻動(dòng)物和犬精子中檢測(cè)到的ROS量明顯更高，冷凍－解凍精子中氧化亞氮、過(guò)氧化氫和氧自由基的含量也明顯更高。因此，冷凍保存過(guò)程應(yīng)采取相應(yīng)措施以盡量減少氧化應(yīng)激對(duì)精子造成的有害影響。

2.2 精子冷凍損傷

精子質(zhì)膜是冷凍保存過(guò)程中損傷的主要部位，質(zhì)膜損傷可分兩種：冷凍保護(hù)劑發(fā)揮作用時(shí)誘導(dǎo)發(fā)生的損傷和冷卻過(guò)程中發(fā)生的損傷。冷凍保存過(guò)程中的滲透變化使精子暴露于滲透條件的變化中，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，精子對(duì)這些滲透誘導(dǎo)的體積變化特別敏感，會(huì)造成精子膜完整性、運(yùn)動(dòng)性和頂體完整性的喪失。冷凍保存后精子運(yùn)動(dòng)性降低的主要原因是DNA斷裂和線粒體膜電位下降，線粒體通過(guò)調(diào)節(jié)氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)在ATP產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用，這對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)和受精能力極其重要。研究發(fā)現(xiàn)，精液冷凍保存會(huì)破壞公豬精子的線粒體完整性[1]。在馬中，12%的凍融精子有頂體損傷，而在豬和綿羊中分別約為30%和50%的凍融精子有頂體損傷。

此外，冷凍保存還會(huì)破壞精子的蛋白質(zhì)組，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解、磷酸化和羰基化等。例如，研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍保存過(guò)程中，公豬精子中有41種蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，這些蛋白質(zhì)與精子活力、質(zhì)膜完整性、能量代謝、獲能和精子－卵母細(xì)胞融合有關(guān)。同樣，與對(duì)公豬精子進(jìn)行的研究結(jié)果相似，公羊精子的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)51種蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生了顯著變化。與新鮮羚羊精子相比，凍融后的精子有85種蛋白質(zhì)的濃度發(fā)生了變化，這些蛋白質(zhì)主要與精子代謝途徑有關(guān)，包括線粒體能量產(chǎn)生和糖酵解。

3 精子冷凍損傷的預(yù)防

3.1 傳統(tǒng)策略

目前主要采用的方法是在進(jìn)行精液冷凍保存時(shí)添加冷凍保護(hù)劑、抗氧化劑、膜穩(wěn)定劑和其他經(jīng)典培養(yǎng)基等。在過(guò)去的幾十年中，各種冷凍保護(hù)劑和抗氧化劑的使用一直是對(duì)抗冷凍損傷的常規(guī)策略。例如，在精液稀釋液中添加茶多酚、綠原酸能夠顯著提升綿羊精子活率、活力、質(zhì)膜和頂體完整率[2]。添加維生素C可顯著提高牦牛冷凍精液精子活力、頂體完整率，并且降低了精子畸形率[3]。

3.2 新型策略

除了添加冷凍保護(hù)劑和抗氧化劑等方法，還包括一些新的方法，例如，冷凍前誘導(dǎo)的輕度亞致死應(yīng)激、冷凍前誘導(dǎo)磁場(chǎng)、納米粒子增強(qiáng)冷凍保存、通過(guò)冷凍干燥保存精子和單層離心等。冷凍前誘導(dǎo)的輕度亞致死應(yīng)激可以增加精子對(duì)冷凍損傷的抵抗力，如靜水壓、滲透壓或氧化應(yīng)激。高靜水壓力是一種亞致死環(huán)境應(yīng)激，可顯著改善冷凍公牛和公豬精液的運(yùn)動(dòng)性、活力和生育參數(shù)。精子冷凍干燥是一種簡(jiǎn)單的保存技術(shù)，是保護(hù)國(guó)內(nèi)物種生物多樣性的另一種低成本儲(chǔ)存選擇，干燥后的精子可以在4 ℃下儲(chǔ)存并在室溫下運(yùn)輸，不需要液氮，與冷凍保存的精子相比，冷凍干燥的馬精子的脂質(zhì)過(guò)氧化較低、線粒體膜電位較高。研究表明，與公豬新鮮精子相比，冷凍干燥保存的精子DNA完整率差異不顯著，而冷凍保存的豬精子與新鮮精子、冷凍干燥保存的精子之間差異顯著[4]。

4 抗氧化劑的應(yīng)用現(xiàn)狀

抗氧化劑是抵抗自由基引起的氧化應(yīng)激的主要防御因素，能夠抑制ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)于保護(hù)精子細(xì)胞免受氧化損傷至關(guān)重要。ROS在精子功能中具有雙重作用，低水平和可控水平的氧衍生物種對(duì)精子生理學(xué)非常重要，它們是正常生理過(guò)程所必需的，如獲能、頂體反應(yīng)和精子中的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，而高濃度的ROS會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生病理變化。在正常情況下，為了中和ROS的有害影響，精子和精清中擁有許多抗氧化系統(tǒng)，可以清除ROS并防止內(nèi)部細(xì)胞損傷，然而，在進(jìn)行精液冷凍保存時(shí)，正常采集的精液中含有的內(nèi)源性抗氧化劑不足以保護(hù)精子，因此，通常會(huì)在冷凍保護(hù)液中添加抗氧化物質(zhì)來(lái)保護(hù)精子免受ROS的影響，常用的抗氧化劑包括酶類抗氧化劑、非酶類抗氧化劑以及中藥提取物或單體等。為了達(dá)到最佳精液冷凍保存效果，需要研究者進(jìn)一步探索一種抗氧化劑或多種抗氧化劑組合的臨床應(yīng)用。

4.1 酶類抗氧化劑

酶類抗氧化劑也稱為天然抗氧化劑，包括過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）等，它們能夠清除過(guò)氧化物，減少氧化應(yīng)激對(duì)精子細(xì)胞的損傷。在公豬精子冷凍保護(hù)劑中添加SOD或CAT不僅可以提高精子的活力和存活率，還可以減少解凍后ROS的產(chǎn)生，從而提高解凍精子的體外受精能力。同樣，在保護(hù)劑中添加CAT和SOD也提高了公羊精子的存活率和體外受精率。總之，在保護(hù)劑中添加天然抗氧化劑可以提高冷凍精子的活力和存活率，并且同時(shí)添加多種抗氧化劑對(duì)冷凍精子的保護(hù)效果更好。

4.2 非酶類抗氧化劑

非酶類抗氧化劑也稱為合成抗氧化劑或膳食補(bǔ)充劑，包括谷胱甘肽、維生素C、維生素E、類胡蘿卜素、泛醌、硒和鋅等。在公羊精液保存稀釋液中添加維生素E和維生素C可以提高精子的存活率和質(zhì)量參數(shù)。在冷凍保護(hù)介質(zhì)中補(bǔ)充維生素E（5 mmol/L）可以增強(qiáng)解凍后精子的活力，并有助于維持正常精子癥和弱精子癥精液中精子DNA的完整性，提高輔助生殖技術(shù)周期中的受孕率。同樣，在冷凍保護(hù)劑中添加維生素C可以改善牛精子活力、頂體和膜的完整性。此外，在綿羊精液稀釋液中添加1～2 mmol/L的谷胱甘肽可以提高GPX和SOD的活性，減少自由基并提高解凍后精子的存活率。

4.3 中藥提取物或單體

植物提取物作為一種廉價(jià)的天然抗氧化劑廣泛用于精液冷凍保存過(guò)程，通過(guò)發(fā)揮抗氧化作用清除ROS，減輕氧化應(yīng)激對(duì)精子功能的有害影響。例如，白藜蘆醇、槲皮素、綠原酸、茶多酚、葛根素、姜黃素等植物提取物廣泛用于精液的冷凍保存，不僅能提升低溫條件下的精子活力，還能在一定程度上減少低溫引起的精子各種結(jié)構(gòu)和DNA損傷。

結(jié)語(yǔ)

總之，冷凍保存對(duì)促進(jìn)家畜繁殖具有重要意義。家畜精子的冷凍保存是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種試劑的調(diào)節(jié)、時(shí)間以及溫度的控制，為了實(shí)現(xiàn)更好的精液冷凍解凍，需要選擇合適的冷凍解凍程序、稀釋劑、冷凍保護(hù)劑、精子稀釋速率、冷卻速率和解凍速率。此外，還需要全面了解每個(gè)物種復(fù)雜的精子生理學(xué)，以最大限度地提高精子解凍后的恢復(fù)能力，從而提高生育能力。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江中良.LDL和多糖在豬精液冷凍保存中的作用研究[D].陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[2] 王宏利，張文倩，劉宗玲，等.茶多酚、綠原酸對(duì)綿羊精液保存的影響[J].中國(guó)畜牧雜志，2025，61（02）：212-216.

[3] 李景.不同抗氧化劑對(duì)牦牛冷凍精液精子活力的影響[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2024，27（10）：10-12.

[4] 孟祥黔.豬精子冷凍干燥保存技術(shù)建立及顯微注射受精的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.