公羊精液冷凍保存的研究進展

摘 要：隨著現代養殖逐漸從散養和農戶向規模化集約化發展，養殖場對于精液的需求量越來越大，對于精液品質的要求越來越高，對于精液的保存技術要求也同樣越來越高。在過去的幾十年里，使用凍融精液進行人工授精在國內畜牧生產中發揮了重要作用。因此，本文對精液冷凍保存技術及其原理、精液的特點、公羊的精液冷凍保存及影響因素作一綜述。

關鍵詞：公羊；精液；冷凍保存

在全球范圍內，當前人類對動物蛋白的需求不斷增長，這導致在畜牧飼養和管理方面要盡可能地高效生產。面對不斷增長的全球人口，提高動物食品生產的效率、增加羊肉生產量和可持續性至關重要，因此，提高羊的生育率對于解決這一問題至關重要。人工授精和精液冷凍保存技術對所生產羊的數量和質量有相當大的有利影響?？茖W家最初在17世紀引入了精液冷凍保存技術。精液冷凍保存技術是畜牧育種的有力工具，目前已經做出了一些努力來提高不同反芻動物的精子冷凍保存效率。因此，研究公羊的精液冷凍保存技術對于精液的保存和精子存活率具有重要的意義，對于公羊養殖業的發展也具有積極的促進作用。

1 精液冷凍保存技術

精液的冷凍保存是保持人和動物生育能力的重要生殖技術。精液冷凍保存技術指的是將經過一定條件處理的新鮮精液儲存于超低溫度環境（干冰、液氮等）下以延長精子存活時間的技術，在這一過程中，精子的代謝會幾乎完全停止并進入休眠狀態，當溫度回升時，精子又可以恢復代謝水平并具備受精能力[1]。精液冷凍保存技術的基本原理是在超低溫環境下，儲存于冷凍保護劑的精液會發生凝固形成不規則的玻璃樣固體，保持精液液態時正常的分子和離子分布，對精子細胞起到保護作用。精液冷凍保存中的結晶態會對精子造成不可逆的傷害，對細胞內的細胞器造成不可逆的機械性損傷，破壞細胞結構，但當溫度迅速降到玻璃態時可以避免結晶態對精子造成的不可逆損傷[2]。精液冷凍保存技術的應用不僅能夠保證精子的長期儲存、維持受精能力、方便精液運輸，還可以提高優秀種公畜精子的利用率，促進養殖業的經濟效益。在冷卻和冷凍階段，細胞暴露于以下壓力源：代謝解耦、能量損失、膜相變、細胞骨架失穩、自由基或活性氧（ROS）的產生，所有這些壓力源都有可能對精子造成傷害。

2 公羊精液的特點

成年公羊的睪丸重量在120～150 g之間，公羊的精液由精清和精子構成，其1次射精量可達0.2～2.4 mL，精子活力一般為50%～90%，密度約為20億～30億/mL，公羊的射精量、射精密度、精子活力等通常會受到公羊品種、采精時間、采精月份等因素的影響。新鮮的精液通常呈乳白色，精子分為頭、頸、尾3個部分，頭部為橢圓形，尾部細長，正常的精子整體結構完整、活力較強、大多呈直線運動，而異常的精子會出現中段卷曲、雙尾、線粒體鞘脫落、尾部缺失等情況[3]。

3 精液冷凍保存技術的應用

精液的冷凍保存對牲畜的生產和產品質量具有重要的積極影響，優良種公畜的精子通過使用精液冷凍保存和人工授精技術，可以為世界各地成千上萬的母畜進行授精。在不同的動物物種中，特別是在反芻動物中，已經描述了精液冷凍保存技術的各種保護劑和冷凍程序，以盡量減少冷凍保存對精子活力、形態、質膜、頂體的有害影響。精子對冷凍保存的反應在同一物種的個體雄性以及不同物種之間有所不同，一般來說，與其他物種相比，小型反芻動物的精子對冷凍保存極為敏感。此外，公羊精液的冷凍保存非常具有挑戰性，因為它含有高濃度的脂肪酶，該成分可能與冷凍保存稀釋劑的常見成分（如卵黃）相互作用。由于公羊精液的這種特殊成分，需要特別注意解凍后精子參數。

4 公羊精液的保存

4.1 短期保存

精液的短期保存包括常溫保存和低溫保存兩種方法。常溫保存常適用于精液采集后立即進行人工授精的情況，要求間隔時間比較短暫，需及時進行人工授精[4]。精子的主要營養物質來源于精清，通過糖降解和精子呼吸利用果糖和有機酸產生ATP以滿足精子活力所需能量及維持精子其他生理活動，未經稀釋的精液，在體外很快就會因為能量耗竭發生死亡。精液低溫保存是一種較簡單、保存效果相對較好的短期保存精液的方法。低溫保存需要在添加稀釋液后將精液從體溫緩慢下降到5 ℃的平衡狀態，該方法保存時間可達24～48 h，該保存方法需要公畜在采精后立即用稀釋液進行稀釋，隨后保存在0～5 ℃環境中。該方法雖然添加稀釋液，但也會對精子的存活率產生影響。

4.2 長期保存

精液的長期保存通常采用超低溫冷凍保存技術，一般包括以下幾個步驟：精液稀釋、添加冷凍保護劑、降溫凍結及解凍。在精液中添加配制好的稀釋液既能夠增加精液的容量，還能延長保存時間，稀釋液由特定的組分配制而成，其主要的作用就是為精子存活提供營養物質，維持適宜的pH值、滲透壓和電解質平衡，增強精子的抗性。添加冷凍保護劑可以保護精子在冷卻和冷凍過程中免受低溫損傷。

5 公羊精液冷凍保存技術的影響因素

5.1 精液采集

精液采集的目的是從每次射精中獲得最大量的精子細胞。在小反芻動物中，精液主要通過人工陰道（AV）或電射精（EE）方法收集。通常情況下AV采集精液是綿羊的首選方法，AV精液采集方法更簡單、更合適，產生的精液質量與自然精液相當。但是AV采集精液適用于性欲良好的公羊，并且需要事先進行AV射精訓練。然而，EE方法消除了對公羊訓練的需要，能夠快速促進射精，最重要的是，也可以收集受傷或性欲弱的優良種公羊的精子，但該方法也會存在一些缺點，違背動物福利的要求，對動物造成壓力。與EE方法相比，AV法在公羊精液采集中產生的精液量、精子濃度、精子總數、正常精子百分比和波動率略高。精液采集方法對精清的成分以及精子的體積和特征都會有影響，綿羊中AV收集的精子比EE收集的精子更能抵抗冷休克[5]。因此，在進行精液冷凍保存時應根據實際情況選擇合適的精液采集方法。

5.2 精液稀釋劑

稀釋劑是用于增加射精量和盡可能長時間保持精子繁殖能力的介質，精液稀釋劑作為提供營養物質的來源，可以保護細胞免受溫度相關的損傷，防止pH值變化，抑制細菌生長，并在保存過程中保護精子細胞。精液稀釋是用適當的稀釋劑按規定的比例進行，以確保用于授精的精液體積在每次劑量中有足夠的精子，有高生育能力而不丟失細胞。稀釋劑應具有低鹽效應、低緩沖濃度、低溫效應、良好的陽離子相互作用、較高的離子強度和化學穩定性等特點。稀釋劑成分也會影響精子質量和保持精子受精能力的有效時間。公羊常用精液的稀釋劑包括檸檬酸鹽、卵黃和葡萄糖或果糖等單糖以及基于二糖、三糖、復合多糖和甘油的各種冷凍稀釋劑。在精液稀釋時，使用甘油讓精子平衡數小時可以提高解凍后精子的運動能力和生育能力。除此之外，還會在稀釋劑中加入特定的成分，例如，使用大豆卵磷脂代替可以避免微生物污染的風險。在稀釋劑中添加海藻糖或棉子糖可提高其冷凍保護活性。

5.3 冷凍保護劑

添加冷凍保護劑是精液冷凍保存成功的關鍵因素。精子周圍的環境是冷凍保存的精子維持其功能完整性的一個關鍵因素，在進行精液冷凍保存時，必須為精子提供足夠的能量、適宜的pH值、滲透壓和離子強度條件，最大限度地減少導致精子細胞結構損傷的物理變化。在大多數物種中，精子冷凍保存液由緩沖液（Tris）、非滲透性冷凍保護劑（海藻糖、葡聚糖、乳糖）、可滲透性冷凍保護劑（甘油）、能量來源（葡萄糖）和其他添加劑（抗生素、維生素和抗氧化劑）組成。冷凍保護劑可防止溫度降低時形成冰晶，并最大限度地減少冷休克的影響，冷休克的發生最終會導致精子細胞器結構和功能改變。甘油作為一種有效的冷凍保護劑，具有細胞外效應，可以很好地保持精子功能和DNA完整性，可以防止精子冷休克，保持精子的運動能力，防止頂體酶丟失，并保持其線粒體膜完整。有研究表明，在精液稀釋劑中添加維生素、黃芩素、綠原酸、白藜蘆醇等抗氧化劑可以提高凍融后公羊精子細胞的漸進運動性和染色質完整性，提高冷凍精液的能量代謝，降低凋亡率[6]。因此，在進行公羊精液冷凍保存時可根據實際情況加入不同的抗氧化劑等保護劑。

5.4 精液解凍

解凍是凍結的逆轉過程，在這一過程中精液由固態轉化為正常的液態。冷凍保存方法和隨后的解凍都會對精子細胞的存活產生影響。精子質量在冷凍和解凍過程中會受到損害，因為精子細胞會暴露在兩個關鍵溫度區：一是在冷卻至-196 ℃期間，二是在解凍時。升溫階段（解凍）對精子的生存至關重要，與精液凍融過程中冷凍期間的初始冷卻階段一樣重要，當精子快速解凍時，它們會在短時間內暴露在濃縮的溶質和冷凍保護劑中，細胞內外平衡的恢復速度比緩慢解凍時要快。與緩慢解凍（35 ℃，12 s）相比，快速解凍（70 ℃，5 s）可提高解凍后精子的活力和膜完整性。因此，為了獲得最佳的精子細胞存活率，必須根據不同的冷凍速率調整精液解凍速率[7]。

結語

關于公羊精液的保存，由于綿羊、山羊等的品種不同，其精液的許多生理學特性不同，精液體外保存及維持活力需要的條件也不同，因此，在精液冷凍保存技術研究發展過程中，應根據實際情況采取不同的措施以增強精子抗凍能力?？傊趯嶋H生產中應建立規范的冷凍—解凍技術，努力研發更高效的冷凍保護劑，克服精液冷凍保存過程中的困難，提高凍精品質，促進畜牧業的發展。

參考文獻：

[1] 禚艷書.豬精液冷凍保存的研究[D].南京農業大學，2006.

[2] 喻宗崗，蔣雋，燕海峰，等.畜禽精液冷凍損傷保護研究進展[J].中國畜牧雜志，2019，55（02）：33-38.

[3] 袁志雄.山羊精液冷凍保存技術研究進展[J].養殖與飼料，2024，23（07）：50-55.

[4] 李玉龍.公羊冷凍精液技術的研究概況[J].現代畜牧科技，2017（11）：54+70.

[5] Marco-Jiménez F， Puchades S， Gadea J， Vicente JS， et al. Effect of semen collection method on pre- and post-thaw Guirra ram spermatozoa. Theriogenology.2005 Nov;64（8）：1756-65.

[6] 吉木斯，哈斯高娃，劉鶴潔，等.常用抗氧化劑在奶山羊精液冷凍保存中的應用[J].家畜生態學報，2024，45（08）：74-79.

[7] Saha A， Asaduzzaman M， Bari FY. Cryopreservation Techniques for Ram Sperm. Vet Med Int. 2022 Apr 30;2022：7378379.