多肽診療體系的胞內原位組裝

摘 要： 多肽因具有合成簡單、室溫穩(wěn)定、免疫原性低等優(yōu)勢，近年來成為藥物與醫(yī)用材料領域廣受青睞的分子。然而，受限于其生物降解造成的半衰期短、生物利用度低等瓶頸問題，多肽從基礎研究到臨床轉化存在巨大的鴻溝，如何提高其消化酶穩(wěn)定性與生物利用度成為推動其臨床轉化的關鍵。針對該領域的挑戰(zhàn)，本綜述詳細總結了我們課題組利用胞內可控組裝技術保障多肽酶穩(wěn)定性、構筑形貌適應性遞送體系、克服遞送生理屏障的系統(tǒng)性工作，重點介紹了組裝調節(jié)過程、建立復雜組裝體系以及開發(fā)生物醫(yī)用功能材料的最新策略。同時，我們就活細胞精準原位組裝開發(fā)面臨的挑戰(zhàn)提供了前瞻性觀點，以展示其未來在創(chuàng)造生物材料方面的巨大潛力。

關鍵詞： 多肽；自組裝；刺激響應；藥物遞送；癌癥治療

中圖分類號： O636 文獻標志碼： A

生命體中生物分子的精準自組裝對于復雜生物結構的構筑與功能至關重要。基于非共價相互作用構筑超分子組裝體系對于發(fā)展人工組裝材料起到關鍵作用[1-3]。截至目前，組裝納米結構能以有機小分子、無機物、聚合物和生物分子為原料制備而成，并通過自下而上的策略展現多種形貌和功能。從溶液介質延伸到活細胞中進行精確控制組裝已成為一種在病灶部位構筑納米結構以實現生物醫(yī)學應用的新策略[4]。通過刺激響應反應，單體分子在生命體中特定靶標位點形成復雜有序結構的過程稱為原位自組裝[5-8]。多肽因其非共價相互作用及其優(yōu)異的生物相容性，成為活細胞中原位組裝的重要構筑基元。與溶液中的組裝體系相比，活細胞中的多肽組裝受到空間、黏性介質和不確定刺激等因素的影響，因此更為復雜。盡管在復雜的生理條件下控制組裝過程存在挑戰(zhàn)，但是多肽在活細胞中的自組裝為生物醫(yī)用材料提供了更多的可能性，從而有利于解決藥物脫靶問題并提高疾病診斷與治療效果。

本文總結了活細胞中多肽原位組裝的新興研究方向，重點是調控組裝過程的新策略，建立復雜的組裝體系，并開發(fā)其在生物醫(yī)學中的應用（圖1）。我們通過引入刺激響應反應調控多肽原位組裝，合理利用外部與內部刺激并通過化學反應來調整多肽之間的非共價相互作用。為了闡明多肽原位組裝在提高診療效果方面的優(yōu)勢，我們還通過在活細胞中引入特定的組裝策略來強調原位組裝系統(tǒng)的復雜性，并進一步討論多肽原位組裝在疾病診斷和治療中的應用。最終，我們將就活細胞原位組裝開發(fā)的挑戰(zhàn)提供前瞻性的思想觀點，以展示其在未來構建生物醫(yī)用材料方面的巨大潛力。多肽原位組裝也可以在細胞外微環(huán)境中進行，本文不展開討論。

1 多肽原位組裝的調控

多肽的組裝傾向與其氨基酸序列密切相關。因此，利用刺激響應反應調控多肽序列并控制其非共價相互作用是調節(jié)活細胞中多肽原位組裝的潛在策略。許多常規(guī)化學反應（主要包括水解、氧化、還原、異構化、重排、聚合和點擊反應）可以作為多肽原位組裝的刺激響應反應[9]。值得注意的是，多肽發(fā)生化學反應的選擇性對于調節(jié)其組裝以防止內部生物成分的干擾至關重要。此外，具有生物相容性的外部與內部刺激源都可以用于操控原位組裝[10，11]。外部刺激源以光和機械力為主，而內部刺激源主要包括酶、離子和生物氧化還原劑。在生物醫(yī)藥領域，內部刺激源通常是細胞內疾病生物標志物，用于選擇性調節(jié)病理病灶的原位組裝[12，13]。

從多肽骨架或單個氨基酸殘基的側鏈中水解親水或大體積單元，是調控多肽疏水相互作用的高效策略，進而控制多肽在活細胞中的自組裝過程。一些在病灶處過表達的細胞內酶能夠選擇性地識別特定序列或殘基并催化其水解切割。例如組織蛋白酶B 和半胱天冬蛋白酶-3 可以裂解GFLG 和DEVD 序列[14，15]，而堿性磷酸酶（ALP）和芳基硫酸酯酶催化多肽骨架的酪氨酸側鏈中的磷酸鹽和硫酸根基團水解[16，17]。ALP 誘導的芳香族D 型肽自組裝代表了活細胞中多肽原位組裝領域的開創(chuàng)性工作[16]。本課題組近期報道了一種在溶酶體芳基硫酸酯酶誘導含有兩個硫酸化酪氨酸殘基水解的bola 兩親性多肽的原位組裝策略[17]。酯酶和轉移酶（如 γ-谷氨酰轉移酶）水解不利于多肽組裝的基團，可以促進其原位組裝[18，19]。酸誘導的腙鍵水解也是一種潛在的方法，當多肽通過溶酶體介導的途徑被細胞內化時，可以調整多肽的非共價相互作用[20]。此外，病理微環(huán)境中活性氧（ ROS）和谷胱甘肽（ GSH）的過表達，可裂解不穩(wěn)定的共價鍵，從而調節(jié)胞內多肽原位組裝[21]。這些共價鍵通常包含ROS 敏感的酮鍵和硼酯鍵以及GSH 敏感的二硫鍵[22，23]。將親水性亞砜/硒氧化物還原為疏水性硫醚/硒醚部分也被用于在活細胞中開發(fā)多肽的原位組裝[24]。

異構化和重排在調節(jié)蛋白質的整體構象及其分子間相互作用中起著關鍵作用，因而有助于開發(fā)刺激響應多肽的自組裝。本課題組開發(fā)了基于pH 敏感的 4-氨基-脯氨酸（Amp）酰胺鍵的順反異構化，在納米纖維和納米顆粒之間發(fā)生形貌轉變的多肽原位組裝體系（圖2）[25]。雖然xaa-Amp 酰胺鍵在中性pH 條件下采用順式構象，但降低溶液pH 將導致其定量異構化為反式構象。此外，ROS 誘導的自犧牲硼酸裂解導致絲氨酸殘基處的 O， N-酰基重排，從而使縮酚酸肽在具有高ROS 水平的癌細胞中組裝成納米纖維[26]。此外，酪氨酸可以很容易地通過酪氨酸酶交聯或聚合，從而提供一種多肽共價連接策略[27，28]。生物正交和點擊反應可以針對生命系統(tǒng)中的外部成分發(fā)生，而不受自然生化過程的干擾[29]。在生理條件下，多肽之間的點擊化學允許它們精確和有效的共價連接，從而調節(jié)肽在活細胞中的自組裝，例如王浩課題組[30] 設計并開發(fā)了基于GSH 還原后疊氮化物或炔烴基團之間的點擊反應的細胞內多肽原位組裝。

從單一刺激響應反應延伸為多個刺激調節(jié)的過程，例如刺激響應級聯反應或串聯反應，也被開發(fā)用于精確調節(jié)活細胞內多肽的原位組裝。同時，修飾半胱氨酸的N 端或其殘基的巰基使半胱氨酸和2-氰基苯并噻唑（CBT）之間發(fā)生雙縮合反應，是多肽原位聚集的常見策略（圖3）[31]。此外，楊志謀課題組[32] 證明了結合由ALP 水解和GSH 還原誘導的細胞內、外串聯反應可促進多肽在癌細胞中原位組裝成納米原纖維。王懷民課題組[33] 報道了一種用于癌細胞中多肽原位組裝的細胞內雙響應分子制動策略，其中多肽前體在溶酶體中經歷酸誘導的P―N 鍵裂解，從而激活酸性磷酸酶（ACP）誘導的細胞質水解。

由于內源性刺激的病理標志物與外源性刺激技術的不斷更新，調節(jié)活細胞中多肽原位組裝的策略得以迅速發(fā)展[34，35]，因此在過去幾年開發(fā)了多種刺激響應反應。將這些刺激響應反應與多肽之間的非共價相互作用相結合，可以建立調控活細胞中多肽原位組裝的策略。盡管多肽原位組裝的調控策略已經取得一定進展，但如何將更多的刺激反應單元引入多肽是原位組裝調控手段獲得突破的關鍵。原位組裝調控在未來的挑戰(zhàn)是需要徹底了解組裝調控和疾病病理學的機制。總體而言，調控活細胞中多肽原位組裝策略的發(fā)展，提高了各種復雜生物環(huán)境中精準構筑多肽納米結構的可能性。

2 多肽原位組裝的復雜性

自然系統(tǒng)中蛋白質的自組裝在大多數生理過程和生物功能中起著至關重要的作用。蛋白質組裝體的復雜性賦予了它們復雜的生物學功能[36]。盡管多肽在活細胞中的原位組裝取得了巨大研究進展，但其在模擬自然組裝系統(tǒng)的復雜性以改善原位形成的納米結構功能性方面仍有不足。受蛋白質聚集體的動力學和耗散性質的啟發(fā)，本課題組深入開展了活細胞中多肽的復雜原位組裝體系的開發(fā)，以滿足基于共組裝、自分類組裝和耗散組裝的不同功能要求。

共組裝涉及多種多肽組分，以形成具有不同排列方式的多肽納米結構，包括協同、隨機、正交和破壞性共組裝[37]。與多肽自組裝相比，共組裝方式能夠生成具有協同復雜性和功能的異質結構。考慮到多肽組裝與其序列密切相關，使用功能性配體修飾組裝肽通常會破壞它們的組裝傾向。因此，以一定的物質的量之比將組裝肽與其配體衍生物共組裝是構建功能性納米結構的簡單策略。通常，配體衍生物由類似于親本肽的組裝序列和功能單元組成。最近，本課題組[38，39] 闡明了多肽原位共組裝的多樣性，以制備用于疾病診斷和治療的生物醫(yī)學功能材料。此外，多肽可以通過活細胞中的種子進行模板化或加速原位組裝[40]。不同序列多肽的共組裝是整合多種單體的另一種策略，例如外消旋肽的共組裝[41]。

自分類組裝是一種正交共組裝體系，其中不同的組裝基元根據它們的選擇性相互識別形成有序的納米結構，包括自我識別（自戀型自分類）或自我歧視（社會型自分類）[42]。自分類是生物體中的常見現象，例如不同蛋白質同時形成組裝體，這種現象激發(fā)了包括多肽在內的各種人工自分類材料的發(fā)展。與獨立組裝過程相比，原位自分類體系允許在活細胞中同時形成不同形貌的組裝體，從而提供多個平臺靶向細胞信號通路并調控細胞命運。基于對多肽組裝機制的深刻理解，根據多肽單體堆積模式的差異，本課題組[43] 開發(fā)了活細胞中多肽的原位自分類體系（圖4），涉及的單體是通過二硫鍵連接的E6 結構片段與含有GSH 響應性的硒代甲硫氨酸的bola-兩親性多肽片段EVMSeO 所構成的E3C16E6 分子。GSH 還原形成E3C16SH 和EVMSe 分子，分別基于叉指和反平行堆疊相互作用自分類形成螺旋和扁平納米帶。將細胞器靶向單元引入該多肽，可同時在高爾基體和內質網周圍形成多肽納米結構。

耗散組裝通過外部能源（如光、熱、pH 等）驅動，使得組裝體能夠在動態(tài)的、生物相容的條件下保持其結構穩(wěn)定性。這種過程在特定環(huán)境下可以實現自我修復，具有更強的適應性[44]。相比之下，傳統(tǒng)的自組裝體系通常依賴靜態(tài)的熱力學驅動，在變化的環(huán)境條件下可能不穩(wěn)定。盡管建立了各種耗散組裝體系，但在活細胞中構建燃料驅動的化學反應循環(huán)仍然具有挑戰(zhàn)性，這主要由于反應條件或試劑的生物相容性以及反應選擇性差。本課題組[45] 通過將N-甲基吡啶基與GSH 響應性的硒代甲硫氨酸引入多肽，獲得同時具有線粒體靶向和氧化還原響應性的六肽PMSeO，構筑了在活化的巨噬細胞中以GSH 為燃料的耗散組裝體系（圖5）。多肽經過氧化還原響應自組裝，并且僅在經GSH 還原后，形成的組裝體具有線粒體靶向特征。在脂多糖刺激的巨噬細胞中，還原肽組裝體與線粒體的結合促進了線粒體的ROS 對還原肽的可逆氧化，使多肽從線粒體解離以重新進入細胞質被GSH 還原，形成的亞穩(wěn)態(tài)多肽-線粒體復合物為非熱力學平衡自組裝，從而在活化的巨噬細胞中建立多肽的耗散組裝。與傳統(tǒng)組裝體系結構功能持續(xù)輸出相比，耗散組裝體系具有循環(huán)動態(tài)調控能力。由于外部能量的持續(xù)輸入，組裝體可以在時間尺度上進行重組、變化和調節(jié)，并且在不穩(wěn)定的生物環(huán)境條件下，通過持續(xù)的能量供應可維持特定結構的穩(wěn)定性，因而更易于在生物醫(yī)學領域實現有價值的應用。傳統(tǒng)的自組裝體系通常基于熱力學平衡，而耗散組裝通過外部驅動維持亞穩(wěn)態(tài)，從而能實現更為復雜和靈活的結構調控，因此填補了傳統(tǒng)自組裝體系無法動態(tài)調整和響應生理變化的空白。耗散組裝能夠將藥物遞送、生物成像、與其他治療功能集成到獨立體系中，而這種多功能集成的目標在傳統(tǒng)組裝體系中難以達成。因此，耗散組裝未來在開發(fā)多模態(tài)診療系統(tǒng)中具有一定優(yōu)勢。

科研人員在溶液中已經開發(fā)出多種復雜的多肽自組裝體系，在生理條件下重現這些體系對于在活細胞中開發(fā)多肽原位組裝至關重要。阻礙多肽自組裝體系在活細胞中重現的主要挑戰(zhàn)在于生物相容性以及組裝過程的選擇性，本課題組開發(fā)的耗散組裝體系在一定程度上克服了上述難題。我們相信溶液中的復雜組裝，如活性超分子組裝和動力學捕獲組裝將越來越多地在活細胞中被開發(fā)出來，從而有望在活細胞中原位形成生物醫(yī)用制劑。

3 多肽原位組裝的應用

原位多肽組裝體具有對多肽原位組裝復雜性的調控，同時在靶向部位精確定制納米結構的優(yōu)勢，因此其在生物醫(yī)學領域中展現出極大的潛力[46-48]。原位多肽有序組裝體通常由多肽單體或無序聚集體通過形貌轉變形成。由于多肽組裝體尺寸較長，所以在細胞內的滯留時間長，因而在大多數情況下，原位形成的多肽組裝體可以延長細胞內負載藥物的保留時間。此外，多肽的有序堆疊還可以優(yōu)化功能組分的性質，例如用于信號檢測和信號通路調節(jié)的探針或配體，熒光探針的光學特性可以因有序堆疊而得到增強[49]，增加多肽組裝體表面配體的局部密度與空間距離可以提高配體的靶向結合能力[39]。

原位形成的多肽組裝體可以通過修飾探針以進行疾病診斷。徐兵與饒江宏課題組分別開創(chuàng)性地報道了利用原位形成的多肽納米結構進行生物成像的工作。徐兵課題組[16] 合成了一種含有4-硝基-2，1，3-苯并噁二唑的熒光前體，該前體通過ALP 誘導的水解轉變?yōu)樗z化劑，從而在原位自組裝成納米纖維，利用疏水環(huán)境點亮局部富集的熒光團。饒江宏、梁高林、葉德舉以及Bulte 課題組[31，50-52] 分別開發(fā)了通過半胱氨酸和CBT 之間的雙響應點擊縮合為包括熒光成像、光聲成像、拉曼成像、正電子發(fā)射斷層掃描和磁共振成像的不同成像模式的原位探針。本課題組[49] 設計并合成了一種原位激活的多肽熒光探針，以NTR 響應的2-硝基咪唑作為熒光猝滅劑，在硝基還原酶誘導的腫瘤乏氧區(qū)域發(fā)生形貌轉變與熒光恢復（圖6）。此外，孫紅燕課題組[53] 在活細胞中開發(fā)了一種去琥珀酰化誘導多肽組裝，用于SIRT5 活性成像和線粒體功能的調節(jié)。

通過組裝肽或藥物功能化多肽原位形成的多肽納米結構具有調節(jié)內在生物過程的活性，因而可用于治療多種疾病。將靶向配體引入多肽結構使原位形成的多肽組裝體展現出優(yōu)異的細胞器靶向功能，如靶向溶酶體、線粒體、內質網和高爾基體[54-57]。細胞生存需要細胞器發(fā)揮重要功能，通過對細胞器功能的定向調控有望在活細胞中開發(fā)原位治療劑。此外，各種藥物分子可以通過共價鍵引入原位組裝多肽中，進而以不同的模式開展疾病治療，包括化療、光動力治療、光熱治療、免疫治療及其組合治療[58，59]。本課題組[60] 通過將β-半乳糖-絲氨酸殘基引入bola-兩親性序列中設計了一種糖基化肽，其中β-半乳糖同時作為靶向配體和反應基團。糖肽在與化療藥物伊立替康以及治療肽功能化序列共組裝后，得到的納米結構SgVE 在活細胞中經歷了糖基化多肽的級聯靶向-水解-形貌轉變組裝，過程類似于病毒感染，以實現高效的藥物遞送和針對結腸癌的聯合化療（圖7）。

多肽原位組裝在藥物遞送等諸多領域展現出潛在應用價值。由于炎癥或細菌感染所致的病理病變組織表現出類似于腫瘤微環(huán)境的特征，因此探索原位形成的多肽組裝體以提供更有效的疾病診斷、治療新策略非常重要[61，62]。多肽原位組裝也展現了其在組織工程和疫苗開發(fā)等領域的應用[63]。徐兵課題組[64] 報道了酶響應D 型磷酸化多肽經歷ALP 誘導的去磷酸化以形成螺旋納米纖維，經胞吐作用形成類細胞外基質的細胞間納米纖維。Schneider 課題組[65] 報道了多肽水凝膠在塌陷血管處的光誘導多相轉變，以幫助縫合血管。Collier 課題組[66] 開發(fā)了一種多肽佐劑（KEYA）20Q11，其組裝成具有2 型免疫和TH2 T-細胞反應的納米纖維，以及對共組裝肽表位的應答。此外，多肽原位組裝與蛋白質結合可以用于調節(jié)細胞內生命過程。在了解病理機制的基礎上，調整多肽組裝體的功能以操控細胞命運對于發(fā)展新型治療方法具有重要意義，誘導細胞凋亡的多肽組裝體就是例證[67]。

4 總結與展望

活細胞中多肽原位自組裝將超分子化學與生物學、材料化學和醫(yī)學化學相結合，最近已成為新興的跨學科研究領域。本文簡要總結了過去幾年活細胞中多肽原位組裝所取得的研究進展。活細胞中的原位自組裝原則上是一類組裝前體在生理條件下經刺激響應發(fā)生的自組裝。因此，在活細胞中開發(fā)多肽的原位組裝對刺激響應性和生物相容性都有較高要求。前者可以通過外部或內部刺激實現，而后者既要求組裝前體的生物相容性，又要求前體發(fā)生的刺激響應反應的選擇性。同時由于生理環(huán)境復雜，多肽原位組裝的適應性及其在多模態(tài)診療、智能響應等領域的潛力仍然是值得深入探討的方向。首先，多模態(tài)診療是近年來癌癥治療領域的重要趨勢之一。傳統(tǒng)的化療或放療等治療方式，往往具有效果不佳或副作用較大等問題。多肽原位組裝體具有可調控的組裝特性，能夠在體內響應外部刺激，從而實現對特定病變區(qū)域的靶向治療。通過精巧的設計，多肽組裝體結合藥物遞送與成像技術，實現診斷和治療的高效結合[68]。其次，智能響應體系是多肽原位組裝體在生物醫(yī)藥領域應用的重要研究方向。由于多肽具有良好的生物相容性及可調控的自組裝特性，它們能夠根據生理環(huán)境的變化，精確響應并發(fā)生自組裝或解組裝[69]。通過多模態(tài)治療策略以及智能響應能力，多肽組裝體可以在體內復雜環(huán)境中及時調整結構與功能，從而能夠在提升治療效果的同時，降低毒副作用，為生物醫(yī)學的發(fā)展提供有力的支持。

盡管多肽組裝體在理論上具有巨大的應用潛力，但其在體內的適應性仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，受人體血液中蛋白質的干擾以及酶的降解等因素的影響，多肽組裝體的穩(wěn)定性和功能都有可能被改變。其次，盡管多肽本身具有較好的生物相容性，但需要更細致全面地評估其在體內的代謝過程及降解產物的生物安全性。在實際應用中，如何平衡多肽組裝體的生物降解速率與其治療效果，以及如何避免因過度降解所帶來的毒性問題都需要著重考慮。因此，未來的研究需要深入探討多肽組裝體在復雜的體內環(huán)境中的穩(wěn)定性、降解途徑及其與生物體的相互作用。通過優(yōu)化多肽的化學結構、提高其選擇性和響應性，同時結合新型的表征技術，可以更好地理解和控制多肽原位組裝體在體內的行為，進而推動其在多模態(tài)診療和智能響應等領域的應用。總之，雖然多肽原位組裝在臨床應用中仍面臨一定的挑戰(zhàn)，但其在多模態(tài)診療、智能響應以及個性化治療等方面展現出巨大的潛力，隨著技術和理論的發(fā)展，未來有望在生物醫(yī)藥領域實現更廣泛的應用。

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（責任編輯：王吉晶）

基金項目： 國家自然科學基金（52273130）