紅發(fā)夫酵母中蝦青素含量液相檢測方法的建立

摘 要：本文旨在建立一種紅發(fā)夫酵母中蝦青素含量的高效液相檢測方法，包括樣品前處理條件及檢測條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，蝦青素含量在0.25 ～16 mg/L范圍內(nèi)，其含量與峰面積呈線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。建立了一種紅發(fā)夫酵母中蝦青素含量檢測的液相方法，為天然蝦青素的研究提供分析途徑。

關(guān)鍵詞：紅發(fā)夫酵母；蝦青素；液相檢測方法

蝦青素主要來源于化學(xué)合成和生物合成，據(jù)報道，化學(xué)合成的蝦青素約占市場的95%[1]，但在使用上，人們更加傾向于生物合成的蝦青素[2]，且化學(xué)合成的蝦青素存在生產(chǎn)周期長、合成步驟煩瑣、在過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物的缺點[3]。生物合成蝦青素的方法主要為微生物發(fā)酵[4]和雨生紅球藻培養(yǎng)[5]，其中微生物發(fā)酵工藝生產(chǎn)蝦青素具有周期短，產(chǎn)量高的優(yōu)點，目前是生產(chǎn)蝦青素的研究重點。其中利用紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素是國內(nèi)微生物發(fā)酵普遍采用的方法[6]。紅發(fā)夫酵母可利用多種碳源和氮源生產(chǎn)蝦青素，且具有易控制、細胞生長繁殖速度快的特點，可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)周期短，成本低等優(yōu)點，且其蝦青素狀態(tài)是游離態(tài)，更易于吸收[7]，故可直接作為飼料或者食品添加劑[8-9]。同時，由于蝦青素有良好的抗氧化活性，一些化妝品中也有應(yīng)用[10-11]。

蝦青素存在于紅發(fā)夫酵母的細胞內(nèi)[12]，然而紅發(fā)夫酵母的細胞壁非常致密且堅固[13]，這使得蝦青素的獲取較為困難，也對檢測的準(zhǔn)確性增加了難度。目前紅發(fā)夫酵母的破壁方法主要有有機溶劑法破壁、酶法破壁、酸熱法破壁、堿法破壁[14]，酸熱法破壁及有機溶劑法破壁后均可得到最高濃度的蝦青素，但由于有機溶劑是有毒的，存在安全隱患[15]。雖然利用有機溶劑法破壁并不適用于生產(chǎn)，但在檢測使用中可以提升檢測的效率和準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 材料

第一，主要試劑。蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（98%，阿拉丁）；色譜甲醇（百靈威）；色譜乙腈（百靈威）；無水甲醇（AR，國藥集團）；二甲基亞砜（AR，國藥集團）；N，N-二甲基甲酰胺（AR，國藥集團）

第二，儀器設(shè)備。高效液相色譜儀（型號：Waters2695，Waters）；二極管陣列檢測器（型號：Waters2996，Waters）；全波長酶標(biāo)儀（SpectraMax 190，Molecular Devices）；超聲波清洗儀（型號：SK7210HP，上海科導(dǎo)）；分析天平（型號：BS210S，賽多利斯）

1.2 方法

第一，色譜條件。色譜柱：Gemini? C18（250 mm×

4.6 mm，5 μm），Phenomenex；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μl；流動相：V甲醇：V乙腈=9：1；檢測波長：478 nm。

第二，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精確稱取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品5～10 mg，先用適量N，N-二甲基甲酰胺溶解，再用無水甲醇定容至100 ml棕色容量瓶中，配制得到50～100 mg/L的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品母液，再用無水甲醇分別稀釋成一定梯度濃度（0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L）的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45 μm膜過濾后檢測，并根據(jù)色譜峰面積及標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

第三，樣品前處理。吸取紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液1 mL，加入預(yù)熱后的DMSO超聲5 min進行破壁處理，再加入適量無水甲醇超聲10 min提取，觀察菌體顏色完全變白，即提取完全，取清液經(jīng)0.45 μm膜過濾后待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

第一，檢測波長的確定。取適量蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液利用酶標(biāo)儀進行全波長掃描，掃描結(jié)果顯示（圖1），蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液在478 nm波長處有最大吸收，因此確定蝦青素的液相檢測波長為478 nm。

第二，流動相的優(yōu)化。對蝦青素總量進行檢測，選擇流動相為一定比例的甲醇和乙腈，有報道[16]稱V甲醇：V乙腈=90：10為最佳比例，對其比例進行驗證，選擇V甲醇：V乙腈比例分別為80：20、85：15、90：10、95：5、100：0，如圖2所示，綜合考慮成本問題及峰型，確定V甲醇：V乙腈=90：10為最佳比例。

第三，流速的確定。保持其他色譜條件不變，對檢測的流速進行驗證，分別選擇0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min的流速。檢測結(jié)果顯示（圖3），流速越高，出峰時間越早，保留時間越短。當(dāng)流速為0.6、0.8 mL/min時，保留時間過長，峰型變形，不利于樣品分析；當(dāng)流速為1.0 mL/min時，峰型較好，出峰時間和保留時間適宜；當(dāng)流速為1.2 mL/min時，峰型有些變形，液相系統(tǒng)顯示柱壓較高，降低色譜柱的耐用性，同時對泵也會產(chǎn)生一定的影響。故而選擇蝦青素的液相檢測流速為1.0 mL/min。

第四，柱溫的選擇。其他色譜條件保持不變，分別在25、30、35、40 ℃柱溫條件下對蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液進行檢測，觀察色譜峰的峰型及分析效果。圖4顯示在25 ℃時，開始色譜峰的峰型較好，但隨著進樣次數(shù)的增加，色譜峰會出現(xiàn)出峰不穩(wěn)定且峰型變形的情況；30 ℃柱溫條件下，色譜峰的峰型標(biāo)準(zhǔn)，出峰的時間也很穩(wěn)定；35 ℃和40 ℃柱溫條件下，雖然峰型好，但峰面積變小，同時溫度高會導(dǎo)致能耗增加及降低色譜柱的耐用性。故而最終選擇色譜柱的柱溫為30 ℃。

2.2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將配制的梯度濃度的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液進行液相測定。以蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積（x）為橫坐標(biāo)，以蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（y）為縱坐標(biāo)，繪制蝦青素濃度峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖所示，得回歸方程為y=4.221E-06x，

R2=0.999 9。顯示蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液在（0.25 mg/L～16 mg/L）的濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

第一，DMSO添加量的選擇。對于紅發(fā)夫酵母的破壁，考慮實際操作和檢測的可行性，選擇有機溶劑破壁方法，本研究選擇DMSO作為破壁溶劑[17]。其他條件一致，選擇DMSO體積：紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液的體積分別為0：1、2.5：1、5：1、7.5：1、10：1，破壁提取后，液相檢測蝦青素含量，結(jié)果如圖6所示，隨著兩者體積比的增加，檢測的蝦青素的含量越高，當(dāng)兩者比到達5：1時，增加DMSO添加量，檢測蝦青素含量變化不大。故而選擇DMSO體積：紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液的體積為5：1時為DMSO的最佳添加量。

第二，破壁時間的確定。其他條件一致，超聲破壁時間分別設(shè)置2 min、5 min、10 min、15 min，破壁提取后，液相檢測蝦青素含量，結(jié)果如圖7所示，隨著超聲時間的增加，檢測蝦青素的含量越高，超聲時間5 min時，增加超聲時間，檢測蝦青素含量變化不大，到15 min時，檢測含量有所降低，推測可能破壁時間增加導(dǎo)致蝦青素失活。故而選擇超聲破壁時間5 min為破壁最佳時間。

第三，提取時間的確定。蝦青素液相檢測的流動相90%為甲醇，蝦青素在甲醇中的溶解度尚可，故選擇蝦青素的提取溶劑為無水甲醇。其他條件一致，超聲破壁后，加入適量甲醇進行超聲提取，時間分別設(shè)置為5 min、10 min、15 min、20 min，隨后甲醇定容，液相檢測蝦青素含量，結(jié)果如圖8所示，隨著超聲提取時間的增加，檢測蝦青素的含量越高，超聲時間為10 min時，增加超聲時間，檢測蝦青素含量變化不大，到20 min時，檢測含量有所降低，推測出可能因提取時間的增加而導(dǎo)致蝦青素失活。故而選擇超聲提取時間10 min為破壁最佳時間。

2.4 加標(biāo)回收率的檢測結(jié)果

在濃度為8.62 mg/L和3.42 mg/L的提取液中分別加入一定濃度的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度重復(fù)3次，結(jié)果如表1所示，蝦青素的加標(biāo)回收率為97.51%～103.17%，效果良好，表明檢測方法可行。

結(jié)語

本研究通過對最大吸收波長、流動相的比例、檢測流速及檢測柱溫等條件進行驗證，得到蝦青素的最佳液相檢測條件如下：檢測波長為478 nm、流動相為V甲醇：V乙腈=9：1、流速為1 ml/min、柱溫為30 ℃，在此色譜條件下，蝦青素峰型較好，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與濃度呈現(xiàn)較好的線性相關(guān)；通過對紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液前處理條件進行探究，得到前處理條件為：樣品經(jīng)DMSO（V樣品：VDMSO=1：5）破壁5 min，再利用甲醇超聲提取10 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進行檢測，蝦青素提取檢測效果達到理想水平。

天然蝦青素?zé)o論是在實際應(yīng)用效果上，還是在生物安全性能方面，都具有明顯優(yōu)于化學(xué)合成蝦青素的特點[18]，本研究建立紅發(fā)夫酵母中蝦青素的高效液相檢測方法，旨在為天然蝦青素的檢測提供可選用的方法，以期為天然蝦青素的研究作出貢獻。

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