基于氯化鈣-甲酸溶劑體系的Silk I結(jié)構(gòu)絲素蛋白支架材料的制備與性能

摘 要： 首先以氯化鈣-甲酸為溶劑溶解脫膠蠶絲，然后采用自制的加濕處理裝置對(duì)溶解液進(jìn)行加濕處理，接著將其置于稀堿溶液中進(jìn)行透析得到絲素蛋白水溶液，最后針對(duì)所得絲素蛋白水溶液進(jìn)行冷凍誘導(dǎo)和冷凍干燥，制備出了具有SilkⅠ結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架材料。采用掃描電子顯微鏡（SEM）、X 射線衍射（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、差示掃描量熱（DSC）、熱重分析（TGA）和力學(xué)分析等對(duì)所得絲素蛋白支架材料的形貌、結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性、孔隙率、力學(xué)性能和酶降解性能等進(jìn)行了表征和測(cè)試。結(jié)果表明，所制備的絲素蛋白支架材料具有穩(wěn)定的SilkⅠ結(jié)構(gòu)、可調(diào)控的孔隙率、酶降解性和力學(xué)性能。

關(guān)鍵詞： 絲素蛋白；支架材料；Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)；氯化鈣-甲酸溶劑體系；冷凍干燥法

中圖分類號(hào)： R318.08 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

絲素蛋白是一種來源于蠶絲的天然高分子，具有獨(dú)特的氨基酸組成和多層級(jí)結(jié)構(gòu)，并以其無毒性、良好的生物相容性、可控的生物降解性與低致炎性等特性，在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有著廣泛運(yùn)用[1]。作為一種應(yīng)用價(jià)值廣泛的原材料，絲素蛋白的結(jié)構(gòu)特征及其轉(zhuǎn)變機(jī)制一直是相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容，并已被廣泛報(bào)道[2， 3]。其中，關(guān)于絲素蛋白結(jié)構(gòu)的調(diào)控和表征，更是賦予材料功能或優(yōu)化材料性能的常用手段[4， 5]。

通過脫膠處理從天然蠶絲中獲得的絲素蛋白屬于半結(jié)晶物，結(jié)晶度約為56%，其結(jié)晶區(qū)主要由β-折疊構(gòu)象（約38%）和扭曲β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象（約18%）組成；而非結(jié)晶區(qū)則屬于酪氨酸（Tyr）富集區(qū)，由扭曲β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象（約22%）和扭曲折疊構(gòu)象（約22%）組成[6]。絲素蛋白存在Silk Ⅰ和Silk Ⅱ兩種不同的結(jié)晶形式[7]。通常認(rèn)為，Silk Ⅱ結(jié)構(gòu)是家蠶吐絲后形成的天然蠶絲的主要結(jié)構(gòu)，其基本特征是反平行β-折疊構(gòu)象，由β-折疊片分子間的氫鍵相互作用形成穩(wěn)定態(tài)。Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)則被認(rèn)為是一種亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，最早發(fā)現(xiàn)于風(fēng)干的家蠶絲腺內(nèi)容物，并被認(rèn)為是以α-螺旋構(gòu)象為主導(dǎo)的結(jié)構(gòu)， 但隨著研究的深入， 更傾向認(rèn)為Silk Ⅰ 的分子構(gòu)象為“重復(fù)的β-轉(zhuǎn)角Ⅱ型結(jié)構(gòu)”，分子鏈呈曲軸形狀，與無規(guī)卷曲和α-螺旋構(gòu)象有明顯的不同[8-10]。作為生物醫(yī)學(xué)材料，Silk Ⅱ結(jié)構(gòu)的絲素蛋白材料的吸濕性和柔韌性較差，不利于生物降解和吸收，而Silk Ⅰ 結(jié)構(gòu)絲素蛋白材料可以有效改善 Silk Ⅱ結(jié)構(gòu)絲素蛋白材料的不足，為制備不溶但可快速酶解的絲素蛋白材料提供了可能性，這種具有快速生物降解性的 Silk Ⅰ 結(jié)構(gòu)的絲素蛋白材料有望用作組織工程支架、組織誘導(dǎo)材料、細(xì)胞培養(yǎng)材料和可控藥物載體等[11]。

支架材料是一種具有相互連通的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可支持接種細(xì)胞的增殖、分化以及黏附生長(zhǎng)的組織工程材料[12]。理想的支架材料除了具有相互連通的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還應(yīng)當(dāng)具備優(yōu)異的生物相容性、可調(diào)控的生物降解速率、適當(dāng)?shù)目伤苄院涂烧{(diào)控的力學(xué)性能[13， 14]。絲素蛋白滿足了制備組織工程支架材料要求，已被廣泛應(yīng)用于皮膚、血管、韌帶、軟骨、骨骼和神經(jīng)等多種組織再生及臨床研究領(lǐng)域[15]。為了滿足不同組織細(xì)胞的增殖、分化以及黏附生長(zhǎng)要求，具有不同結(jié)構(gòu)特征的絲素蛋白組織工程支架材料已被廣泛研究[16-19]。其中，武漢紡織大學(xué)Li 等[16， 17] 和范群梅[18] 采用低溫退火處理誘導(dǎo)形成Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)的支架材料；蘇州大學(xué)Zhang 等[19]采用緩慢濃縮過程誘導(dǎo)形成Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)的支架材料；蘇州大學(xué)張萌[6] 采用單向納米孔脫水誘導(dǎo)形成Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)的支架材料。這些支架材料的制備過程以LiBr 溶液或CaCl2-EtOH-H2O 溶液為溶劑體系溶解脫膠蠶絲，然后，再經(jīng)透析和冷凍干燥后制備支架材料。

CaCl2-甲酸溶液是一種優(yōu)良的脫膠蠶絲溶劑，具有溶解速率快、含鹽量低等特點(diǎn)[20-22]，但由于甲酸對(duì)絲素蛋白具有高度的促結(jié)晶作用[23]，以其為溶劑所制備的絲素蛋白材料往往具有高度Silk Ⅱ結(jié)構(gòu)。目前，有關(guān)以CaCl2-甲酸溶液為溶劑制備Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)絲素蛋白支架材料的研究尚鮮見報(bào)道。本文設(shè)計(jì)了一套溶解和材料處理程序，首先以CaCl2-甲酸溶液為溶劑溶解脫膠蠶絲獲得CaCl2-甲酸-絲素蛋白溶解液，然后采用自制的加濕處理裝置，對(duì)CaCl2-甲酸-絲素蛋白溶解液進(jìn)行加濕處理，在此過程中，稀釋CaCl2-甲酸-絲素蛋白溶解液中甲酸的濃度，再通過稀堿透析制得絲素蛋白水溶液，最后通過簡(jiǎn)單的冷凍誘導(dǎo)和冷凍干燥制備出了具有SilkⅠ結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架材料。結(jié)果表明，通過調(diào)控絲素蛋白溶液的濃度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)所制備的SilkⅠ結(jié)構(gòu)絲素蛋白支架材料孔隙率、力學(xué)性能和酶降解速率的調(diào)控，滿足組織工程支架材料的使用要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

桑蠶生絲：柳州市昌海繭絲有限責(zé)任公司；無水碳酸鈉：西隴科學(xué)股份有限公司；無水氯化鈣、甲酸、氫氧化鈉、無水乙醇、蛋白酶XIV：上海麥克林生化科技股份有限公司； 10×PBS 緩沖液：北京索萊寶科技有限公司。上述化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平（奧豪斯AR224 CN 型）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（余姚市正泰XMA-600 型）；磁力攪拌水浴鍋（金壇市城西富威FJS- 6 型）；電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（東莞寶大PT-1 198 型）；磁力攪拌器（廣東窯聲RS-201 型）；冷凍干燥機(jī)（上海田楓TF-FD- 1 型） ；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（德國(guó)蔡司Sigma 300 型） ； Jupiter 同步熱分析儀（德國(guó)耐馳STA449 F5 型）；傅里葉變換紅外光譜儀（熒颯光學(xué)FOLI10-R 型）；全自動(dòng)X-射線衍射儀（荷蘭PANalytical 公司X’Pert Pro 型）。

1.3 絲素蛋白支架材料的制備

取適量桑蠶生絲放入w =0.5% 的碳酸鈉溶液（桑蠶生絲的ρ 為0.005 g/L）中，煮沸 30 min，煮完用清水清洗，此過程重復(fù) 3 次，再把脫膠后的蠶絲晾干備用。

取定量脫膠蠶絲放在氯化鈣-甲酸（w（CaCl2）=3%）溶劑中，用磁力攪拌器攪拌至蠶絲完全溶解，得到絲素蛋白-CaCl2-甲酸混合溶解液，其中，絲素蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w（SF））為10%。

將完全溶解的絲素蛋白-CaCl2-甲酸混合液置于敞口容器中，并將其放置于自制的加濕處理裝置進(jìn)行加濕處理6 h。將經(jīng)過濕氣處理的混合液裝進(jìn)透析袋中，再將其放入NaOH 溶液中透析，調(diào)節(jié)至合適的pH，然后將水溶液置于去離子水中透析1 d 后離心，取上清液，獲得絲素蛋白水溶液。將裝有絲素蛋白水溶液的透析袋放入聚乙二醇溶液中濃縮，將濃縮后的水溶液稀釋至w（SF） 分別為3%、5%、7% 和10%，再將其倒入24 孔板中，在?20 ℃ 冰柜中冷凍，之后轉(zhuǎn)移到?5 ℃ 冷凍干燥機(jī)中，得到絲素蛋白支架材料。將冷凍干燥后得到的樣品分別浸泡在乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為75%）中2 h，待乙醇揮發(fā)完全后再進(jìn)行冷凍干燥。

1.4 測(cè)試與表征

1.4.1 掃描電鏡（SEM）

用刀片從絲素蛋白支架材料圓柱的中部截取厚度約3 mm 的扁平層，用導(dǎo)電膠將其黏貼于樣品臺(tái)，并進(jìn)行噴金處理，噴金時(shí)間為60 s，之后用發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀察，測(cè)試電壓為10 kV。

1.4.2 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）

使用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)絲素蛋白支架進(jìn)行FT-IR 測(cè)試，測(cè)試范圍400～4 000 cm?1，分辨率4 cm?1。

1.4.3 X 射線衍射（XRD）

把絲素蛋白支架材料樣品剪成粉末狀，在40 kV、40 mA 下，用X 射線衍射儀進(jìn)行測(cè)試，X 射線光源為Cu-Kα 射線，掃描速率為10（°）/min，掃描范圍為5°～50°。

1.4.4 熱學(xué)性能

將絲素蛋白支架材料剪成粉末狀，使用同步熱分析儀對(duì)所得粉末進(jìn)行熱力學(xué)性能測(cè)試（差示掃描量熱（DSC）、熱重分析（TGA）、微商熱重法（DTG）），升溫速率為10 ℃/min，溫度從室溫到800 ℃，測(cè)試環(huán)境為氮?dú)?，流速?0 mL/min。

1.4.5 孔隙率

用液體置換法[24] 對(duì)所制備的絲素蛋白支架材料的孔隙率進(jìn)行測(cè)量。將冷凍干燥后的支架放入無水乙醇溶液（體積為V0）中，當(dāng)樣品被溶液完全浸沒時(shí)測(cè)得總體積為V1。然后取出樣品記錄此時(shí)剩余的無水乙醇溶液體積為V2。根據(jù)公式（1）計(jì)算孔隙率（RE）。每組樣品測(cè)量3 次并取平均值。

RE =（V0 -V2／V1 －V2）×100% （1）

1.4.6 力學(xué)性能

利用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)對(duì)試樣進(jìn)行了干濕狀態(tài)下的壓縮試驗(yàn)。在進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試前，先用游標(biāo)卡尺對(duì)絲素蛋白支架材料的尺寸進(jìn)行測(cè)量，該圓柱體材料的直徑約15 mm，高為7～12 mm；然后，將待測(cè)的絲素蛋白支架材料置于去離子水中浸泡10 min；最后置于電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行濕態(tài)壓縮測(cè)試，其中，水平頭下壓速率設(shè)定為3 mm/min，當(dāng)壓縮變形達(dá)到絲素蛋白支架材料高度的60% 時(shí)停止下壓。

1.4.7 水溶性

首先將待測(cè)樣品冷凍干燥后取出稱重記為 m0；然后將支架與去離子水以質(zhì)量比1∶99 浸入50 mL 試管中；接著將該試管放在37 ℃ 恒溫水浴振蕩箱中，1 h 后取出；最后在烘箱中干燥并稱重，記為m1。每次測(cè)量3 個(gè)樣品取平均值。根據(jù)公式（2）計(jì)算水溶失重率（RW）。

RW =（m0 -m1／m0）×100% （2）

1.4.8 體外降解性

首先稱量一定量的絲素蛋白支架材料樣品，記為m2；然后將樣品放入0.01 mol/L PBS 溶液（含1.0 U/mL 蛋白酶 XIV），樣品與PBS 溶液的質(zhì)量比為 1∶99；接著將裝有樣品的離心管密封后置于37 ℃的恒溫水浴振蕩箱中，降解期間每 3 天更換一次降解液，降解液現(xiàn)配現(xiàn)用；最后在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)將剩余樣品取出，去離子水浸潤(rùn)洗滌去除降解液中殘留物，干燥后稱重m3，根據(jù)公式（3）計(jì)算酶降解率（RM）。

RM =（m2 -m3／m2）×100% （3）

2 結(jié)果與討論

2.1 微觀形貌與孔隙率分析

圖1 所示為絲素蛋白支架材料及其經(jīng)乙醇浸泡處理2 h 后所制備支架材料的微觀形貌。由圖1 可見，不同w（SF）所制備的支架材料均具有高度的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔隙之間相互連通，可滿足作為組織工程支架材料使用的要求，乙醇處理對(duì)所制備絲素蛋白支架材料微觀形貌的影響并不明顯。

絲素蛋白支架材料的孔隙率如圖2 所示。由圖2 可知，當(dāng)w（SF）=3% 時(shí)，絲素蛋白支架材料的孔隙率為（92.11±1.47）%；隨著w（SF）的增加，絲素蛋白支架材料的孔隙率逐漸下降；當(dāng)w（ SF）增加至10% 時(shí)， 絲素蛋白支架材料的孔隙率降低至（74.40±1.46）%。這說明w（SF）對(duì)所制備支架材料的空隙結(jié)構(gòu)具有重要的影響，考慮到不同種類細(xì)胞對(duì)支架材料孔隙率的要求不同，通過調(diào)控w（SF）可實(shí)現(xiàn)較寬范圍的孔隙率，有利于適用不同種類細(xì)胞的培養(yǎng)和組織再生[25，26]。進(jìn)一步地，在相同w（SF）條件下，對(duì)比乙醇處理前后，絲素蛋白支架材料的孔隙率可知，經(jīng)乙醇處理后絲素蛋白支架材料的孔隙率略有下降，這可能與乙醇浸泡后絲素蛋白分子構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，材料發(fā)生收縮而變得緊實(shí)有關(guān)[16]。

2.2 結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 XRD 分析

圖3 所示為所制備支架材料的XRD 圖譜。不同w（SF）所制備支架材料的XRD 圖譜基本一致，均在12.0°、19.8°、24.3°、27.9°和36.4°附近出現(xiàn)衍射峰（圖3（a）），說明w（SF）的變化對(duì)所制備支架材料的結(jié)構(gòu)不存在明顯影響。同時(shí)，12.0°和19.8°處的衍射峰較強(qiáng)，此兩處的峰是Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)的標(biāo)志特征，而24.3°、27.9°和36.4°處的衍射峰較弱，這些衍射峰亦屬于Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)，上述特征峰表明所制備的絲素蛋白支架材料具有Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)[16， 17]。

經(jīng)乙醇處理后，所得絲素蛋白支架材料的XRD 圖譜中，部分峰位發(fā)生了微弱的偏移（ 24.3°峰偏移至24.5°，27.9°峰偏移至28.0°，36.4°峰偏移至37.0°），這些微弱的峰位偏移說明所制備的絲素蛋白支架材料經(jīng)乙醇處理后存在結(jié)構(gòu)變化，但考慮到峰強(qiáng)較大的12.0°和19.8°峰未發(fā)生變化，而僅是峰強(qiáng)較弱的峰發(fā)生了微弱偏移，可以確定所制備的絲素蛋白支架材料經(jīng)乙醇處理后仍具有Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)。

2.2.2 FT-IR 分析

絲素蛋白支架材料的FT-IR 圖譜如圖4（a）所示。1 700～1 600 cm?1 對(duì)應(yīng)絲素蛋白的酰胺Ⅰ區(qū)，1 600～1 500 cm?1 對(duì)應(yīng)絲素蛋白的酰胺Ⅱ區(qū)，1 350～1 200 cm?1 對(duì)應(yīng)絲素蛋白的酰胺Ⅲ區(qū)，這些FT-IR 區(qū)域被廣泛應(yīng)用于絲素蛋白材料的結(jié)構(gòu)分析。由圖4（a）可知，不同w（SF）所制備支架材料的FT-IR 圖譜基本一致，酰胺Ⅰ區(qū)的1 643 cm?1 處存在尖峰，主要源于C=O 和C―N 的伸縮振動(dòng)，N―H 平面中彎曲亦產(chǎn)生一定影響；酰胺Ⅱ區(qū)的1 513 cm?1 處存在尖峰，主要是N―H 平面中彎曲且伴有C―N 伸縮振動(dòng)；酰胺Ⅲ區(qū)的1 236 cm?1處存在尖峰，主要由C―N 伸縮振動(dòng)與N―H 平面中彎曲所致[27]。

經(jīng)乙醇處理的絲素蛋白支架材料的FT-IR 圖譜如圖4（ b）所示。由圖4（ b）可知，酰胺Ⅰ區(qū)的峰位由1 643 cm?1 處偏至1 622 cm?1 處，酰胺Ⅲ區(qū)的峰位由1 236 cm?1 處偏至1 232 cm?1 處，這說明經(jīng)乙醇處理后，所制備絲素蛋白支架材料的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

為了進(jìn)一步明確乙醇處理對(duì)所制備絲素蛋白支架材料二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，基于Hu 等[28] 所總結(jié)的方法，對(duì)絲素蛋白多孔支架材料FT-IR 圖譜的酰胺Ⅰ區(qū)進(jìn)行分峰擬合處理，二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分析見表1。由表1 可知，經(jīng)乙醇處理后的支架材料，其β-折疊含量由約29% 增加至約33%，而無規(guī)卷曲含量明顯下降，由約32% 降至約25%，α-螺旋含量和β-轉(zhuǎn)角含量未發(fā)生明顯變化，分別約為11% 和16%。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化說明乙醇處理可使絲素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，尤其是由無規(guī)卷曲含量向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變。對(duì)此，已有大量研究結(jié)果表明，乙醇可使絲素蛋白材料中β-折疊含量增加[29-31]，而就Silk Ⅰ 結(jié)構(gòu)絲素蛋白材料而言，醇類分子（如甲醇或乙醇）可以促進(jìn)絲素蛋白由無規(guī)卷曲構(gòu)象向β-折疊構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，但不會(huì)引起Silk Ⅰ的變化，Silk Ⅰ結(jié)構(gòu)在甲醇和乙醇溶液中能穩(wěn)定存在[11]。

2.3 熱學(xué)性能分析

絲素蛋白支架材料的熱分析曲線（圖5）呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)。其中，對(duì)于未經(jīng)乙醇處理的絲素蛋白支架材料，材料中的水分散失至126 ℃ 基本完成，262 ℃ 開始材料表現(xiàn)出熱分解（圖5（a））；而對(duì)于經(jīng)乙醇處理的絲素蛋白支架材料，材料中的水分散失至116 ℃ 基本完成，269 ℃ 開始材料表現(xiàn)出熱分解（圖5（b））。絲素蛋白支架材料的最速熱分解出現(xiàn)在294 ℃ 附近，經(jīng)乙醇處理后的最速熱分解溫度存在1 ℃ 的差異（圖5（c，d））。絲素蛋白支架材料在286 ℃ 附近出現(xiàn)吸熱峰（圖5（e）），而經(jīng)乙醇處理后吸熱峰出現(xiàn)在290 ℃（圖5（f））。絲素蛋白材料的熱分解與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，結(jié)晶區(qū)分子排列緊密且作用力強(qiáng)，熱穩(wěn)定性優(yōu)于非結(jié)晶區(qū)，而乙醇處理可使絲素蛋白材料中β-折疊含量增加，進(jìn)而使得絲素蛋白支架材料的熱分解溫度提高[32]。

2.4 力學(xué)性能分析

絲素蛋白支架材料及其經(jīng)乙醇浸泡處理2 h 后的干態(tài)和濕態(tài)壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖6 所示。由圖6 可知，絲素蛋白支架材料的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線主要由3 個(gè)區(qū)域組成：其中，第1 個(gè)區(qū)域?yàn)閺椥詤^(qū)，反映支架材料的彈性，壓縮模量可根據(jù)該區(qū)域中曲線的斜率計(jì)算而得；第2 個(gè)區(qū)域?yàn)榍^(qū)，曲線斜率變得平緩；第3 個(gè)區(qū)域?yàn)橛不瘏^(qū)，曲線斜率急劇上升[25]。相對(duì)于干態(tài)壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線，絲素蛋白支架材料的濕態(tài)壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線的彈性區(qū)與屈服區(qū)之間的轉(zhuǎn)變點(diǎn)不清晰，說明其壓縮模量急劇下降。

為了進(jìn)一步量化分析，對(duì)所制備支架材料及其經(jīng)乙醇浸泡處理2 h 后的干態(tài)和濕態(tài)壓縮模量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖7 所示。由圖7 可知，隨著w（SF）的增大，絲素蛋白支架材料的壓縮模量均逐漸增大。在干態(tài)下，絲素蛋白支架材料的壓縮模量從（245.91±17.83） kPa 增大到（2 963.16±519.81） kPa；在濕態(tài)下，絲素蛋白支架材料的壓縮模量從（5.84±0.28） kPa 增大到（35.36±2.8） kPa。在相同w（SF）條件下，經(jīng)乙醇處理的絲素蛋白支架材料的壓縮模量略高于未經(jīng)乙醇處理的支架材料。經(jīng)乙醇處理支架材料壓縮模量的增加可能與其β-折疊含量提高有關(guān)，已有研究表明，絲素蛋白支架材料中β-折疊含量越高，其壓縮模量越大[25]。

2.5 水溶性與酶降解性能分析

不同濃度絲素蛋白溶液所制備支架材料的水溶失重率和酶降解曲線如圖8 所示。實(shí)驗(yàn)中觀察到所制備支架材料在水中浸泡后均能保持住原有形貌，具有好的水穩(wěn)定性。不同w（SF）所制備支架材料的平均水溶失重率變化不大（圖8（a）），這說明w（SF）對(duì)絲素蛋白支架材料的水溶性無顯著影響。不同w（SF）所制備的支架材料在蛋白酶 XIV 溶液中降解存在明顯的差異，w（SF）越大，所制備的支架材料的質(zhì)量殘余率越高，這說明其降解越少。絲素蛋白支架材料的酶降解與其孔隙率有關(guān)，孔隙率越高，其比表面積越大，蛋白酶XIV 分子所接觸的絲素蛋白材料孔壁面積越大，導(dǎo)致其降解速率提高[26]。同時(shí)，在相同w（SF）下，經(jīng)乙醇處理的材料降解速率更緩慢，這與乙醇處理導(dǎo)致的支架材料β-折疊含量增加有關(guān)，β-折疊含量越高，絲素蛋白支架材料的降解速率越慢，這是由于蛋白酶XIV 更易攻擊絲素蛋白支架材料的無規(guī)則卷曲區(qū)域[33]。

3 結(jié) 論

（1）以氯化鈣-甲酸為溶劑，結(jié)合加濕處理、冷凍誘導(dǎo)和冷凍干燥，可制備出具有SilkⅠ結(jié)構(gòu)的絲素蛋白支架材料，對(duì)其進(jìn)行乙醇處理后，SilkⅠ結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。

（2）所制備的絲素蛋白支架材料的壓縮模量隨著制備材料時(shí)所采用的絲素蛋白溶液濃度的增大而增加，而其孔隙率和酶降解速率則隨著絲素蛋白溶液濃度的增大而減小。

（3）當(dāng)w（SF）由3% 增加至10% 時(shí)，在干態(tài)下，絲素蛋白支架材料的壓縮模量由（245.91±17.83） kPa 增加至（2 963.16±519.81） kPa；在濕態(tài)下，絲素蛋白支架材料的壓縮模量為（5.84±0.28） kPa 增加至（35.36±2.8） kPa；孔隙率由（92.11±1.47）% 減小至（74.40±1.46）%。

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（責(zé)任編輯：王吉晶）

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