基于內質網應激相關的類風濕性關節炎疾病基因篩選

摘要：目的" 探索類風濕性關節炎（RA）與內質網應激（ERS）相關的疾病基因特征。方法" 從基因表達數據庫（GEO）獲得RA患者和健康人群的滑膜組織基因表達矩陣進行GSEA分析；運用加權基因共表達網絡分析（WGCNA）和顯著性表達差異基因（DEGs）分析識別RA與ERS相關的關鍵模塊基因。運用不同機器學習算法，篩選與RA相關的ERS特征基因，并進行相關基因的藥物靶點預測。結果" 共鑒定出109個DEGs，GSEA富集分析揭示了與RA病理損傷相關的生物學途徑。基于WGCNA模塊分析以及SVM/LASSO算法進一步篩選得到3個ERS相關的RA核心基因-SPP1、FABP4和ADIPOQ。ROC曲線分析發現3個核心基因均具有較高的診斷價值。基因藥物表達網絡預測分析表明，多種藥物以核心靶基因SPP1、FABP4為有效靶點。結論" 內質網應激相關核心基因的篩選為RA的診斷以及相關治療靶點的開發提供了新的線索。

關鍵詞：內質網應激；機器學習；類風濕性關節炎；藥物靶點

中圖分類號：R593.22" " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.05.001

文章編號：1006-1959（2025）05-0001-08

Abstract： Objective" To explore the disease gene characteristics of rheumatoid arthritis （RA） associated with endoplasmic reticulum stress （ERS）. Methods" The gene expression matrices of synovial tissues from RA patients and healthy individuals were obtained from the gene expression database （GEO） for GSEA analysis. The weighted gene co-expression network analysis （WGCNA） and significant differentially expressed genes （DEGs） analysis were used to identify key module genes associated with RA disease and ERS. Different machine learning algorithms were used to screen genes related to ERS in rheumatoid arthritis， and gene-related target prediction analysis was performed. Results" A total of 109 DEGs were identified in this study. GSEA enrichment analysis revealed biological pathways associated with RA pathology. Based on WGCNA module analysis and further screening using SVM/LASSO algorithms， three ERS-related RA core genes-SPP1， FABP4， and ADIPOQ were identified. ROC curve analysis showed that the three core genes had high diagnostic value. Network pharmacology prediction analysis indicated that multiple drugs targeted the core target genes SPP1 and FABP4. Conclusion" The screening of core genes associated with endoplasmic reticulum stress provides new clues for the diagnosis of rheumatoid arthritis and the development of relevant therapeutic targets.

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種慢性自身免疫性疾病，主要臨床特征包括關節的炎癥、疼痛，甚至關節畸形導致功能障礙[1]。有研究表明[2]，RA受到遺傳、表觀遺傳和環境因素等多種因素的影響，涉及多種細胞及細胞組分的參與，如滑膜細胞異常增殖、大量白細胞浸潤等。現有的RA治療藥物往往伴隨著嚴重副作用，如導致患者免疫力下降、感染風險增加等，因此藥物新靶點的開發具有重要的臨床價值。內質網的主要作用是促進蛋白質的折疊和轉運，但其功能易受細胞內環境和外部刺激的影響[3]。炎癥反應會導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網中累積，引發內質網應激（endoplasmic reticulum stress， ERS）反應[4]。有研究表明[5]，RA患者Ⅱ型滑膜細胞的細胞周期出現G2/M期阻滯的現象，且細胞處于高度的內質網應激狀態。另有研究發現[6]，當內質網面臨壓力或應激時，細胞內的線粒體會釋放天冬氨酸，并且內質網應激傳感器免疫球蛋白結合蛋白（binding-immunoglobulin protein， BiP）會發生ADP-核糖基化，這些反應有助于調控內質網的大小，保持細胞的正常功能。而在RA患者關節滑膜組織中，T細胞線粒體天冬氨酸的缺乏會導致內質網形態變化和炎性介質腫瘤壞死因子（TNF）的過量產生，從而引發組織炎癥[7]。本研究利用多種生物信息學分析方法對ERS與RA之間的關聯性進行分析，并對生物標志物和治療靶點進行篩選，以期為RA的治療提供新的方向。

1資料與方法

1.1數據來源

在基因表達數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，將關鍵詞設定為“Rheumatoid arthritis”和“Homo sapiens”并進行搜索，后選擇“Expression profiling by array”。由此得到了RA滑膜組織的mRNA微陣列基因表達矩陣，即GSE1919、GSE77298基因表達數據及對應平臺文件（包括12個正常對照樣本，21個RA臨床樣本），使用R（4.2.1）將數據整合并進行一系列生物信息學分析。

1.2內質網應激相關基因集來源

內質網應激相關基因集（ERSRGs）來源于GeneCards數據庫，檢索詞為“Endoplasmic Reticulum Stress”，共檢索出10 746個ERS基因，計算這些基因相關分數的2倍中位數，并以此作為篩選條件，最終篩選出2687個基因做進一步的研究。

1.3方法

1.3.1基因集合富集分析

使用c2.cp（c2.cp.v2023.1 Hs.symbols.gmt）數據集分析GSE1919、GSE77298合并的基因表達數據，使用分子特征數據庫（MSigDB）作為參考基因集。基因集數據包含在GSEA軟件（版本4.3.2），項目顯著富集標準：P-value＜0.05。

1.3.2加權基因共表達網絡分析

使用加權基因共表達網絡分析（WGCNA）篩選與RA具有顯著相關性的核心基因集，并通過VENN對不同基因集進行重疊。

1.3.3機器學習算法篩選特征基因

使用最小絕對收縮和選擇算法（LASSO）和支持向量機遞歸特征消除（SVM-RFE）兩種機器學習方法篩選特征性差異基因。利用RFE算法從元數據隊列中篩選出最佳基因。為了識別具有最大辨別能力的基因集，使用SVM遞歸特征消除來篩選合適的特征基因。

1.3.4核心基因的靶點預測

使用藥物基因相互作用數據庫（https：//dgidb.genome.wustl.edu/）發現基因藥物作用靶點，從而探索以核心基因為靶點的潛在藥物。使用3種軟件（miRanda， miRDB， TargetScan）分析與mRNA相關的miRNA和lncRNA，并構建ceRNA網絡，以核心基因同時滿足3種軟件的預測為最終結果。

2結果

2.1差異基因mRNA的篩選和分析

多芯片數據集包括12名健康人的滑膜組織和21名RA患者滑膜組織樣本。對數據集進行主成分分析（PCA），結果表明，樣本數據集分布趨于平穩，且聚類良好（圖1A、圖1B），數據穩定性較好。為了探究滑膜組織在健康人和RA患者的差異性，差異表達分析結果表明，在兩組之間共有109個顯著性表達差異基因（|log2FC|＞0.58，P＜0.05），其中62個基因表達下調，47個基因表達上調（圖1C）。

2.2 RA基因的生物學功能和通路分析

對經R提取的基因表達矩陣作進一步分析，GSEA結果顯示，在RA患者中，基因集分別在肌肉收縮、適應性免疫系統、淋巴細胞和非淋巴細胞之間的免疫互作、促炎與促纖維化、T細胞受體信號通路、細胞因子與受體互作等通路顯著富集。這些結果表明，在免疫系統調節和炎癥等方面，RA患者的mRNA表達與正常人相比具有顯著差異，見圖2。

2.3 WGCNA篩選疾病核心基因

為尋找RA患者滑膜組織樣本相關的基因模塊，通過WGCNA對患者滑膜組織轉錄組構建基因共表達網絡，其軟閾值能力（β=16）由無標度拓撲確定（圖3A和圖3B）。將3191個基因分為4個模塊，模塊中的平均基因數量為585個（圖3C）。對每個模塊的特征值進行提取，并與患者滑膜組織進行相關性分析后，發現ME blue和ME brown兩個模塊與患者滑膜組織具有顯著相關性。特別是ME blue模塊的相關性最強（r=0.72，P=2e-06）（圖3D）。同時，使用GSE47189樣本數據作驗證分析確定2個模塊（blue模塊，brown模塊）中基因集的相關性和顯著性，其中blue模塊：Cor=0.78，P=2e-167，brown模塊：Cor=0.72，P=1.6e-67（圖3E和圖3F）。將兩個相關性較強的模塊基因與具有顯著性差異表達的基因（DEGs）、內質網應激相關基因（ERSRGs）做交集，結果顯示，共有7個核心基因被富集（圖3G）。

2.4內質網相關差異基因的篩選

為了進一步對ERS相關差異基因進行篩選，將2687個ERSRGs帶入RA疾病mRNA表達矩陣，以獲得各基因的表達量。首先通過火山圖鑒定內質網基因和差異基因的表達水平，結果顯示，共有28個顯著性表達差異基因（|log2FC|＞0.58，P＜0.05），其中19個基因表達下調，9個基因表達上調（圖4A）；并創建熱圖，以說明具體ERS相關差異基因的變化（圖4B）。

2.5核心基因的機器學習篩選

對28個差異基因使用不同算法作基因篩選。使用R（4.2.1）的glmnet包作LASSO回歸模型算法，構建懲罰函數模型，通過10倍交叉驗證，篩選出9個特征性差異基因（圖5A和圖5B）。同時，以e1071包作SVM-RFE算法篩選特征性差異基因，對重要基因排序，進行交叉驗證，過濾核心基因，研究發現，當特征基因數為18時，具有最小的分類器誤差（圖5C和圖5D）。對兩種算法過濾的特征基因重疊，共篩選出8個核心基因（圖5E），將此8個基因與經WGCNA篩選的ERSR基因做VEEN圖進一步篩選，最終富集出3個目標核心基因（SPP1，FABP4，ADIPOQ）（圖5F）。

2.6核心基因的表達水平及相關性驗證

經WGCNA與LASSO、SVM-RFE不同算法篩選得出的3個ERSRGs（FABP4，SPP1，ADIPOQ）的表達水平，結果表明，在RA患者mRNA表達矩陣中，將健康人群組（12個）與RA患者組（21個）比較，RA患者滑膜組織中，FABP4和ADIPOQ表達下調，而SPP1的表達升高（圖6A～圖6C）。構建基于差異基因集的邏輯回歸模型，并繪制了ROC曲線。三個核心基因的AUC均大于0.9（圖6D～圖6F），這表明它們與RA疾病關系密切，可作為RA的生物標志物。

2.7核心基因的治療藥物與靶點預測

為了深入了解核心基因對RA的影響，對基因藥物作用靶點以及指導mRNA合成的miRNA和lncRNA進行了預測。結果表明，WORTMANNIN、TACROLIMUS、ALTEPLASE、ASK-8007inhibitor、GENTAMICIN、CALCITONIN以SPP1基因為靶點發揮治療作用。其中，WORTMANNIN和TACROLIMUS為SPP1的免疫調節劑；而FENOFIBRATE、SPIRONOLACTONE、INSULIN、NEVIRAPINE、PLOGLITAZONE、FENOFIBRATE以ADIPOQ為靶點發揮治療作用（圖7A）。接下來構建的ceRNA調控網絡結果表明，多種miRNA和lncRNA關聯了核心目的基因SPP1、FABP4和ADIPOQ的基因表達，進而影響其生物學功能（圖7B），表明SPP1、FABP4和ADIPOQ與RA疾病的發展具有顯著相關性，且針對基因靶點藥物預測和ceRNA網絡的構建為下一步RA的治療提供了新的思路。

3討論

RA作為一種復雜的慢性自身免疫性疾病，其發病機制尚未完全明確。內質網應激作為細胞應激的一種重要形式，在多種疾病中發揮著重要作用，包括營養缺乏、病毒感染、腫瘤侵襲和慢性炎癥等[8]。然而，疾病修飾性抗風濕藥物（DMARDs）的治療周期通常較長，并會對患者的免疫系統造成影響[9]。因此，RA亟需新的治療靶點和藥物，以改善療效和減少副作用，滿足患者的治療需求[10]。

RA主要表現為關節滑膜組織的炎癥，而關節滑膜主要由滑膜成纖維細胞和巨噬細胞兩種主要細胞構成[11]。特別值得注意的是，在RA患者的關節滑膜組織中，滑膜成纖維細胞出現過度增殖的現象，這些細胞進而產生如生長因子、趨化因子、蛋白酶以及粘附分子等一系列細胞因子[12]。它們在RA的發病和進展過程中扮演著至關重要的角色，通過調控細胞間的通訊、促進炎癥反應和細胞外基質的重塑，加劇了關節的炎癥和破壞。有研究發現[13]，在RA患者的關節滑膜組織中，正常的蛋白質折疊機制受到干擾，導致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網中積累，從而引發內質網應激。通過分析RA與內質網應激相關生物標志物，可以進一步揭示RA的發病機制，為疾病臨床的預防與治療提供科學依據。

本研究中篩選得出3個與RA疾病具有密切相關性的核心ERSR基因（SPP1、FABP4、ADIPOQ）。SPP1即分泌型磷酸蛋白1，是一種對羥基磷灰石有高親和力的非膠原性骨基質糖蛋白，在關節滑膜內由滑膜成纖維細胞和軟骨細胞分泌，與炎癥反應和關節破壞有關[14]。并且有研究表明其在RA的關節滑液中高表達，這符合本研究前期的生物信息學分析[15]。SPP1通過與巨噬細胞、T淋巴細胞等免疫細胞及炎癥因子如IL-1、IL-6和TNF-α的相互作用，參與炎癥反應和關節破壞的過程，加劇炎癥反應和關節破壞。此外，SPP1還與巨噬細胞和T淋巴細胞等免疫細胞的黏附和遷移有關，促進炎癥細胞的聚集和浸潤，進一步加劇關節炎癥和破壞[16]。FABP4即脂肪酸結合蛋白4，主要在脂肪組織和免疫系統的巨噬細胞中表達，對于脂質代謝和炎癥反應的調控具有關鍵作用。盡管先前的研究已經證實RA患者的血清FABP4濃度顯著升高，但是RA患者滑膜組織中FABP4的表達及其生物學意義尚未得到充分闡述[17]。通過對RA患者滑膜組織mRNA表達譜的生物信息學分析。本研究發現FABP4的表達在滑膜組織中顯著下調。這可能是由于滑膜組織成分較復雜，由滑膜成纖維細胞、巨噬細胞及細胞外基質等多種成分構成。ADIPOQ即脂聯素/脂肪細胞補體相關蛋白30，是一種由脂肪細胞分泌的蛋白質，具有多種生物學功能，包括調節能量代謝、胰島素敏感性、炎癥反應等[18]。有研究發現[19]，ADIPOQ的低表達會加重組織炎癥。因此認為，ADIPOQ在RA患者的血清和關節滑液中的低水平表達可能與炎癥反應和關節破壞有關。核心靶基因的發現為RA治療靶點的探究提供了新的視角。本研究通過對基因與藥物相互作用的分析發現，以SPP1為靶點的藥物主要針對免疫系統發揮作用，而以ADIPOQ為靶點的藥物則主要具有降低血脂的功能。有研究顯示[20]，脂肪因子能夠通過多條信號傳導途徑顯著促進炎癥反應。因此，這一發現提示應關注其與RA之間的潛在聯系。

綜上所述，SPP1、FABP4與ADIPOQ與RA存在顯著相關性，并可能對RA的疾病進程產生影響。針對SPP1與FABP4的基因調控機制的深入探索，將是后續研究的重點。

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收稿日期：2024-02-02；修回日期：2024-02-26

編輯/肖婷婷

基金項目：1.山東省泰山學者青年專家計劃（編號：tsqn202103112）；2.山東省高等學校“青創科技支持計劃”（編號：2021KJ052）

作者簡介：孫大系（2000.1-），男，山東棗莊人，碩士研究生，主要從事納米生物醫學研究

通訊作者：魏鵬飛（1989.3-），男，安徽蕭縣人，博士，教授，碩士生導師，主要從事納米生物學與生物材料方向的研究