番茄青枯病拮抗菌的篩選鑒定及其復配能力研究

摘要 ［目的］篩選出具有廣譜抗性的生防細菌，并找到彼此間無抗性且提高番茄青枯病防效的復配菌株。［方法］使用抑菌圈法、瓊脂擴散法從湖南長沙青枯病發(fā)病田的健康番茄植株莖基部篩選出對青枯雷爾氏菌具有拮抗能力的菌株，通過形態(tài)學觀察、16S rRNA基因測序、系統(tǒng)發(fā)育分析確定其分類地位；以胞外產(chǎn)酶能力測定和抑菌譜測定探究生防菌株的更多功能。［結果］從篩選出的16株具有拮抗能力的菌株中確定了2株生防細菌具有高效的拮抗能力且在復配能力探究中表現(xiàn)出無相異性，篩選到的TB-5被初步鑒定為莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis），其對番茄青枯病的抑菌圈大小為21.7 mm；篩選到的XL-7被初步鑒定為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis），其對番茄青枯病的抑菌圈大小為236 mm；菌株TB-5和XL-7均具有不同程度地產(chǎn)蛋白酶和鐵載體能力；且在抑菌圈試驗中均表現(xiàn)出對疫霉病菌、辣椒白絹病菌、煙草赤星病菌、白菜黑斑病菌、辣椒炭疽病菌和柑橘沙皮病菌有抗性；并在兩菌株復配后將發(fā)酵液的抑菌圈直徑擴大為27.0 mm，發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑也達24.5 mm。［結論］ 通過對菌株TB-5、XL-7的胞外產(chǎn)酶能力以及抑菌譜測定包括復配能力探究，大大加強了傳統(tǒng)的單一生防菌防效不穩(wěn)定的問題，更具有生防潛力。

關鍵詞 番茄青枯??；拮抗細菌；復配；產(chǎn)酶能力；抑菌譜

中圖分類號 S436.412.1+5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2025）06-0133-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.06.030

Screening and Identification of Antagonistic Bacteria Against Tomato Bacterial Wilt and Its Compounding Ability

TAN Ze-bao， HUAN Bao-lin， XIAO Qin" et al

（College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha，Hunan" 410128）

Abstract ［Objective］ To screen out the biocontrol bacteria with broad spectrum resistance， and find the hybrid strains that have no resistance to each other and amplify the control effect of tomato bacterial wilt. ［Method］ Strains with antagonistic ability to Rella soleculosa were selected from the stem base of healthy tomato plants in Changsha， Hunan Province by using inhibition zone method and AGAR diffusion method， and their classification status was determined by morphological observation， 16S rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis. More functions of biocontrol strains were explored by the determination of extracellular enzyme production capacity and bacteriostatic spectrum. ［Result］ From the 16 strains with antagonistic ability， two strains of biocontrol bacteria were identified as having high antagonistic ability and showed no difference in combination ability. The screened TB-5 was preliminatively identified as Bacillus mojavensis， and its inhibitory zone size against tomato bacterial wilt was 21.7 mm. XL-7 was identified as Bacillus siamensis， and its inhibitory zone size against tomato bacterial wilt was 23.6 mm. Strains TB-5 and XL-7 had different ability to produce protease and ferriferous carrier. They showed resistance to Phytophthora， Sclerotium rolfsii， Alternaria alternata， cabbage black spot， Colletotrichum capsici and Sarcophora citri. After the combination of the two strains， the diameter of the inhibition zone of the fermentation liquid was enlarged to 27.0 mm， and the diameter of the inhibition zone of the fermentation supernatant reached 24.5 mm. ［Conclusion］ Through the investigation of the extracellular enzyme production ability and antibacterial spectrum determination including the combination ability of strains TB-5 and XL-7， the problem of unstable control effect of traditional single biocontrol bacteria has been greatly strengthened， and the potential of biocontrol has been increased.

Key words Tomato bacterial wilt;Antagonistic bacteria;Compounding;Enzyme production ability;Bacteriostatic spectrum

番茄青枯病又名細菌性枯萎病，是茄科蔬菜的重要病害之一，主要危害番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科蔬菜和生姜、花生、玉米等作物［1-6］。在番茄生產(chǎn)上的危害極其嚴重，目前尚無有效的防治方法能夠綠色高效地防治番茄青枯病。

傳統(tǒng)的防治手段包括選育抗性品種、化學防治、嫁接苗改良、土壤改良和代謝產(chǎn)物抗病［7］，當前，化學藥劑對病原菌的抑制效果較好，但對環(huán)境污染嚴重，長期大量使用會造成土壤肥力降低、酸堿變化、土壤板結［8］。黎起秦等［9］研究表明內(nèi)生細菌B47對番茄青枯病的防效達79.79%；徐玲等［10］研究表明多粘類芽孢桿菌HY96-2對番茄青枯病的防效在69.7%～81.8%。但邱清華［11］研究表明兩菌劑復配的防治效果明顯優(yōu)于單一生防菌劑；生物防治也因其單菌防效不穩(wěn)定、無法成功定殖等缺點而受到一定的挑戰(zhàn)。

在單一生防菌劑的基礎上，陸續(xù)誕生了菌菌復配［12］、菌藥復配［13］、菌肥復配［14］、菌-植物源提取物復配［15］等新型的高效生防模式，生防菌間復配的研究在單一生防菌的基礎上提供了更高的穩(wěn)定性，利用生防菌在土壤中占據(jù)病原菌的生態(tài)位，解析其生防機制后，更好更高效更大面積地發(fā)揮其控病、增產(chǎn)的能力。其中芽孢桿菌屬包含多種植物病原物的拮抗菌，廣泛地應用于植物病害防治［16］。

筆者從湖南長沙高橋鎮(zhèn)一塊高發(fā)青枯病的田塊內(nèi)挑取一顆健康的番茄植株莖基部進行拮抗細菌篩選，鑒定到9株對青枯雷爾氏菌有明顯防效的菌株，并通過復配試驗進一步篩選出菌株TB-5和XL-7，對兩菌株進行形態(tài)學觀察、16S rRNA基因測序、青枯菌拮抗能力測定、胞外產(chǎn)酶能力測定、抑菌譜能力測定和復配親和性以及復配后的防效，驗證復配菌株對番茄青枯病防效的提升，以期為番茄青枯病的生物防治提供更多的資源，為后續(xù)更復雜的發(fā)病田塊提供治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

從湖南省長沙市高橋鎮(zhèn)青枯病高發(fā)病田的一株健康番茄植株莖基部分離的內(nèi)生菌。

青枯雷爾氏菌RS04菌株來自實驗室保存菌株，轉(zhuǎn)接活化后以青枯病特異性引物pehA#3/6（5′-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3′/5′-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3′）進行 PCR 擴增鑒定，初步確定青枯雷爾氏菌RS04的致病性［17］。

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，自然pH，121 ℃、20 min滅菌；LB固體培養(yǎng)基在此基礎上加18～20 g瓊脂。PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切碎煮沸30 min，過濾后加入20 g葡萄糖，定容至1 L，自然pH，115 ℃、20 min滅菌；PDA固體培養(yǎng)基需在原PDA培養(yǎng)基的基礎上加入15～20 g瓊脂。

產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基：酪蛋白20 g，瓊脂粉18 g，超純水1 L，自然pH，121 ℃、15 min滅菌備用；產(chǎn)磷酸酶培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，磷酸鈣5.00 g，硫酸銨0.50 g，酵母提取物0.50 g，氯化鈉0.30 g，氯化鉀0.30 g，硫酸鎂0.30 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，瓊脂粉15.00～20.00 g，121 ℃、15 min滅菌備用；產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g，羧甲基纖維素鈉10.00 g，氯化鈉5.00 g，牛肉膏3.00 g，剛果紅0.04 g，瓊脂粉15.00～18.00 g，超純水1 L，自然pH，121 ℃、15 min滅菌備用。

產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基：鉻天青S（CAS）0.060 g，十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）0.073 g，1 mmol/L六水氯化鐵10 mL，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液50 mL，瓊脂粉9.000 g，超純水定容至1 L，121 ℃、15 min滅菌備用［18］。

1.2 拮抗細菌的篩選與鑒定

1.2.1 細菌菌株的分離。

選取健康植株的莖基部，對其進行表面滅菌處理，將其置于無菌50 mL離心管中，加入滅菌的超純水浸沒樣本，使用無菌鑷子或夾子將植株的表土從莖基部分離，后將洗滌后的莖基部置于15 mL無菌離心管內(nèi)，超聲儀超聲3次30 s；把處理好的莖基部樣本置于研磨缽中，依次加入無菌水至5 mL，充分研磨收取上清液保存為原液。再通過梯度稀釋涂布法，對原液進行分離涂布，28 ℃培養(yǎng)2 d后將所得到的單菌落劃線純化。

1.2.2 拮抗細菌的篩選。

以抑菌圈法進行菌株的初篩，將純化后的各菌株轉(zhuǎn)接后均以28 ℃、160 r/min搖床富集24 h，調(diào)整各菌液的OD600為1。將青枯菌RS04接種至LB培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液的OD600為1備用。將LB固體培養(yǎng)基置于微波爐加熱溶解，待其冷卻至45～50 ℃時，加入備用的RS04菌液，每200 mL培養(yǎng)基加入2 mL RS04菌液混勻后倒平板（培養(yǎng)皿直徑90 mm），待培養(yǎng)皿徹底凝固后，使用牛津杯法對培養(yǎng)基進行打孔，再將對應的各菌株分別接種至孔內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d觀察反應，測定其有無抑菌圈產(chǎn)生。

1.2.3 拮抗細菌的鑒定。

形態(tài)學觀察參照《伯杰細菌鑒定手冊》［19］和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［20］判定，將篩選到的拮抗細菌在LB平板上劃線和點，28 ℃、24 h培養(yǎng)，觀察菌體顏色、大小以及形態(tài)特征。

以細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增其16S rRNA基因；PCR 反應體系（25 μL）：DNA模板 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。16S rRNA 基因的 PCR 反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；將PCR產(chǎn)物交至湖南擎科生物科技有限公司進行一代測序鑒定，將所得序列提交至EZBioCloud（https：∥www.ezbiocloud.net/）網(wǎng)站進行序列比對，使用MEGA 5.1進行Neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 拮抗細菌的胞外產(chǎn)酶能力測定

將篩選到的菌株接種到對應的測定培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h。對于產(chǎn)蛋白酶、磷酸酶、纖維素酶的測試，若菌落周圍出現(xiàn)透明圈則記為陽性，無透明圈則記為陰性；對于產(chǎn)鐵載體的測試，在原有培養(yǎng)基的基礎上配制檢測溶液，倒入檢測溶液后若有黃色圈出現(xiàn)則為陽性，若無則為陰性。

鐵載體檢測溶液配方：溶液1，0.08 g CAS融于50 mL超純水中，再加入10 mL 1 mmol/L的氯化鐵溶液；溶液2，0.07 g十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）融于40 mL超純水中；在此基礎上，溶液1倒入溶液2混勻即為CAS藍色檢測液。

1.4 拮抗細菌的抑菌譜測定

在拮抗細菌對于細菌病害抑制的基礎上，研究其對常見茄科真菌病害（Phytophthora capsici Leonian）等的抑制作用［21］；通過把實驗室保有的病原真菌進行活化后，將這類病原真菌菌餅置于PDA平板一側(cè)，待其在28 ℃培養(yǎng)24 h后接種拮抗細菌于另一側(cè)，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察其抑菌效果。

1.5 拮抗細菌的復配能力

1.5.1 拮抗細菌的親和力測定［22］。

將前期分離到的有較好拮抗效果的9株菌分別接種于LB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h后使用“涂＋點”法進行親和性篩選，先將待測菌液OD600值都調(diào)為1，再按照對應的組合順序先進行涂布，待第一層200 μL菌液涂滿涂干之后再在其上點上10 μL的對應菌液，28 ℃培養(yǎng)48 h以觀測2株菌株之間有無拮抗作用的產(chǎn)生。

1.5.2 拮抗細菌的復配效果復篩。

在親和性測定試驗結果上挑取菌株TB-4、TB-5、XL-7和XL-8進行復配組合的復篩，28 ℃培養(yǎng)48 h后仍使用“涂+點”法進行親和性復篩，先將待測菌液OD600都調(diào)為2，再按照對應的組合順序先進行涂布，待第一層200 μL菌液涂滿涂干之后再在其上點上10 μL的對應菌液，28 ℃培養(yǎng)48 h以觀察復篩組合的菌株之間有無拮抗作用的產(chǎn)生。

1.5.3 復配拮抗細菌不同比例對番茄青枯菌的防治效果［23］。

復篩結果后針對菌株TB-5和XL-7進行不同濃度的復配比例篩選，以期達到最優(yōu)的防治效果（表1）；把待測單菌株均先轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h達到OD600值為1用作種子液，針對不同復配比例組合再將種子液轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h制成復配菌液，調(diào)整OD600為2；采用抑菌圈法制作含有番茄青枯菌的LB固體平板，打孔備用；接種復配菌液于RS04的青枯菌平板內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)48 h觀測抑菌圈的大小。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Excel 2010進行，建樹軟件使用Mega 5.1進行繪制。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的分離篩選結果

經(jīng)過分離與篩選，共獲得16株對番茄青枯菌有拮抗作用的細菌，其中9株對番茄青枯菌的拮抗效果最好，在相容性測定后選定莫海威芽孢桿菌TB-5和暹羅芽孢桿菌XL-7為試驗菌株，其抑菌圈直徑分別達21.7和23.6 mm（圖1）；其中莫海威芽孢桿菌TB-5在LB培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)48 h后，單菌落直徑為1～2 mm，菌落呈淡黃色，邊緣不規(guī)則，革蘭氏陰性菌；而暹羅芽孢桿菌XL-7在LB培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)48 h后，單菌落直徑為1～3 mm，菌落呈黃色，有褶皺，邊緣也不規(guī)則，革蘭氏陰性菌。

2.2 菌株TB-5、XL-7的鑒定

根據(jù)測序結果可知，菌株TB-5和XL-7的16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物長度分別為1 478和1 453 bp，在EZBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）網(wǎng)站中進行16S-based ID比對結果顯示，菌株TB-5與Bacillus mojavensis strain RHPR20（MH211387.1：24-1501）、Bacillus velezensis strain WGB8（OK189547.1）等多種芽孢桿菌屬菌株的16S rRNA基因相似度為100%；菌株XL-7與Bacillus siamensis strain cqsM9（MN826567.1：30-1482）、Bacillus subtilis strain B1（KU556155.1）等種芽孢桿菌屬菌株的16S rRNA基因相似度為99.93%，在此基礎上構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，菌株TB-5與莫海威芽孢桿菌處于同一分支（圖2）；菌株XL-7與暹羅芽孢桿菌處于同一分支（圖3）；根據(jù)序列比對結果、形態(tài)學觀察初步鑒定菌株TB-5為莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis），菌株XL-7為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。

2.3 菌株TB-5、XL-7的胞外產(chǎn)酶能力

經(jīng)蛋白酶、磷酸酶、纖維素酶和鐵載體4種鑒定培養(yǎng)基測定后，結果見圖4。菌株TB-5對于蛋白酶能形成4～6 mm的抑菌圈，對于產(chǎn)鐵載體能形成20.8 mm的抑菌圈，效果顯著；而對于磷酸酶和纖維素酶菌株TB-5均表現(xiàn)為陰性，對2種胞外酶不敏感。菌株XL-7的胞外產(chǎn)酶能力明顯強于菌株TB-5，其對蛋白酶的抑菌圈直徑為6～9 mm，對磷酸酶的抑菌圈直徑為1～2 mm，對纖維素酶的抑菌圈直徑為8.0～11.2 mm，同樣對產(chǎn)鐵載體極其敏感，抑菌圈直徑為19.8～20.3 mm。表明這些酶的釋放能夠驅(qū)使拮抗細菌與其他土著微生物競爭資源，這也可能是莫海威芽孢桿菌TB-5和暹羅芽孢桿菌XL-7抑制土壤病害的原因。

2.4 菌株TB-5、XL-7的抑菌譜

莫海威芽孢桿菌TB-5的抑菌譜測定結果見圖5，其對茄科病害具有較廣的抗病能力，對疫霉病菌的拮抗能力較強，對其他茄科植物病害也有一定的抗性，但對茄科植物外的其他病害如柑橘沙皮病菌不起作用。暹羅芽孢桿菌XL-7的抑菌譜測定結果見圖6，其也對茄科病害具有較廣的抗病能力，對疫霉病菌和白絹病菌的拮抗能力較強，對其他茄科植物病害也有一定的抗性，但同時也對茄科植物外的其他病害如柑橘沙皮病菌不起作用。說明菌株TB-5和XL-7都在茄科植物抗病上具有一定的作用。

2.5 菌株TB-5、XL-7的復配

2.5.1 生防菌株復配拮抗性的初篩結果。

通過對菌株親和性的初篩，發(fā)現(xiàn)菌株TB-4、TB-5、XL-7和XL-8彼此間不存在拮抗作用（表2），在此基礎上繼續(xù)對菌株進行復篩。

2.5.2 生防菌株復配拮抗性的復篩結果。

經(jīng)過初篩結果，選定菌株TB-4、TB-5、XL-7和XL-8進行復篩試驗，結果見表3。菌株TB-5和XL-7是相容性更好的菌株，因此選擇這2株菌復配進行后續(xù)試驗。

2.5.3 生防菌株的復配比例篩選結果。

經(jīng)過初篩和復篩后選定莫海威芽孢桿菌TB-5和暹羅芽孢桿菌XL-7對其進行復配比例篩選后，進行番茄青枯菌抑菌圈試驗，結果見表4。由表4可知，TB-5與XL-7的培養(yǎng)比例為1∶2時，其抑菌效果最佳，發(fā)酵原液的抑菌圈直徑達（27.0±1.0）mm，發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑也達（24.5±2.0）mm。

3 結論與討論

研究表明，生防制劑的復配往往比一種生防制劑的單一使用效果要好，生防細菌可以與細菌、放線菌、真菌、農(nóng)藥、化肥和植物源提取物進行復配，也可與次生代謝產(chǎn)物進行復配，多個生物因子復配構成的多功能防治系統(tǒng)可以提高生防效果和穩(wěn)定性。Baloyi等［24］研究表明，采用蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）和粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）復配的方法防治線蟲比單個菌株防效更好。但并非所有的復配都能增效，Stockwell等［25］將熒光假單孢菌（P.fiuorescens A506）和泛生菌（Pantoea vagans C9-1）復配后對歐文氏菌（Ervinia amylovora）引起的病害的防治效果更低，其原因可能是生防菌防控的作用機制不同，使復配菌株在相互作用中發(fā)生不兼容現(xiàn)象。

該試驗對篩選到的莫海威芽孢桿菌TB-5和暹羅芽孢桿菌XL-7進行了復配能力篩選、復配比例優(yōu)化，復配菌株的發(fā)酵液對番茄青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑達（27.0±1.0）mm，比兩單菌的抑菌圈直徑大2～5 mm，可見其復配后能起到明顯的拮抗效果；且對2個單菌的胞外產(chǎn)物和抑菌譜進行了測定，在更大程度上對菌株的抗病能力提供了穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)，在環(huán)境友好、無其他病原菌浸染的條件下，復配細菌的定殖能力以及拮抗效果得到了進一步的保證，并在一定程度上解析了菌株TB-5和XL-7的抗病機制。

在實際田間大棚番茄種植中，高溫高濕強降雨排水不暢是引起病害發(fā)生的主要因素，在抗病的同時又達到豐產(chǎn)的目的，在此基礎上，一些生防菌與生物肥料混配使用來提高防效和促生能力，菌株TB-5和XL-7表現(xiàn)出與羊肚菌菌渣有天然的相容性，在后續(xù)的生防試驗中將復配菌株與菌渣復配，在保證防效的情況下進一步提高番茄高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。

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作者簡介 譚澤寶（2000—），男，湖南郴州人，碩士研究生，研究方向：微生物學、番茄青枯病。

*通信作者，講師，博士，碩士生導師，從事植物病理學、微生物學及微生物與抗藥性相關性研究。

收稿日期 2024-01-29