定向多孔結構殼聚糖藥物載體材料的構建

摘 要： 基于溫度變化過程對高分子構象的作用，通過調控冰晶生長過程制備了徑向孔徑呈梯度變化的殼聚糖支架材料（CS-RC）。研究表明：在低溫環境下，支架材料的外緣區域的溫度梯度差大于內核區域的溫度梯度差，通過進一步調控冰晶的生長過程，實現了殼聚糖支架內部孔隙結構呈規則的梯度分布，孔徑分布在100～140 μm。理化性能評價結果表明，CS-RC 支架具有良好的保濕性能、力學性能以及穩定的降解性能，并且孔隙率能達到88.8% 左右。此外，相對于傳統的低溫凍干殼聚糖支架材料，CS-RC 支架的載藥率顯著提高，對親水性藥物阿侖膦酸鈉的載藥率和包封率分別提高了8.4%、15.9%，對疏水性藥物利福平的載藥率和包封率分別提高了4.8%、11.5%，藥物在支架中呈現出穩定的緩釋過程和有效釋放周期。

關鍵詞： 殼聚糖；多孔支架；冷凍干燥；冰晶生長；藥物載體

中圖分類號： Q819 文獻標志碼： A

20 世紀60 年代，科學家發現利用膠囊[1， 2] 或微球[3， 4] 等載體將藥物包裹，可以實現藥物的定向輸送和控釋釋放。隨后，人們利用聚合物、脂質體等研發出了各種不同類型的藥物載體系統。21 世紀以來，隨著生物醫學技術的飛速發展，藥物載體在臨床應用方面取得了長足進步。天然高分子材料（如膠原蛋白[5]、絲素蛋白[6]和殼聚糖[7， 8] 等）因具有良好的生物相容性、可降解性和可吸收代謝性等優點，在臨床疾病治療中顯示出巨大的應用前景[9， 10]。其中，殼聚糖（Chitosan，CS） 作為天然高分子材料中的杰出代表[11， 12]，在組織工程和生物醫藥材料領域的發展被廣泛關注[13]。

殼聚糖支架材料內部多孔結構的尺寸及分布會對其載藥性能及藥物的釋放過程和有效作用周期產生重要影響[14， 15]。為了提升殼聚糖支架材料的相關性能，研究人員采用了多種方法，包括表面修飾、結構調控、復合改性等[16， 17]。Su 等[18] 以咖啡酸化學修飾后的殼聚糖為原料，制備了咖啡酸接枝殼聚糖/海藻酸鈉/納米黏土基多功能3D 打印混合支架，將其作為藥物遞送載體能夠發揮持續的藥物釋放作用。Panti?等[19] 采用超臨界流體技術制備了新型聚乙內酯-殼聚糖支架材料，增加了大孔材料的比表面積和吸附能力，并提高了熱穩定性。在溫和的操作條件（40 ℃，1.5×107 Pa） 下制備的支架材料，結構更緊湊，孔徑更窄，負載藥物吲哚美辛后，可在一周內受控釋放。張中勛等[20] 采用化學交聯法在殼聚糖中引入氧化石墨烯，制備出具有高孔隙率的多孔復合支架，為藥物負載提供了更多的結合位點，載藥性能顯著提升。除此之外，也有研究者嘗試將殼聚糖制成納米顆粒或納米纖維等形式來增加其比表面積，從而提供更多的藥物吸附位點[21， 22]。

雖然這些研究為殼聚糖基材料的載藥應用提供了一些寶貴的思路，但是往往需要引入新的化學成分，或是面臨著材料的力學性能和載藥能力不足等問題，這在一定程度上限制了殼聚糖支架作為藥物載體材料的發展。鑒于此，本文在不影響支架良好理化性能的前提下，基于溫度變化過程對高分子構象的作用，通過調控冰晶生長過程來優化殼聚糖藥物載體材料的構建，最終形成徑向孔徑呈梯度變化的定向多孔海綿支架材料。這種多孔支架材料內部類似于“核殼結構”的特征，即由一個致密的外殼和一個疏松的內核組成，以期在不采用任何交聯劑和復雜工藝的前提下，制備出具有較好載藥能力和藥物緩釋能力的藥物載體支架材料。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

CS：脫乙酰度≥95%，黏度 200 mPa·s，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸（HAc）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（NaOH）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；阿侖膦酸鈉（AL）：w=97%，上海麥克林生化科技有限公司；利福平（RFP）：w=99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O）：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸（HClO4）：分析純，江蘇強盛化工有限公司；去離子水：由Milli Q Plus 型超級純水儀制備。

LGJ-10 型冷凍干燥機（美國，Labconco 公司）；IS50 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國，Thermo-Nicolet Co 公司）；E200 型生物力學顯微鏡（日本，Nikon 公司）；CKX53 型熒光相差顯微鏡（日本，Olympus 公司）；JSM-IT100型掃描電子顯微鏡（日本，JEOL 公司）；ELF3200 型生物材料力學性能試驗機（美國，Bose 公司）；UV-2800 型紫外-可見分光光度計（上海，Unico 儀器有限公司）。

1.2 藥物載體支架材料的制備

首先，在室溫下將3.0 g 殼聚糖粉末溶于100 mL 乙酸溶液（φ=2%） 中，充分攪拌使其混合均勻，獲得分散均勻、穩定的殼聚糖膠體懸浮液。超聲除氣后，將懸浮液澆注于聚苯乙烯材質的圓柱體模具中，圓柱體上下用聚四氟乙烯材料密封，再用聚氨酯泡沫包裹柱體，然后置于?80 ℃ 冷凍24 h 以上，保持試樣各處與環境冷源的物理距離相等。緊接著將經過不同冷凍過程得到的殼聚糖固態材料移至冷凍干燥機中凍干48 h 以上，使材料中生成的固態冰晶充分升華，獲得內孔隙結構。最后將各支架材料放入w=5% 的氫氧化鈉溶液中20 min，中和殼聚糖支架材料的醋酸分子，用去離子水反復沖洗，直至材料恢復中性，再次凍干處理材料12 h，使材料內的冰晶升華，保持孔隙結構，得到的多孔結構的殼聚糖支架標記為CS-RC。

為了形成對比，本文采用傳統梯度降溫法制備支架材料，即將懸浮液澆注于24 孔板后，先置于4 ℃ 環境中6 h，后轉入0 ℃ 環境中6 h，再轉入?20 ℃ 環境中冷凍6 h，然后將其轉入?80 ℃ 冰箱過夜，最后凍干、堿浸處理后二次凍干。通過此方法所得殼聚糖支架標記為CS-GC。

本文在傳統梯度降溫制備均勻多孔殼聚糖支架材料的基礎上，還增加了孔洞不規則排列的殼聚糖支架材料作為對照，即將懸浮液澆注于24 孔板后，直接置于?80 ℃ 環境中冷凍，再凍干、堿處理后二次凍干，通過此方法得到的殼聚糖支架標記為CS-IP。 圖1 所示為3 種支架材料內部冰晶生長過程的機理圖。

1.3 測試與表征

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR） 表征

利用傅里葉變換紅外光譜儀對3 種支架的官能團信息進行分析。首先，從3 種殼聚糖支架材料中剝離出厚度約為0.5 mm 的薄片狀試樣；然后，將樣品固定在ATR 模塊上；最后， 去除背景，在500～ 4 000 cm?1 的波數范圍內獲得支架的FT-IR 譜圖。分辨率為2 cm?1， 掃描次數為16 次。

1.3.2 形貌分析

采用生物力學顯微鏡、熒光相差顯微鏡和掃描電鏡（SEM） 觀察了支架材料的微觀形貌。

測試前，利用液氮將支架樣品切成薄片狀，掃描電鏡測試還需要將樣品固定在導電樣品臺上，真空鍍金處理后，在5 kV 的加速電壓下進行檢測，并通過Image J 軟件（NIH，v1.5 Maryland，US） 處理各支架材料的SEM 圖像，分析其孔徑大小。

1.3.3 孔隙率測試

采用乙醇置換法測定CS 支架材料的孔隙率。首先將3 種CS 支架材料置于裝滿無水乙醇的比重瓶中，然后抽真空脫氣，使無水乙醇充盈于3 種支架的孔隙中，最后從比重瓶中取出殼聚糖支架材料。每種支架取5 個樣品進行5 次平行實驗，計算平均值和標準偏差。孔隙率由式（1） 計算：

Porosity =（m2 -m3 -m1／m0 -m3）×100% （1）

式中：m0 為比重瓶裝滿無水乙醇后的總質量；m1 為殼聚糖支架的原始質量；m2 為支架完全浸入無水乙醇后與比重瓶的總質量；m3 為支架從比重瓶中取出后剩余無水乙醇與比重瓶的總質量。

1.3.4 吸水率測試

采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH = 7.4） 對3 種CS 支架材料的吸水率進行測試。首先將3種殼聚糖支架材料在干燥狀態下稱重（此時質量記為m），然后置于PBS 溶液中浸泡一定時間間隔后取出，用濾紙輕輕拭去支架表面殘余的水分，緊接著在精密電子天平上稱其吸水溶脹后的質量（mw），每種支架取5 個樣品進行5 次平行實驗，計算平均值和標準偏差。吸水率由式（2） 計算：

Water absorption rate = （mw -m）=mw×100% （2）

1.3.5 力學性能測試

使用生物材料力學性能試驗機對3 種圓柱形殼聚糖支架樣品（直徑為12 mm，高度為10 mm） 進行力學性能測試，控制壓縮探頭的壓縮速率為3 mm/min，每種支架取5 個樣品進行5 次平行實驗。

1.3.6 體外降解性能測試

在室溫下（約25 ℃） 使用PBS 緩沖液（pH=7.4） 對相同形態和尺寸的3 種支架進行了降解性能研究。首先對干燥狀態下的支架材料進行稱重（此時質量記為mi），然后將支架材料浸入PBS 緩沖液（pH=7.4） 中，并在37 ℃ 下孵育一個月。在指定的時間間隔內，取出樣品并用去離子水洗滌。最后將沖洗后的支架樣品進行二次凍干再稱重（此時質量記為mf）[23]。支架的降解率由式（3） 計算：

Degradation rate =[ （mi -mf）＼]mi×100% （3）

Drug loading rate =（m（Entrapped drug）／m（Scaffold after drug loading））×100% （5）

1.3.8 藥物的體外釋放測試

首先，將分別負載了AL 和RFP 的2 種殼聚糖支架浸入5 mL PBS 中，每種支架材料平行3 組，37 ℃ 下置于培養箱中連續振蕩，在給定時間間隔內（24、48、72、96、120、144、192、240、288、336、384 h） 收集2 mL 上清液，同時加入等體積的新鮮PBS。然后，將不同時間收集的上清液通過紫外-可見分光光度計測定吸光度。最后，按照標準曲線法，通過計算樣品上清液中AL 和RFP 質量濃度獲得目標藥物的體外累積釋放率。

1.3.9 統計分析

使用 ANOVA 分析各組數據間的顯著性差異，當 Plt;0.05 時結果具有統計學意義，對于不同P 值范圍，數據圖中具體標識如下：0.01lt;Plt;0.05 記為 * ，0.001lt;Plt;0.01 記為 ** ，Plt;0.001 記為 *** 。實驗數據表示為平均值±標準差。

2 結果與討論

2.1 化學結構分析

圖2 所示為CS-GC、CS-IP 和CS-RC 支架的FTIR圖譜。由圖2 可知，3 種支架在3 500～3 000 cm?1處均顯示出一個較寬的吸收峰，對應CS 的O―H和N―H 伸縮振動峰重合而形成； 1 600 cm?1 左右的2 個吸收峰分別對應CS 的2 個酰胺特征峰，1 640 cm?1 附近為C=O（Amide Ⅰ） 的伸縮振動吸收峰；1 538 cm?1 附近為N―H（Amide Ⅱ） 的彎曲振動峰；1 404 cm?1 處對應CS 的C―N（Amide Ⅲ）伸縮振動峰； 1 151～896 cm?1 處出現的特征峰對應CS 中糖苷鍵C―O―C 不對稱拉伸振動峰。FT-IR 圖譜表明，通過調控冰晶生長過程制備的殼聚糖支架與傳統梯度降溫凍干制備的殼聚糖支架的紅外圖譜一致，結構調控后沒有對殼聚糖支架的化學組成造成影響。

2.2 形貌分析

在冰晶生長過程中，殼聚糖分子鏈發生旋轉或運動的空間位阻效應逐步變大，分子與分子間的相互作用逐步增強，這在一定程度上導致聚合物分子鏈的構象發生變化，高分子鏈由初始的隨機分布趨向更有序的構象狀態。同時，當冰晶在殼聚糖凝膠體系中生長時，冰晶在冷凍過程中會形成具有一定取向的固化空間，從而在升華后留下相應的孔隙。圖3 所示為CS-GC、CS-IP 和CS-RC 這3 種支架的形貌圖。3 種CS 支架樣品的外觀均呈淺黃色（圖3（a～c）），支架內部均呈現出多孔的三維結構，孔洞之間相互連接。其中CS-GC 支架內部呈現橢圓形孔洞，相比CS-RC 支架分布更加均一，支架的孔隙結構整體呈現出有規律的分布（圖3（d、g、j））。CS-IP 支架內部大部分是不均一的片層狀結構（圖3（e、h、k））。CS-RC 支架內部則呈現出大小不均一的孔洞，在靠近支架中心部分的孔洞排列較支架邊緣部分更加疏松，整體結構的緊密度呈梯度變化（圖3（f、i、l））。這是由于在低溫環境中，樣品被快速冷凍，在模具的作用下，殼聚糖支架內不同部位的冰晶生長進程不同，樣品的邊緣部分相較于中心部分溫度下降更快，致使其在速凍過程中形成了許多小的晶核，生長緩慢，故而形成的冰晶較小。靠近樣品的中心部分因為距離冷源位置更遠，溫度差較小，致使形成的晶核更少，冰晶更大，最后通過冷凍干燥升華冰晶，在CS-RC 支架中形成了徑向孔徑呈梯度變化的結構，在整體上近似呈現外部稠密、內部疏松的“核殼結構”，有利于其作為藥物載體材料更好地包被藥物分子。

2.3 孔隙率和孔徑

CS-GC、CS-IP 和CS-RC 支架的孔隙率和孔徑如圖4 所示。這3 種支架材料均具有較高的孔隙率（圖4（a）），其中CS-RC 支架的孔隙率能達到（88.81±0.77）%，顯著高于在?80 ℃ 低溫環境中預冷凍再凍干制備的、內部孔隙呈不規則排列的CS-IP 支架。CS-GC 支架的內部孔徑較CS-RC 支架更均一，孔徑在135 μm 左右，CS-RC支架的孔徑在100～140 μm 范圍內呈梯度變化（圖4（b～d））。結合圖3 中 CS-RC 支架的形貌分析，進一步驗證了CS-RC 支架的內部近似呈現外部稠密、內部疏松的“核殼結構”。該支架的高孔隙率主要歸因于其內部高度連通的多孔結構，且支架內部孔徑較大，從而提高了總體孔隙率。較高的孔隙率為其作為藥物載體材料提供更多負載位點奠定了基礎。

2.4 保濕性能

CS-GC、CS-IP 和CS-RC 支架在PBS 中連續浸泡了24 h 后的吸水率如圖5 所示。從圖5 可以看出，隨著時間的推移，3 種支架的吸水率都呈現上升趨勢，連續浸泡12 h 時吸水率趨于穩定，達到吸水飽和，且吸水率均保持在90% 左右，表現出良好的保濕性能。這主要歸因于殼聚糖大分子鏈上含有大量的羥基和氨基，這些親水性基團賦予其較好的吸水性。另外，在相同時間段內，CS-RC 支架的吸水率要顯著高于CS-GC 和CS-IP支架的吸水率。這可能是由于CS-RC 支架內部較大的孔洞更有利于水分子的儲存，從而具有較高的吸水率，這與前面對孔隙率的表征結果保持一致，進一步說明了經過冰晶生長調控后構建的CS-RC支架仍然保持著良好的保濕性能。

2.5 力學性能

CS-GC、CS-IP 和CS-RC 支架的應力-應變曲線、抗壓強度和楊氏模量分別如圖6（a， b， c） 所示。CSGC、CS-IP 和CS-RC 支架材料被壓縮至50% 時的抗壓強度分別為213、166、202 kPa，楊氏模量分別為383、284、363 kPa。出現差異的原因主要是由于內部結構的不同：CS-GC 支架的孔隙結構排列更加均一，在承受外力時應力分布會更均勻，從而表現出更高的抗壓強度；內部呈片層狀結構的CS-IP 支架，在力學載荷下，不均一的孔隙可能導致應力集中于某些區域，致使其力學強度降低；CS-RC 支架由于外部致密可以有效抵抗外部應力，而內部疏松結構則有利于分散應力，避免應力集中，從而提高了整體的機械應力。

2.6 體外降解性能

CS-GC、CS-IP 和CS-RC 支架在PBS 中浸泡一個月內的體外降解率如圖7 所示。3 種支架樣品在第1 周質量下降最快，均接近其自身質量的20%。隨后3 周，CS-GC 支架質量變化趨平。CS-RC 支架的體外降解率逐漸超過CS-GC 支架，之后支架體外降解率放緩。推測是在初始階段，支架材料與降解介質接觸后，在短時間內發生吸收和溶解作用，支架質量快速下降。接著，CS-RC 支架由于其邊緣部分孔徑較小，不利于降解介質的滲透和作用，減緩了材料分子結構被破環的速率，致使其在這一階段的降解率稍低于CS-GC 支架，在第2 周之后降解介質逐漸浸入支架中心部分，CS-RC 支架的中心部分孔徑較大，降解速率加快，這也與本課題組前期對支架的形貌分析結果相對應。當藥物被包裹在支架材料中時，隨著支架材料的降解會釋放出藥物，2 種支架材料均具有適宜的降解速率，這為所負載藥物的穩定性和持續性釋放提供了前提條件，從而提高藥物利用率。

2.7 載藥性能

3 種不同殼聚糖支架對親水性藥物AL 和疏水性藥物RFP 的包封率和載藥率如圖8 所示。可以看出，CSRC支架對親水性藥物AL 的包封率和載藥率分別為（54.33±0.40）%、（18.02±0.23）%，對疏水性藥物RFP 的包封率和載藥率分別為（75.04±1.36）%、（10.82±0.59）%。與各向同性、不規則層狀多孔的殼聚糖支架相比，徑向孔徑呈梯度變化的CS-RC 支架的包封率和載藥率均表現出顯著提高。尤其是相對于傳統的低溫凍干殼聚糖支架材料CS-IP， 對親水性藥物AL 的載藥率和包封率分別提高了 8.4%、15.9%，對疏水性藥物RFP 的載藥率和包封率分別提高了 4.8%、11.5%。這主要歸因于CS-RC 支架由邊緣部分到中心部分呈現致密到疏松的梯度多孔結構，通過調控冰晶生長后的支架內部孔隙分布類似于“核殼”包被結構。這種結構的外部致密層可以防止藥物分子向支架的外面擴散，從而將藥物分子限制在支架的內部，而內部疏松層可以為藥物分子提供更多的孔隙空間，藥物被包裹在支架內部，進而提高了藥物的包封率和載藥率。

2.8 體外藥物釋放

CS-GC 和CS-RC 這2 種載藥支架在15 d 內對AL 和RFP 的體外累計釋放率如圖9 所示。2 種載藥支架中的AL 和RFP 藥物釋放均呈指數趨勢，基本可以劃分為2 個階段：第1 階段為突釋階段，主要集中在前24 h內，從CS-GC 和CS-RC 這兩種支架中釋放出的AL 約占總藥量的（38.65±1.33）%、（27.73±0.88）%（圖9（a））；負載RFP 的2 種支架釋放出的RFP 約占總藥量的（75.36±1.71）%、（37.77±1.71）%（圖9（b））。隨著時間的增加，2種載藥支架的藥物釋放速率逐漸趨于平緩。相較于傳統方法制備的均勻多孔殼聚糖支架材料，CS-RC 和CSRC支架的突釋效應要更小。這主要歸因于CS-RC 支架孔徑的邊緣部分到中心部分呈現致密到疏松的梯度變化，這種結構可以有效減少藥物從邊緣部分流失，減緩了藥物的釋放速率，后期支架中心部分包裹的AL和RFP 逐漸從內部向外部遷移，然后再緩慢釋放到PBS 溶液中，因而CS-RC 支架的體外藥物釋放呈現出了緩釋效果。同時，由于小分子親水性藥物AL 更易進入支架的孔隙內部，從而負載到支架由外到內的整個區域，而疏水性藥物RFP 則主要是進入支架外層的孔隙中，使得RFP 在釋放過程中更容易通過擴散直接進入外部環境，故表現出更高的釋放速率。

3 結 論

（1） 基于溫度變化過程對高分子構象的作用，通過調控冰晶生長過程成功制備了徑向孔徑呈梯度變化的殼聚糖支架材料CS-RC，支架中心部分的孔隙結構較支架邊緣部分更加疏松，整體類似“核殼”包被結構，有利于對負載藥物的包封和負載。

（2） 結構調控后的CS-RC 支架具有較高的孔隙率（可達88.8%），還表現出良好的保濕性能（吸水率可達95%）、力學性能和穩定的降解性能，這為其作為藥物載體應用于臨床奠定了基礎。

（3） 結構調控后的CS-RC 支架對于親水性藥物AL 和疏水性藥物RFP 的載藥率分別提高了8.4% 和4.8%，并且藥物在支架中呈現出穩定的緩釋過程。

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（責任編輯：王吉晶）

基金項目： 國家自然科學基金（81900814）