番茄bHLH轉錄因子SlbHLH077的克隆及表達分析

摘要 bHLH轉錄因子作為真核生物中最大的基因家族之一，在植物生長發(fā)育以及非生物脅迫中扮演著關鍵的角色。為更進一步研究bHLH轉錄因子在番茄中的功能及表達特征，以番茄幼苗為試驗材料，在番茄中克隆得到CDS全長為1 739 bp的SlbHLH077基因，通過生物信息學手段對該基因進行基本特征分析，同時結合實時熒光定量技術研究了該基因在生物脅迫與非生物脅迫下的表達模式。結果表明：該基因只含有1個外顯子，不含內含子，編碼579個氨基酸，含有典型的HLH保守結構域。編碼蛋白的相對分子量為64 271.00 Da，理論等電點為7.59，屬于不穩(wěn)定的堿性蛋白。蛋白互作表明，該蛋白與10個JAZ蛋白相互作用而發(fā)揮調解作用。系統發(fā)育表明，SlbHLH077與馬鈴薯的親緣關系最近，與杜鵑的親緣關系最遠。組織分析表明，該基因在多個組織中均有表達，熒光定量PCR表明該基因響應低溫、鹽和干旱等非生物脅迫以及激素與黃葉卷曲病等生物脅迫。該研究結果為番茄抗逆育種及進一步探究SlbHLH077的功能提供了理論依據。

關鍵詞 番茄；SlbHLH077；克隆；生物信息學分析；表達特征

中圖分類號 S641.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2025）06-0089-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.06.021

Cloning and Expression Analysis of Tomato bHLH Transcription Factor SlbHLH077

WANG Wen-ting， WANG Yi-ru， ZHU Wei et al

（Wuhan Vocational College of Software and Engineering （Wuhan Open University）， Wuhan， Hubei 430205）

Abstract As one of the largest gene families in eukaryotes， bHLH transcription factors play a key role in plant growth and development and abiotic stress. In order to further study the function and expression characteristics of the bHLH transcription factor in tomato， this study used tomato seedlings as the test material， cloned the SlbHLH077 gene with a CDS full length of 1 739 bp in tomato， and the basic characteristics of this gene were analyzed by bioinformatics methods.Combined with real-time fluorescence quantitative technology to study the gene expression pattern under biotic and abiotic stress. The results show that the gene contains only one exon， no introns， and encodes 579 amino acids， containing a typical HLH conserved domain. The relative molecular weight of the encoded protein is 64 271.00 Da， and the theoretical isoelectric point is 7.59， which is an unstable basic protein. Protein interaction indicates that the protein interacts with 10 JAZ proteins to play a mediating role. The phylogeny indicated that SlbHLH077 has the closest relationship with potato and the farthest relationship with rhododendron. Tissue analysis showed that the gene was expressed in multiple tissues， and fluorescence quantitative PCR showed that the gene responded to abiotic stresses such as low temperature， salt and drought， and biological stresses such as hormones and yellow leaf curl disease. The results of this study provide a theoretical basis for tomato resistance breeding and further exploration of the function of SlbHLH077.

Key words Tomato;SlbHLH077;Cloning;Bioinformatics analysis;Expression characteristics

植物在其生命周期中不可避免地會受到環(huán)境因素的影響（包括生物和非生物脅迫），干旱和鹽堿脅迫的增加通常會通過干擾離子穩(wěn)態(tài)，減少養(yǎng)分吸收并加劇氧化脅迫來限制植物的生長和發(fā)育［1］。為了適應這些不利的環(huán)境脅迫條件，植物在進化過程中形成了多種復雜的應對機制。當植物應對不同脅迫時，信號轉導和轉錄調控在復雜的生物化學和分子調控網絡中起著重要作用。迄今為止，已經報道了一系列抗逆性轉錄因子，它們可以抵抗不同植物中的非生物脅迫耐受性［1-2］。

基本的螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）是轉錄因子的基因家族，具有多種功能，廣泛存在于真核生物中。bHLH轉錄因子因其自身的結構特征而命名［3］，主要由保守的60個氨基酸殘基組成，可調節(jié)動植物中的許多細胞過程，并且還參與對生物和非生物脅迫的響應［4-5］。根據功能的不同，它們可以分為2部分：基本堿性區(qū)域和HLH區(qū)域［6］。基本堿性區(qū)域分布在bHLH保守結構域的N末端，并包含15～20個與DNA結合有關的殘基［6-7］，其中至少5個是具有高度保守的HER基序（His-5，Gly-9和Arg-13）的堿性氨基酸。因此，可以通過基本區(qū)域識別被稱為E-box的共有六核苷酸（CANNTG）。HLH結構域分布在基因序列的C端，由2個親水性α螺旋組成，主要由疏水殘基組成，這些殘基由可變序列和長度的環(huán)區(qū)連接，這些基序使bHLHs通過蛋白-蛋白相互作用表現出多種類型，并調節(jié)其特定功能。HLH結構域是bHLH轉錄因子中同源或異源二聚體形成的必不可少的結構［8］。在動物中，bHLHs參與許多生理和發(fā)育過程，如對環(huán)境信號、神經發(fā)生、肌發(fā)生、性別分化和細胞分化的反應［9-10］。在植物中，bHLHs在許多發(fā)育和生物學過程中都起著重要作用，如bHLH在種子萌發(fā)的調控中起關鍵作用［11］；花青素的生物合成，類黃酮合成［12］；激素信號傳導［13］；對受傷、干旱、鹽分和低溫的反應［4］；鐵缺乏和磷酸鹽饑餓［14］。越來越多的證據表明，bHLH轉錄因子對于植物對非生物脅迫的反應至關重要。例如，AtICE1和MdCIbHLH1可以提高擬南芥和蘋果的耐冷脅迫能力［15］；bHLH122可調節(jié)干旱、鹽和滲透脅迫的抗性，并提高擬南芥中的細胞ABA水平［16］；bHLH104和MdbHLH104可以提高擬南芥和蘋果對鐵缺乏的耐受性［14，17］；AtMYC2通過正向調節(jié)擬南芥干旱響應基因RD22的轉錄來提高抗旱性［18］。AtbHLH112是一種轉錄激活因子，可介導脯氨酸的生物合成和清除活性氧（ROS）的途徑，從而增強非生物脅迫的耐受性。 OsbHLH148是AtMYC2的同系物，可提高水稻的耐旱性［19］；NtbHLH123通過調節(jié)煙草中的NtCBF基因和清除ROS來提高耐寒性［5］；MdbHLH3可調節(jié)家蠅在低溫下的花色苷積累［20］，PebHLH35通過調節(jié)氣孔密度和氣孔孔徑來提高植物對干旱的耐受性［21］；TabHLH1與小麥的滲透和養(yǎng)分脅迫有關［22］。此外，在擬南芥中從野生稻Oryza rufipogon中分離出的OrbHLH2的過表達提高了對鹽脅迫的耐受性［23］。與野生植物相比，ABA脅迫強烈誘導了AtbHLH122基因，過表達AtbHLH122的轉基因植物對NaCl脅迫表現出更大的抗性［16］。通過鹽處理誘導了小麥bHLH轉錄因子TabHLH39，并提高了小麥的鹽脅迫耐受性［24］。此外，研究表明，bHLH家族基因在番茄抗黃葉卷曲病中發(fā)揮著重要作用［25］。

番茄（Solanum lycopersicum L.）為管狀花目茄科番茄屬一年生或多年生草本植物。其因具有重要的經濟價值而受到人們的普遍喜愛，是全世界栽培較為廣泛的蔬菜。然而，番茄在生長過程中常受到多種環(huán)境脅迫的不利影響，如干旱、高溫、低溫以及病毒病等。尤其番茄黃葉卷曲病可能對其造成毀滅性的損傷。盡管已經在植物生長發(fā)育和非生物脅迫耐受性的背景下證明了多個bHLH基因在幾種植物中的作用［12-14］，且在番茄中已鑒定出約158種bHLH［26］，但尚未對其大多數功能進行研究，有研究表明SlbHLH095參與果實成熟的調節(jié)，影響乙烯敏感性和RIN靶向番茄中的多種代謝［27］。因此，筆者通過基因克隆與生物信息學分析報道了番茄bHLH077基因的基本結構特征，通過實時熒光定量檢測了該基因在不同脅迫下（干旱、低溫、鹽與病毒）的表達模式，了解該基因的分子結構和生物學功能，旨在為今后使用轉基因技術提高番茄抗逆性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料種植于甘肅農業(yè)大學生科院試驗基地，以番茄（金鵬1號）作為試驗材料。將100粒種子浸入溫水中，在55" ℃無菌水中放置20 min，然后轉移到28 ℃室溫水中4 h，然后在28 ℃暗室中發(fā)芽1 d。將發(fā)芽的種子播種在帶有底物（蛭石∶珍珠巖∶園土 = 1∶1∶1）的50孔育苗盤中。播種后，將種子放入光箱中生長［相對濕度70％，光照/黑暗16 h/8 h；白天/晚上28 ℃/18 ℃；光照強度190～600 μmol/（m2·s）］。當番茄幼苗長到四葉一心時，將其進行脅迫處理。低溫處理：在4 ℃下進行處理。鹽脅迫：100 mmol/L NaCl。干旱處理：20% PEG。在脅迫處理后的0、2、4、8、12和24 h取番茄幼苗的根、莖和葉。接種黃化卷葉病毒：采用農桿菌介導的方法接種黃化卷葉病毒，在接種后10、20、30 d取番茄幼苗葉片，進行3個獨立的生物學重復，每個重復包含3～6個單獨的番茄植株樣品。樣品液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜诤笃赗NA提取，反轉錄及目的基因的克隆、生物信息學分析及qRT-PCR分析。

1.2 方法

1.2.1 SlbHLH077基因克隆。

在番茄基因組數據庫中下載SlbHLH077基因的編碼序列（coding sequence，CDS），設計特異性引物（表1），以番茄幼苗cDNA為模板，利用特異引物 SlbHLH077-F-KpnⅠ 和 SlbHLH077-R-SalⅠ，擴增目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因，通過膠回收試劑盒（天根），對目的基因進行純化回收，將純化后的目的片段連接至 T載體，利用熱激轉化法轉入DH5α大腸桿菌（Escherichia coli），通過藍白斑篩選，獲得陽性克隆，進行菌液PCR檢測并送天啟公司測序，合適序列用于后期序列分析。

1.2.2 SlbHLH077基因編碼蛋白基本結構分析。

利用軟件ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測基因的開放讀碼框；在網站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）找到工具ProtParam，對基因編碼的氨基酸序列進行理化性質的預測和分析；對GSDS（gene structure display server）進行基因結構分析；亞細胞定位利用PSORTb（https：//www.psort.org/psortb/index.html）進行分析；其 蛋 白 的 跨 膜 結 構 域 借 助 TMHMM Server v.2.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行分析；磷酸化位點預測借助NetPhos 3.1 Server（ http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）；糖基化位點預測借助NetOGlyc 4.0 Server（ http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）。二級結構通過網站（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行預測；蛋白質的三級結構通過網站（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）進行預測；蛋白互作網絡圖通過String（https：//string-db.org/）制作。通過 DNAMAN 進行多序列比對，并使用 MEGA 6.0 軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，重復次數為1 000，分析其進化關系。

1.2.3 SlbHLH077基因非生物脅迫表達分析。

按照制造商的說明，使用RNeasy mini試劑盒（QIAGEN，Hilden，德國）從收集的樣品中提取總RNA。使用不含RNase的DNase I試劑盒（Qiagen，Hilden，德國）去除基因組DNA污染。RNA濃度和質量用NanoDrop1 000分光光度計（Wilmington，DE，USA）測定。使用Superscript III First-Strand cDNA合成試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），每個樣品使用1 μg總RNA進行第一鏈cDNA合成。對于定量實時聚合酶鏈反應（RT-qPCR）分析，使用Primer 5軟件設計基因特異性引物［14］。番茄的18S rRNA被用作標準化的參考。實時PCR分析是使用Lightcycler96SW1.1儀器（Roche，德國）在96孔板上進行，采用SYBR Green PCR試劑盒（Qiagen，Hilden，德國）。反應體系：10 μL iTaqTM，75～80 ng/μL cDNA，正向和反向引物各2 μL和7 μL雙蒸餾水組成，總體積為20 μL。qPCR的條件：在95 ℃初始變性5 min，然后在94 ℃ 40循環(huán)10 s，在58 ℃退火10 s，在72 ℃延伸15 s。每個基因的相對表達量由2-ΔΔCt方法確定。對于脅迫處理，相對表達值相對于0 h收獲的葉片樣品值進行了歸一化處理。相對表達數據的顯著差異用SPSS進行分析。

1.2.4 SlbHLH077基因在不同組織中的表達。

該基因在不同組織中的表達模式通過使用R語言從RNA-seq 數據庫下載［28］。不同組織的相對表達豐度用每百萬映射中每個堿基讀取數（read per ktlobase per million mapped read，RPKM）值表示，并使用 log2方法對該數據進行標準化處理。

2 結果與分析

2.1 SlbHLH077基因克隆

對番茄幼苗葉片總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示28S與18S條帶較為清晰，且亮度接近 2∶1，表明RNA

質量好，滿足后續(xù)試驗要求。此外，以反轉錄得到的cDNA為模板，擴增得到長度為2 000 bp左右的目的基因CDS序列（圖1），與預期結果一致。并構建 T載體，對SlbHLH077基因膠回收產物通過TA克隆后連接到T載體上，后轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，菌液PCR篩選陽性克隆序列進行測序。結果顯示，CDS 總長為1 739 bp，且無堿基突變，與番茄數據庫中完全一致，將其命名為SlbHLH077（Gene Bank：XM_010323205.3；Phytozome 數據庫編號：Solyc05g050560.1.1）。因此，可用于后續(xù)生物信息學分析。

2.2 SlbHLH077基因生物信息學分析

2.2.1 SlbHLH077基因編碼氨基酸基本理化性質。

通過分析發(fā)現，SlbHLH077基因全長2 566 bp，共含9個開放閱讀框，只包含1個編碼區(qū)，且該區(qū)長度為1 739 bp（574～2 313 bp），共編碼 579 個氨基酸（圖 2）。對SlbHLH077基因編碼蛋白進行預測表明，該編碼蛋白分子量為 64 271.00，化學式為 C2809H4474N808O863S28 ，其理論等電點為 7.59，屬于堿性蛋白，帶負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）為73個，正電荷氨基酸殘基（Arg + Lys）為 74個，不穩(wěn)定指數達 40.54，屬于一種不穩(wěn)定蛋白，脂肪數為75.60。亞細胞定位預測表明，該基因蛋白可能在細胞核（0.7）、過氧化酶體（0.3）及線粒體基質空間（0.1）中表達，親水性平均值為 -0.425。同時蛋白的相對突變預測表明，該蛋白高突變區(qū)在 490～519位氨基酸，其高極性區(qū)在 412～428 位氨基酸，高松散區(qū)在 196～211 位氨基酸。預測表明，編碼精氨酸（Arg）的密碼子最多（6個）。

2.2.2 SlbHLH077基因編碼蛋白二級結構。

二級結構預測（圖 2）表明，該蛋白只含 α-螺旋、無規(guī)則卷曲以及延伸鏈3種結構元件，其中無規(guī)則卷曲最多，共 275個氨基酸，占比為 47.50%，其次為α-螺旋（238個氨基酸），占比 41.10%，最后為延伸鏈，占比11.40%，按照 Skolnick 等報道的二級結構分型，該蛋白二級結構屬于混合型。

2.2.3 SlbHLH077基因編碼蛋白跨膜結構域及亞細胞定位預測。

SignalP4.1 預測結果顯示該蛋白不存在信號肽，TMHMM 平臺以及二硫鍵預測顯示該蛋白不含跨膜結構域，屬于胞內蛋白，作用于膜內。而在存在的 5 個Cys 中，預計形成 2 個二硫鍵，其位置分別在氨基酸 24～57和 162～172，亞細胞定位通過PSORT軟件預測，結果顯示，該基因編碼蛋白主要定位在細胞核中，這與轉錄因子在細胞核中發(fā)揮作用的研究結果一致。

2.2.4 蛋白質磷酸化位點與糖基化位點預測。

NetPhos 3.1 預測顯示，該蛋白含有74個磷酸化位點，其中56個（75.68%）屬于絲氨酸磷酸化，14個（18.92%）屬于蘇氨酸磷酸化，4個（5.40%）屬于酪氨酸磷酸化。NetOGlyc 4.0 預測顯示該蛋白存在14個糖基化位點（圖3）。

2.2.5 SlbHLH077基因編碼蛋白保守結構與三級結構預測。

三級建模顯示，該蛋白的三級結構與4個已知蛋白的結構相似，其中與轉錄因子MYC2的相似度最高，為80.00%，其次是MYC2，相似度為32.74%。利用SMART軟件分析，獲得蛋白結構域。結果顯示，該蛋白在434～483號氨基酸（50個）形成HLH保守結構域，表明SlbHLH077屬于典型的bHLH家族基因。同時，筆者預測了該基因編碼蛋白的三級結構，發(fā)現了4種相似的三級結構模板，其中轉錄因子MYC2與其相似性最高，為80.00%（圖4）。

2.2.6 蛋白質相互作用網絡圖分析。

以擬南芥為模板，構建了SlbHLH077基因的蛋白互作網絡圖（圖5）。由圖5可知，在擬南芥中AT1G01260與SlybHLH077基因同源，而AT1G01260與多個基因相互作用，說明SlybHLH077也可能在番茄中與多個基因相互作用而發(fā)揮其特定的功能。

2.2.7 序列比對與系統發(fā)育進化樹的構建。

通過NCBI，以該基因CDS序列翻譯成的氨基酸序列為基礎，利用NCBI的blast功能，以SlbHLH077基因編碼的氨基酸為基礎進行序列比對，最終在18個物種中篩選出與SlbHLH077相似度較高的同源基因。結果表明，SlbHLH077與野生番茄TMW98364.1的同源性最高，為98.45%。與杜鵑KAE9460221.1的同源性最低，為63.92%。此外，通過DNAMAN進行多序列比對，并將在不同物種中高度保守的70個氨基酸以圖6形式展示，發(fā)現在18個物種中bHLH結構域存在高度保守的現象。

此外，利用MEGA7.0構建系統發(fā)育進化樹，結果也證明番茄SlbHLH077與野生番茄、馬鈴薯和辣椒等茄科作物的親緣關系較近，與咖啡、梔子和長春花等植物的親緣關系較遠（圖7）。

2.2.8 SlbHLH077基因在不同組織中的表達模式分析。

通過轉錄組學數據分析了SlbHLH077基因在不同組織中的表達，發(fā)現該基因在10個組織中均呈現不同程度的表達。其中，在花蕾與根中表達量相對最高，在綠色成熟果和早熟果中的表達量相對較低，在其余6個組織中的表達水平相差不大（圖8）。

2.2.9 非生物脅迫下表達模式。

在鹽脅迫（100 mmol/L）下，SlbHLH077基因在根、莖與葉中均呈現先增后減的表達模式，根中表達量在處理后2 h達到最大，為對照（0 h）的3.65倍，莖和葉均在處理后8 h達到最大，分別為對照（0 h）的8.20、3.64倍。低溫（4 ℃）處理下該基因在根和莖中呈現先增后減表達模式，根中處理后8 h達到最大，在24 h為最小；莖中處理后4 h達到最大。干旱脅迫下，根、莖、葉中的表達量均在處理2 h達到最大，隨著脅迫時間的延長，表達量總體呈先增大后減小的趨勢。SlbHLH077基因在不同非生物脅迫的不同組織中具有不同的表達模式，說明該基因在非生物脅迫以及番茄不同組織中發(fā)揮著不同的功能。此外，在茉莉酸甲酯處理后，該基因的相對表達量在葉中發(fā)生了顯著變化，在處理后8 h達到最大，其相對表達量達到10（圖9）。

2.2.10 接種黃花卷葉病后SlbHLH077基因的表達。從圖10可見，在接種20 d時，該基因的相對表達量最低，為0.624，在接種30 d時，其相對表達量最高，為0.906。在接種病毒后該基因的表達均低于接種病毒前，因此該基因在番茄抗黃葉卷曲病中可能起負調控作用。

2.3 啟動子元件分析

為進一步研究SlbHLH077基因的結構與功能，選取SlbHLH077基因上游2 000 bp序列進行啟動子分析，同時通過在線數據庫PlantCARE進行順勢作用元件功能預測，筆者發(fā)現了13個特異的響應元件，包括組織特異表達元件（GCN4-motif與CAT-box）、壓力響應元件（TC-rich repeats，ARE與MBS）、植物激素響應元件（TCA-element，TGA-element與P-box）以及光響應元件（AE-box，TCCC-motif，GATA-motif，GT1-motif與TCT-motif）（表2）。

3 討論

在自然界中，植物的生長發(fā)育和作物生產力不可避免地受到許多非生物脅迫的影響，如干旱脅迫［29］。為了生存，植物已經進化出多種機制來應對干旱脅迫［30］。在眾多與脅迫相關的基因中，植物在干旱、低溫脅迫下對轉錄因子基因進行了調控，以幫助植物維持正常的生長發(fā)育［29］。bHLH轉錄因子是植物中TF的第二大亞家族，通過與目標基因啟動子區(qū)域的G-box/E-box結合而參與各種生物過程，包括干旱脅迫反應［31］。已顯示bHLH轉錄因子在植物生長和發(fā)育以及應對生物與非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［4］。 例如，OrbHlH2過度表達擬南芥增加了對鹽壓力的耐受性［23］。與野生植物相比，通過NaCl應激強烈誘導AtBHLH122基因，并且過表達AtBHLH122的轉基因植物對NaCl應激的耐受性造成更大的抗性［16］。小麥BHLH轉錄因子HLH39是通過鹽處理及改善的小麥鹽脅迫耐受性［25］。因此，對家族基因綜合研究將大大促進對植物生長和發(fā)育，以及對次生新陳代謝和植物對生物和非生物脅迫反映的全面了解。

據報道，只有少數番茄bHLH基因在干旱脅迫耐受性中起重要作用。該研究中，筆者鑒定并分析了番茄bHLH轉錄因子SlbHLH077，其保守結構顯示，該基因含有1個基本區(qū)域和1個HLH結構域，屬于典型的bHLH轉錄因子。軟件預測顯示SlbHLH077基因位于細胞核中，因此，具有很強的轉錄活性，這與轉錄因子在細胞核中發(fā)揮作用的研究結果一致［32］。該基因編碼蛋白具有74個磷酸化位點，多個磷酸化位點可能在激活蛋白活力方面有重要作用［33］。 蛋白互作表明，該基因在擬南芥的同源基因與10個JAZ家族基因間接或直接相互作用，該家族基因主要參與茉莉酸介導的反應。其中，TIFY類基因（TIFY10B、JAZ家族基因）在多個物種中強烈響應植物激素（茉莉酸甲酯）和鹽、低溫與干旱等非生物脅迫，同時在調節(jié)植物莖、葉和花的發(fā)育中起著關鍵作用［34］，且能被MYC家族（MYC2，MYC3和MYC4）基因激活，有趣的是SlbHLH077基因的三級結構與MYC2的相似度高達80%，因此SlbHLH077在番茄中可能具有類似的功能。此外，研究表明JAZ蛋白（JAZ1-JAZ12）能夠與不同類型的轉錄因子結合，將茉莉酸信號通路與其他多種信號通路聯系起來，從而在植物的生長發(fā)育、激素應答、脅迫響應等方面發(fā)揮作用［34］。MYC2作為JA應答基因的起始轉錄因子，會被JAZ蛋白結合，同時吸引NINJA和TPL這些共阻遏物來共同抑制JA應答基因的轉錄，導致植物難以進行JA應答反應，而該研究蛋白互作網絡表明MYC2的同源基因SlbHLH077與10個JAZ蛋白間存在相互調節(jié)作用。該研究的表達分析也證明該基因響應低溫、干旱、鹽和激素等多種脅迫。

組織特異性表達分析表明，SlbHLH077基因在各種組織中表達，在番茄莖、葉、根和花中都可檢測到SlbHLH077（MYC2的同源基因）基因的表達，且在根與花蕾中的表達量最高，在果實成熟后期表達水平較低，表明該基因可能調節(jié)植物的生長發(fā)育，研究表明MYC2轉錄因子參與葉片和花的發(fā)育過程，調控果實的成熟［35］，進一步證實了該基因在植物生長發(fā)育中的作用。此外，bHLH家族基因在應對非生物脅迫及生物脅迫中起著重要作用［36］。如，PtrbHLH基因在各種脅迫下，特別是在寒冷脅迫下被上調［37］ 。OrbHLH2基因在鹽和滲透脅迫后表達量上調，但在冷脅迫后表達量不上調［23］。

研究表明，通過脫水處理誘導了MdbHLH130轉錄水平，表明其可能在調節(jié)水分脅迫的響應中發(fā)揮作用。bHLH 轉錄因子參與多個過程，包括氣孔發(fā)育，根毛形成，根分生組織大小及響應干旱脅迫的激素代謝［18-19，38］。據報道，某些bHLH基因是對干旱脅迫的響應而誘導的，而干旱脅迫取決于ABA介導的途徑。如，AtMYC2在ABA介導的干旱脅迫信號傳導途徑中起著轉錄激活劑的作用［18］。bHLH122基因的過表達通過增加細胞中的ABA水平來提高轉基因植物對干旱和滲透脅迫的抗性［16］。該研究中，觀察到在干旱、鹽和低溫處理后該基因的表達在不同組織中發(fā)生了顯著變化，說明該基因可能參與這些非生物脅迫。近期研究表明，BcMYC2受JA信號調節(jié)，外源MeJA誘導可提高其基因表達量［39］，該研究發(fā)現SlbHLH077（MYC2的同源基因）的表達量在MeJA處理后葉中呈現高度表達的形式，與BcMYC2的研究一致。此外，研究發(fā)現該bHLH家族基因還介導番茄抗黃葉卷曲病［25］，且SlbHLH077基因在其中起著負調控作用。該研究在接種黃葉卷曲病毒后該基因表達量低于對照，這與前者報道一致，說明該基因可能通過負調控的形式介導番茄對黃葉卷曲病毒的抗性。

4 結論

該研究在番茄中克隆了SlbHLH077基因，分析表明該基因全長2 566 bp，CDS全長1 739 bp，編碼539個氨基酸，且編碼蛋白屬于不穩(wěn)定性的堿性蛋白。亞細胞定位顯示其在細胞核中，且含多個磷酸化和糖基化位點，二級結構以無規(guī)則卷曲為主。該基因含有典型HLH結構域，并與多個基因直接作用而發(fā)揮作用。系統發(fā)育表明，番茄SlbHLH077與馬鈴薯、辣椒等茄科作物的親緣關系較近，與杜鵑、茶和中華獼猴桃等植物的親緣關系較遠。表達分析顯示，該基因在番茄各組織中均有表達，說明該基因在番茄生長發(fā)育中起著關鍵作用。此外，該基因在響應低溫、鹽和干旱非生物脅迫以及激素（茉莉酸甲酯）中起著正調控作用，而在抵御番茄抗黃葉卷曲病中起著負調控的作用。該研究結果為番茄抗逆育種提供了參考依據，尤其是為目前亟待解決的番茄抗黃葉卷曲病育種提供了可行的思路。

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基金項目 武漢軟件工程職業(yè)學院（武漢開放大學）高層次人才科研啟動經費項目（KYQDJF2023020）；湖北省教育廳科研計劃項目（B2023533）。

作者簡介 王文婷（1985—），女，陜西寶雞人，工程師，博士，從事生物化學和煙草化學研究。*通信作者，副教授，從事生物學分析研究。

收稿日期 2024-05-24；修回日期 2024-12-26